MEMBRANAS

Extracción e identificación de componentes de

membrana y electrofisiología

Mario Villamizar
Santiago Santos
Rubén Guzman
Lukas Rey

Grupo 7

1
 Purificación de
membranas:
01 Proteínas

2
 Identificación de
proteínas

● Caracterización y clasificación de alguna

proteína específica dentro de una muestra
de membrana o proveniente de ella

● Puede ser un proceso intrusivo extracción

por disolución de la membrana o no
intrusivo (observación in vivo o in vitro de la
proteína anclada a membrana)

3
 Métodos 02
Bioinformáticos
01 Pipeline
MemProtMD
Identifica
dominios de
Algoritmo TMDET plegamiento en
hélices alfa y
Detecta proteínas
formación de
transmembrana
barriles beta
según su estructura
tridimensional,
arrojando la
composición a.a. De
sus dominios

4 (Molodensky, 2020)
 Identificación por fenómenos de fluorescencia

Tirosina, fenilalanina y Sondas biarsénicas,

triptófano etiquetas de histidina, o
etiquetas FLAG
Fluorescencia natural
Marcación con flouróforos

5 (Trialtus Bioscience, 2020)

 Principios y objetivos

● ¿Qué es una purificación? Eliminar

“contaminantes” o sustancias que no
pertenecen a un componente específico

● ¿Cómo así purificar proteínas?

Extraerlas de su ambiente de membrana
para aislarlas y estudiarlas como unidad.

6
 DEBE TENERSE EN CUENTA…
Interacciones con la
Tipo de proteína membrana Estructura y función
Periféricas o Mayor o menor Canales transportadores, receptores de
Transmembranales hidrofobicidad membrana, acopladores intercelulares,
composición aminoacídica (...)

1 2 3

7
 Fraccionamiento Subcelular
Ej: Identificación de proteínas de cubierta y de membrana en merozoitos de p. Falciparum (Rivadeneira, 1987)

Homogeneización Uso de HBS

Fragmentación y lisis HEPES 20 mM, pH
de células 7.4, NaCl 160 mM

Uso de PMSF y TPCK Centrifugación

Separación total y
Soluciones de desprendimiento de
inhibidores de proteìnas de
proteasas membrana (Rivadeneira et al., 1987)

8 (sobrenadante)
 Absorción
por CCSM
(Cationic Colloidal Silica
Microbeads)

(Kim et al., 2011)

● Uso de microperlas de sílice coloidal cationizadas

para asegurar la estructura de las proteínas de
membrana
9
(Ídem)
 Separación en fase por Triton X-114

Detergente no iónico con p.

Condensación de 23ªC

● Ideal para la solubilización de

proteínas y disgregación de la
membrana
● Se forma un gradiente de fases
entre proteínas solubles,
solubilizadas por detergente e (Godding, 1996)

insolubles en Triton X-114

10
 Purificación His-Tagged

ADN Afinidad iones metálicos

Se modifica la secuencia Iones como Niquel y
añadiendo bp otros divalentes
codificantes para interactúan con agentes
histidina polimérica quelantes

IMAC
(Cromatografía de afinidad sobre iones metálicos inmovilizados)
Residuos aminoacídicos de histidina se desplazan por
fuerza electrostática entre el metal quelado

11
 Electroforesis en dos
dimensiones
SDS-PAGE
Se solubilizan y desaturalizan las proteínas con SDS
(Dodecilsulfato sódico), formando un complejo de
carga parcial (-)

● Migración según peso molecular (medio

poliacrilamida)

(The Art of MBoC3, 1995)

Isoelectroenfoque (IEF)
Depende del punto isoeléctrico, que
reacciona al gradiente inmovil de pH
(Marella, 2018)
del medio.
12
 Purificación de
membranas:
02 Lípidos

13
 Obtención y preparación de las
muestras

● Evitar la oxidación
● Extracción rápida
● Mantener en frío y
conservar congelado
● Uso de disolventes
orgánicos
● Antioxidantes
● Uso de alcohol

14 Roca, P., Oliver, J. & Rodríguez Ana M. (2003) Bioquímica: Técnicas y métodos.
Madrid: Hélice.
 Métodos de extracción de
lípidos
Extracción Soxhlet Folch Microondas

Herrera, E., Ramos, M. D. P., Roca, P., Viana, M., Castillón, E. H., Álvarez, M. D. P. R., Salom, P. R.,

& Arribas, V. M. M. (2014). Bioquímica básica: Base molecular de los procesos

fisiológicos. Elsevier.

15
 Método de separación
Cromatografía de placa o columna

● Se basa en la
solubilidad y carga
de las moléculas
● Dependiendo de la
velocidad, se forman
diferentes bandas
Herrera, E., Ramos, M. D. P., Roca, P., Viana, M., Castillón, E. H., Álvarez, M. D. P. R., Salom, P. R.,

& Arribas, V. M. M. (2014). Bioquímica básica: Base molecular de los procesos

fisiológicos. Elsevier.

16
 Método de análisis
Determinación de glicerol

17 Roca, P., Oliver, J. & Rodríguez Ana M. (2003) Bioquímica: Técnicas y métodos.
Madrid: Hélice.
 Método de análisis
Determinación de Triacilglicerol

18 Roca, P., Oliver, J. & Rodríguez Ana M. (2003) Bioquímica: Técnicas y métodos.
Madrid: Hélice.
 Método de análisis
Determinación de Ácidos grasos libres

19 Roca, P., Oliver, J. & Rodríguez Ana M. (2003) Bioquímica: Técnicas y métodos.
Madrid: Hélice.
 Método de análisis
Determinación de Colesterol

● El colesterol puede estar

en forma libre o
esterificada
● Uso de digitonina para
separar libre del
esterificado

20 Roca, P., Oliver, J. & Rodríguez Ana M. (2003) Bioquímica: Técnicas y métodos.
Madrid: Hélice.
 Electrofisiología
(patch clamp) 03

21
 Electrofisiología

Campo que estudia las variaciones

de corriente y voltaje a través de la
membrana celular. Tiene
aplicaciones en la neurociencia y
fisiología:
-Comportamiento de los canales
iónicos.
-Cambios de potencial a nivel
celular.
-Potencial a nivel de tejido.
(Molecular devices 2021)
22
 NECESIDADES O PROBLEMAS
RESUELTOS POR ELECTROFISIOLOGÍA
Los canales iónicos están
involucrados en enfermedades Estudio de zonas de
como: hipertensión, arritmias, lesiones y determinación
trastornos neurovasculares e de posibles pérdidas de
inmunes, cáncer… función

Investigación de enfermedades Fisiología de las lesiones

Reacción fisiológica Caracterización de organismos

de muestras en modelo para el estudio de
respuesta a fármacos enfermedades específicas

Estudios farmacológicos Organismos modelo

23 (Rodriguez Moreno, 2023)
 Patch clamp
Es una técnica empleada para el estudio
electrofisiológico de canales iónicos, midiendo su
corriente eléctrica.

Aislamiento de membranas con micropipetas.

Control de voltaje.

Diversidad de configuraciones y aplicaciones.

24
 Patch clamp
Se emplean pipetas para succionar las células,
creando un sello hermético denominado gigaseal.

Montaje:
Borosilicato / Cuarzo. 1-5 µm.
Micropipeta.
Administración de sustancias.
Jaula de Faraday. Aislamiento de corriente externa.
Electrodos. Ag/AgCl - Polo a tierra - Registro
Cámara de baño. Ambiente extracelular

Microscopio invertido. Observación de las células.

25 Conforti, L. (2012). Patch-Clamp Techniques. Cell Physiology
 Configuraciones
de patch-clamp

26
 Metodología de Patch clamp
Sello hermético entre la pipeta y una célula intacta.

Formación del gigaseal:

1. Pipeta con pulso de bajo voltaje se acerca a la célula.

2. Aumento de la resistencia al tocar la membrana
plasmática.
3. Succión para cerrar el sello hermético y tener una alta
resolución en las lecturas.
Monitoreo en todo momento de resistencia, voltaje y
corriente (Ley de Ohm)

Permite medir la corriente del canal iónico presente en la pipeta

en un momento dado.

A partir de esta configuración se derivan el resto haciendo uso

de distintas técnicas.
27 Conforti, L. (2012). Patch-Clamp Techniques. Cell Physiology
 Metodología de Patch clamp
Ruptura de la membrana por succión - Continuidad
entre la solución de la pipeta y el citoplasma
(Diálisis).

Ventajas Desventajas

Control de Dilución del citoplasma.

concentración iónica
intracelular. Alteraciones en la
respuesta de segundos
Administración de mensajeros
péptidos al interior de intracelulares solubles y
la célula. gradiente iónico.

Permite medir la corriente de membrana total en

múltiples canales simultáneamente.

28 Conforti, L. (2012). Patch-Clamp Techniques. Cell Physiology

 Metodología de Patch clamp
Ruptura de la membrana por succión.

Formación de poros por la acción de antibióticos.

Anfotericina B
Nistatina

Ventajas Desventajas

Administración de iones Reducción en el control

al interior de la célula. del voltaje.

Moléculas grandes no
Reducción de diálisis. atraviesan los poros.

Permite medir la corriente de membrana total en

múltiples canales simultáneamente.

29 Conforti, L. (2012). Patch-Clamp Techniques. Cell Physiology

 Metodología de Patch clamp
Ruptura del gigaseal por succión - Formación de la
configuración whole-cell.

La membrana se pliega sobre sí misma con la sección

extracelular hacia la cámara de baño.

Ventajas Desventajas

Control de ambiente Configuración difícil de

extracelular (cámara de lograr dado que se debe
baño) e intracelular separar lentamente para
(solución de la pipeta). que se dé el plegamiento.

30 Conforti, L. (2012). Patch-Clamp Techniques. Cell Physiology

 Metodología de Patch clamp

Separación mecánica de una sección de la

membrana, formando una vesícula.

La exposición al aire destruye la vesícula dejando el

ambiente intracelular expuesto.

Permite alterar las condiciones del lado

citoplasmático de la membrana.

Ideal para estudios de la señalización de canales.

31 Conforti, L. (2012). Patch-Clamp Techniques. Cell Physiology

 Elección de soluciones y micropipetas
La composición de una solución depende de la
metodología a usar

Solución hipertónica 2-4M

Para electrodos que deben penetrar la

membrana

Reducen la resistencia de electrodos y el flujo de Puede generar una carga hiperosmótica que
corriente de rectificación. Provee mayor ancho de hinchará la célula y afectara su contenido de
banda de grabación. aniones y cationes

Niega el potencial de unión líquida, evita Se puede contrarrestar usando una pipeta de
mediciones erróneas por membranas polarizadas menor diámetro pero se reduce el ancho de banda

En mediciones de corriente continua es

importante por la movilidad desigual de
aniones y cationes en la célula.
32 (Molecular devices 2021)
 Elección de soluciones y micropipetas
Soluciones Isoosmóticas

Para métodos “patch”

Se debe tener en cuidado de no producir un

Permite un anchor de pipeta mucho más alto
potencial de unión por elección de materiales

Sucede al momento en que la pipeta está

No hay peligro de modificar el equilibrio osmótico sumergida en el baño y se modifica con el sello
hermético

33 (Molecular devices 2021)

 Ejemplo de estudio de
ovocito de Xenopus
➢ Análisis de canales mutados para
entender mejor la función y estructura.
➢ Estudios de procesamiento
post-transduccionales y ensamblaje de
canales iónicos de múltiples
subunidades.
➢ Comparaciones de las propiedades de
canales de diversos tejidos
➢ Examinar la función de canal y receptor
con mensajeros secundarios
➢ Análisis de acoplamiento
receptor-efector

34 (Molecular devices 2021)

 ¿Que es un ovocito de Xenopus?

La membrana vitelina vuelve la estructura

resistente, por lo que solo se quita para los métodos
patch

La capa de folículo puede ser problemática así que

se quita con un tratamiento de colagenasa

Se describieron en muchos artículos canales

endógenos del ovocito que eran en realidad del
folículo

Polo vegetal y animal, distribución diferencial de

canales
VI fases de desarrollo- 1–1.2 mm
35 (Molecular devices 2021)
 Patch clamp en ovocito de
Xenopus
Remoción de la Agarosa
membrana vitelina Sin el vitelo el ovocito
está frágil y se pegará
Se debe someter a una a vidrio o plástico,
solución hipertónica pero no a ágar, por lo
de decapado que se colocaran en
200 mM K-aspartate, caja de petri con 2%
20 mM KCl, 1 mM de agar
MgCl2 , 10 mM EGTA,
10 mM HEPES, pH 7.4

36 (Molecular devices 2021)

 Metodología lineal
Inserción de mRNA del Traslado a ágar
receptor de interés Posterior traslado al
Inducir la expresión montaje con mucha
del canal en gran delicadeza
cantidad

01 02 03 04 05

Remoción de la Remoción de la PATCH CLAMP

capa folicular membrana vitelina Formación de un
Tratamiento con la giga seal y estudio
solución y posterior del canal iónico.
remoción manual

37 (Molecular devices 2021)

 RESOURCES
Molecular Devices. (2021). The Axon Guide Electrophysiology and Biophysics Laboratory
Techniques Fifth Edition. In moleculardevices.com.
https://www.moleculardevices.com/sites/default/files/en/assets/user-guide/dd/cns/the-axon-gui
de.pdf?utm_medium=email&_hsmi=218755224&_hsenc=p2ANqtz-8pPCupnXJfgtYhY_EpdGjEL0V8
mep8It64Ko2-a3Fksx6KmbuWjt_gXG2lAIezDzlWxtVxowPXAJOU51YQ7G0dwhvh3Q&utm_content
=218755224&utm_source=hs_automation

Rodriguez Moreno, A. (2023). Unidad de electrofisiología: registros extracelulares y de patch-clamp.

Www.upo.es. https://www.upo.es/upotec/catalogo/salud/unidad-de-electrofisiologia/

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