“AÑO DE LA INTEGRACIÓN NACIONAL Y EL RECONOCIMIENTO

DE NUESTRA DIVERSIDAD”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

Facultad de Medicina Humana

Escuela Profesional de Enfermería

PRACTICA N° 3
CURSO: Bioquímica.

TEMA: >Métodos cromatográficos y de separación en la

determinación de aminoácidos y proteínas.

>Determinación del punto isoeléctrico de las proteínas.

DOCENTE: Mg. Rueda Avalo Luis Antonio

Carlos Holguín Mauricci

Mg Olga Soriano Carmen

D r. Gabriel Cabredo Castro

Dra. Violeta Garrido Morín.

ESTUDIANTE: Haidy Yadira Peña Calle.

CICLO: II
 INTRODUCCIÓN

Las proteínas son componentes importantes de los alimentos. Por un lado,

proporcionan los elementos necesarios para la síntesis proteica. Por otro lado,
los aminoácidos y péptidos contribuyen directamente al sabor de los alimentos y
son precursores de componentes aromáticos y colorantes formados por
reacciones térmicas y / o enzimáticas que ocurren durante la producción.
almacenamiento de los mismos.

Es importante determinar el contenido en aminoácidos, en conjunto, para estimar

el grado de proteólisis enzimática que ha sufrido el producto, así como la
proporción de cada uno de ellos, como componentes de la proteína, cuando se
desea establecer su valor biológico.

Así que esta parte práctica nos ayudará a conocer la cromatografía que es la
técnica química analítica que se utiliza para separar sustancias puras de mezclas
complejas. Esta técnica se basa en el principio de adsorción selectiva (no
confundir con absorción). La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso-
italiano Mikhail Tswett en 1906, pero su uso no se generalizó hasta la década de
1930. Tswett aisló pigmentos vegetales (clorofila) vertiendo el extracto de hojas
verdes en éter de petróleo en una columna de calcio en polvo. carbonato de sal
dentro del tubo de ensayo. A medida que la solución se filtraba a través de la
columna, cada componente de la mezcla precipitaba a una velocidad diferente,
dejando la columna marcada con bandas horizontales de color, llamadas
cromatogramas. Cada banda corresponde a un pigmento diferente.

I. OBJETIVOS
 ⮚ Que el alumno utilice el método cromatográfico de capa fina para separar
e identificar las propiedades físico-químico de los aminoácidos en
nuestros patrones y problemas.

⮚ Que el alumno identifique el Pi, en el cual la ovoalbúmina puede ser

separada de una muestra biológica y explique en que se fundamenta los
métodos de separación de proteínas.

II. BASE TEÓRICA

CROMATOGRAFÍA
Es un método analítico de separación de sustancias de una mezcla, estas
sustancias pueden ser coloreadas, no coloreadas, gases y compuestos
volatilizables.

PARTES DEL SISTEMA CROMATOGRÁFICO

● Fase Fija: Es la parte donde se realiza la separación del componente,

puede ser papel silicagel, gas inerte, etc.

● Fase Móvil: Es el solvente que a través de la fase fija va a eludir

arrastrando con el soluto que se quiere separar.

CARACTERÍSTICAS PARA LA SEPARACIÓN

▪ Paso del soluto.

▪ Polaridad del soluto y al solvente.
▪ Afinidad al soluto por el arte fija.
▪ Coeficiente de participación.

FASES DE LA CROMATOGRAFÍA
1. Extracción: Procesamiento de la muestra para extraer el principio activo por
métodos físicos.

o Mecánicos.
o Solubilidad.

2. Concentración: Aplicando solventes orgánicos volátiles.

3. Cromatograma: Propiamente dicho: Poner la muestra para su recorrido a

través de la fase fija.

4. Revelado: Usar sustancias patrones, densitómetro y reactivos apropiados.

Existen diferentes tipos de cromatografía entre las que tenemos:

● Cromatografía de papel (Mono y Bidimensional).

● Cromatografía de capa fina.
● Cromatografía de gas.
● Cromatografía de partición o reparto.
● Cromatografía de exclusión molecular Sphadex.
● Cromatografía de intercambio idóneo.
● Cromatografía de columna.
● Cromatografía por electroforesis.
● Cromatografía de exclusión molecular.

PROCEDIMIENTOS DE SEPARACIÓN

Las proteínas en disolución muestran cambios profundos de su solubilidad en

función de:

o El pH.
o Fuerza iónica (precipitación por salado).
o Propiedades dieléctricas del disolvente.
o Temperatura.

Estas variables que son reflejo del hecho de que las proteínas son electrolitos de
peso molecular muy grande, puede utilizarse para separar mezclas de proteínas,
ya que cada proteína posee su composición en aminoácido característicos, la
cual determina su comportamiento como electrolito.

PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA
La solubilidad de la mayor parte de proteína globulares se halla profundamente
influida por el pH del sistema, casi todas las proteínas globulares muestran un
mínimo de solubilidad, aunque el pH al que ello ocurre varía de una proteína a
otra.

El pH al que una proteína muestra un mínimo de solubilidad es su pH isoeléctrico

definido como aquel valor del pH al que la molécula no pose carga eléctrica.
Ejemplo: ovoalbúmina (huevo) pH 4.6, ureasa pH 5 en estas condiciones no
existe repulsión electrostática entre moléculas de proteínas vecina y tiende a
coalecer y precipitar, sin embargó, cuando los valores del pH están por encima
o por debajo del punto isoléctronico, todas las moléculas de proteínas poseen
carga eléctrica neta del mismo signo. Por dicha razón es repelen mutuamente
impidiendo la coalescencia de moléculas para formar agregados insolubles.
Puesto que las diferentes proteínas poseen valores de pH isoeléctrico diferente,
con frecuencia pueden separase una de otra, mediante precipitación
isoeléctrica, cuando el pH de una mezcla de proteínas se ajusta al pH
isoeléctrico de uno de sus componentes. La mayor parte o casi todo el
componente precipitará que dando solución las proteínas cuyos valores de pH
isoeléctrico se hallen por encima o por debajo de aquel, la proteína isoeléctrica
precipitada permanece en su con} formación nativa y puede disolverse en un
medio a pH apropiado y concentración salina adecuada.

III. MATERIALES

❖ REACTIVOS
-Fase móvil para cromatografía de papel Metanl-H2O Piridina (80-20-4).

-Fase fija papel de filtro.

-Solución de aminoácidos:
a. Arginina 1% en Na (OH) a PH neutro.

b. Aspártico 1% hasta disolución.

c. Hestidina 1 % hasta disolución.

-Solución de Ninhidrina:

a. Ninhidrina 0.1%.
b. Colidina 2ml.
c. Ácido acético glacial 10 ml.
d. Csp. 100 ml. En
etanol.
-Ácido acético 1 N: Tomar 60 ml de ácido acético glacial, densidad 1,06, pureza
96% y diluir hasta 00 ml. Con agua destilada.

-Solución de caseína en acetato de sodio 0.1 N.

-Sal de fenolftaleína.

-Na (OH) 10%.

IV. PROCEDIMIENTO

1. CROMATOGRAFÍA DE PAPEL

1. Les será dado un papel Whatman N-l cortao en tiras de 15 x 25 cm.

Aproximadamente, manipule el papel por las esquinas evitando agarrarlo
en lo posible, colóquele sobre un papel limpio.
2. Engrape un hilo a la parte superior del papel Whatman.
3. Con un lápiz marque el punto de origen, trazando una línea, esta debe
estar por encima de la altura del solvente.
4. Aplique utilizando los tubos capilares las diferentes muestras según el
esquema (no toque el papel con los dedos).

Hilo
Muestra A, B. C.

Patrones de HC1 de 3 aminoácidos

Nota:

❖ Para aplicar la muestra toque el papel levemente con el tubo capilar

puesto verticalmente.
❖ Repetir el tubo cuando la mancha haya alcanzado unos 3 mm., de
diámetro.
❖ Una vez seca la mancha repita la aplicación dos veces más.
❖ Coloque el papel en la cámara dejando que el borde inferior quede
sumergido 1 o 2 cm en el solvente.
❖ Deje el papel en la cámara dejando que el borde inferior quede de la
cinta adherida.
❖ Una vez que la muestra halla recorrido, saque el papel de la cámara.
❖ Marque el límite de migración del frente del solvente.
❖ Seque los papeles en un horno.
❖ Rocié sobre los cromatogramas la solución reveladora de Ninhidrina-
colina-ácido acético glacial.
❖ Caliente el papel en un horno a 100 °C hasta que aparezca las manchas
de los aminoácidos.
❖ Calcule el f de cada mancha y haga identificación tentativa de los
aminoácidos, comparado los Rf, obtenidos con la muestra problema.
 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑑𝑒𝑙𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜𝑑𝑒𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛𝑎𝑙𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑜𝑑𝑒𝑙𝑎𝑚𝑎𝑛𝑐ℎ𝑎
RF= 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑑𝑒𝑙𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜𝑑𝑒𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛𝑎𝑙𝑓𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒𝑑𝑒𝑙𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

2. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LAS PROTEÍNAS

1. Marcar una serie de tubos del 1 al 9.

2. En el tubo 1, medir 3.2 ml. De ácido acético 1Ny6,8 ml de agua destilada.
3. Medir 5 ml de agua destilada en cada uno de los 8 tubos.
4. Sacar 5 ml del tubo 2 y transferir al tubo 3, etc. Continuando del mismo
modo hasta completar la serie. En el tubo 9, una vez efectuada la mezcla
se sacan 5 ml de solución que se eliminan.
5. Agregar rápidamente 1 ml de solución de caseína en acetato de sodio
0.1N a cada tubo. Mezclar al instante por inversión.
6. Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la
proteína en los diferentes tubos, anotar en el cuadro que sigue.
7. Observar después de 30 minutos, anotar en el cuadro el pH de cada tubo
(ver nota al final).
8. Calentar ligeramente cada uno de los tubos y apreciar el efecto sobre la
solubilidad.
9. Agregar 1 gts. De fenolftaleína y mezclar.
10. Agregar Na (OH) al 10% gts. Agitando hasta la aparición de un color
rosado y observar el efecto sobre la solubilidad.

Así para el tubo N° 3, por ejemplo:

PH = PK+ log sal ácido

N°

SAL 1 ml.

ACIDO 5 ml.
 0.4x10mts. ———— 6 ml. solo. 0.1x10 ——— 6 ml

0.4 ———— 1000 ml. 0.1M ——— 1000

6 6CDNC

0.1
0.1 1
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾 + 𝑙𝑜𝑔 6 = =
0.4 0.4 4
6

𝑝𝐻 = 4.1

V. OBSERVACIONES

⮚ CROMATOGRAFIA

Extracción con etanol a las hojas moradas de les extrajo clorofila roja y a las
hojas verdes se les extrajo clorofila verde.

✔ Luego:

. . .
 A B D (desconocido (mezcla de A y B))

✔ Fase móvil (piridina, metanol y agua destilada).

✔ Cuando seca

El último avanza más

A B D

Calculando RF de cada caso: A,B Y D

1. Muestra A: RF= 1.5 cm= 0.25…

5.9 cm
2. Muestra B: RF= 0.9cm= 0.15…
5.9 cm

3. Muestra C: RF= 2.1cm = 0.35…

5.9cm

⮚ PRECIPITACION ISOELECTRICA
VI. CUESTIONARIO

1. ¿Qué entiende por cromatografía?

La cromatografía describe un proceso químico en el que una mezcla se separa

en sus componentes individuales mediante una fase móvil y una fase
estacionaria. Según el proceso, la fase estacionaria consta de una fase sólida o
líquida y una fase móvil de un líquido o un gas. Es una técnica que permite
separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de compuestos
químicos, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia y la
física. fundamentada en una capa fija y una capa móvil y el compuesto que se
quiere separar tiene que tener afinidad por la capa móvil.

La cromatografía utiliza diferentes procesos que, según el campo de aplicación,

tienen sus ventajas y desventajas. Los procedimientos más importantes son la
cromatografía en papel, la cromatografía en capa fina, la cromatografía en
columna y la cromatografía de gases, por otro lado, en el análisis químico, la
cromatografía se usa para separar mezclas en compuestos homogéneos. La
cromatografía juega un papel importante en muchas industrias, como la
química orgánica, la bioquímica, la química inorgánica, la química ambiental, la
química de los alimentos.

2. Diga tres ejemplos de cromatografía en muestras biológicas.

● Cromatografía plana: La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana

o sobre un papel. Las principales técnicas son:

❖ Cromatografía en papel :
Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos
ya que pese a no ser una técnica muy potente no requiere de ningún tipo de
equipamiento.
La muestra a analizar se coloca en forma de gota en un extremo del papel. Luego
se sumergió la tira de papel en un recipiente con la fase móvil, notando que el
extremo donde se colocó la muestra estaba en la parte inferior del papel. La fase
móvil se ve reforzada por las propiedades capilares, que transportan la muestra
y separan cada componente según su afinidad por la fase estacionaria. Este tipo
de cromatografía se utiliza principalmente cuando cada componente de la
muestra tiene un color diferente, luego puede ver la visualización de los colores
en el papel para identificarlos. El funcionamiento de esta técnica es similar al de
la cromatografía en papel, pero en este caso la fase estacionaria se construye
depositando una resina polar (casi siempre gel de sílice) sobre una placa de
vidrio o aluminio. Se coloca una cierta cantidad de muestra a 1 cm del borde
inferior de la placa. Luego sumerja el plato, asegurándose de que la punta de la
muestra esté boca abajo en el recipiente que contiene la fase móvil. La fase móvil
es capilar aumentada, ayudando a separar los componentes de la muestra.

❖ Cromatografía en capa fina:

Es una técnica cromatográfica utilizada, entre otros posibles usos, para separar
los componentes puros que forman parte de una mezcla.

● Cromatografía en columna: La fase estacionaria se sitúa dentro de una

columna. Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen: La
muestra se coloca en la parte superior de la columna y se deja descender
por gravedad a la fase móvil. Por tanto, la cromatografía en columna se
puede clasificar como:

❖ Cromatografía de líquidos :

Es una técnica ampliamente utilizada que permite separar físicamente y

cuantificar los distintos componentes de una solución.

❖ Cromatografía de gases:

La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra

se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica.
 ❖ Cromatografía de fluidos supercríticos:

Es una técnica híbrida entre la cromatografía de gases (GC) y la HPLC, que

combina lo mejor de ambas técnicas. Esta técnica es importante porque permite
la separación de mezclas en las que no es adecuada la aplicación de la GC ni
de la HPLC.

● Cromatografía por Permeabilidad en Gel.

Es útil para la separación de proteínas. La cromatografía de exclusión por

tamaño, también conocida como filtración en gel, separa sobre la base del
tamaño. La matriz de la columna consta de un polímero reticulado con poros de
tamaño definido. Las proteínas más grandes se mueven a través de la columna
más rápido que las proteínas más pequeñas porque son demasiado grandes
para entrar en los poros de las partículas de polímero y, por lo tanto, siguen un
camino más corto y directo a lo largo de la columna. Las proteínas más
pequeñas entran en los poros y su movimiento a lo largo de la columna es más
lento.

La cromatografía de permeación en gel se utiliza en diversos campos

industriales y de investigación. Por ejemplo, en ingeniería de polímeros, la
técnica GPC se utiliza para caracterizar polímeros nuevos o modificados donde
se busca cumplir requisitos específicos, en la industria alimentaria, ingeniería
GPC utilizada en el análisis de aditivos como pectina, celulosa, almidón, etc., y
en la industria farmacéutica esta técnica se ha utilizado para un análisis.

Cromatografía de partición:

Ocurre cuando la separación del analito de la mezcla ocurre debido a una

diferencia en la solubilidad o polaridad entre las fases estacionaria y móvil, donde
las dos fases líquidas son inmiscibles. La tecnología de la fase estacionaria ha
evolucionado y se han utilizado una variedad de combinaciones líquidas y
resinas sólidas para este propósito. En este sentido, existen dos tipos de
cromatografía en función de la polaridad de las fases estacionaria y móvil.

▪ En fase normal: La fase estacionaria es polar y la fase móvil es apolar.

▪ En fase reversa: La fase estacionaria es apolar y la fase móvil es polar.

Cromatografía de adsorción: En este tipo de cromatografía, la fase

estacionaria es sólida y la fase móvil es líquida. El agente formador de la fase
estacionaria puede ser aluminio (Al2O3), sílice (SiO2) o una resina de
intercambio iónico (matriz con sitios electrostáticamente activos en los que el
analito se mantiene allí mediante interacciones electrostáticas). La fase móvil
puede consistir en un disolvente o una mezcla de disolventes. Algunos
componentes de la mezcla quedarán retenidos con mayor fuerza que otros, de
esta forma se produce la separación.

3. Diga el fundamento de dos tipos de cromatografía.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

⮚ Cromatografía de Intercambio Iónico

Se realiza sobre matrices que tienen una carga neta, positiva en el esquema. La
carga de la matriz de la columna, así como la carga de las proteínas dependerá
del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de
iones). En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las
proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las
proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada
positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eludir las proteínas retenidas
se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el
punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de
este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna.

La fase estacionaria contiene grupos funcionales cargados positivamente, por lo

que retiene aniones (cargados negativamente). La cromatografía IEX se utiliza
para separar biomoléculas cargadas eléctricamente. La muestra cruda que
contiene moléculas cargadas se utiliza como fase líquida. A medida que
atraviesan la columna, las moléculas se unen a sitios con carga opuesta en la
fase estacionaria. Las moléculas separadas según su carga se lavan con una
solución de diferente fuerza iónica. Al pasar dicha solución a través de la
columna, se produce una separación muy selectiva de las moléculas según sus
diferentes cargas.

El intercambio iónico es el método cromatográfico más utilizado para la

separación y purificación de biomoléculas cargadas como polipéptidos,
proteínas, polinucleótidos y ácidos nucleicos. Aplicabilidad distribuida, alta
capacidad y simplicidad, así como alta resolución son las principales razones de
su éxito como método de separación. La cromatografía de intercambio iónico se
utiliza ampliamente en diversas aplicaciones industriales, algunas de las cuales
son las siguientes:

• Biotecnología - usos analíticos tales como control de calidad y control de

procesos operativos
• Separación y purificación de los componentes de la sangre tales como
albúmina, factores de incremento recombinantes y enzimas.
• Comida e investigación clínica - estudiar variedades del trigo y la
correlación de la proteinuria con diversas enfermedades renales.
• Fermentación - las resinas del intercambio catiónico se utilizan para vigilar
el proceso de fermentación durante la producción de la ß-galactosidasa.
⮚ Cromatografía de Filtración en Gel

Está fabricado con una matriz formada por esferas porosas. El volumen
de los huecos es muy grande y se determina su diámetro. Cuando dos
proteínas de este tamaño entran en el buffer y una penetra en los poros
de la perla de gel y la otra no, la primera proteína se distribuye entre los
espacios entre las partículas y dentro de los poros, reduciendo la
concentración. Grado en la fase libre entre partículas. La segunda
proteína, por tamaño, solo se puede encontrar entre las bolas. El flujo de
disolvente entre las partículas es mayor que dentro de sus poros, por lo
que el efecto neto es acelerar la migración de proteínas de mayor peso
molecular en comparación con las de menor peso molecular. En esta
cromatografía, las proteínas más grandes se eluyen primero y las
proteínas más pequeñas en segundo lugar, y la longitud y el volumen de
la columna tienen una gran influencia en los resultados. Las columnas
largas proporcionan una separación de mejor calidad.
Diga dos importancias de la separación de proteínas desde el punto de
vista de aplicación biológica.
El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga / masa de los
analitos. Su utilidad está en la separación de proteínas y péptido entre otras
sustancias. Entre las ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede
apuntar que da lugar a separaciones con volúmenes de muestra
extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL), en contraste con la electroforesis
convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra en el orden de los
µL, con una elevada resolución y rapidez. Ofrece además mayor facilidad y
velocidad que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
 4. ¿Qué entiende por punto isoeléctrico de las proteínas?

El punto isoeléctrico es el PH en que cualquier proteína tiene el 50% de sus

cargas básicas y el 50% de sus cargas acidas. El punto isoeléctrico es el pH al
que una sustancia anfótera tiene carga neta cero. El concepto es
particularmente interesante en los aminoácidos y también en las proteínas. A
este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. Para calcularlo se
deben utilizar los pKa.
El punto isoeléctrico se denomina forma zwiteriónica de la proteína. Los iones
híbridos tienen grupos funcionales separados, que llevan una carga positiva o
negativa. Un aminoácido bipolar consiste en un ion carboxilato negativo y un ion
amonio positivo más la carga en su cadena lateral, que varía entre los
aminoácidos.

5. ¿Qué entiende por coagulación, precipitación y desnaturalización

de las proteínas?

▪ Coagulación

La coagulación de proteínas es un proceso irreversible; las proteínas, debido al

gran tamaño de sus moléculas, forman soluciones coloidales con el agua.
Estas soluciones pueden precipitar con formación de coágulos cuando se
calientan a temperaturas superiores a 70 ° C o cuando se tratan con soluciones
de sales, ácidos, alcoholes, etc. Es debido a su desnaturalización por agentes
específicos, al actuar sobre la proteína, la perturba destruyendo su estructura
terciaria y cuaternaria.
 ▪ Desnaturalización
Las proteínas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional
(conformación química) y así el característico plegamiento de su estructura. Si la
forma de la proteína es alterada por algún factor externo (por ejemplo,
aplicándole calor, ácidos o álcalis), no es capaz de cumplir su función celular.
Éste es el proceso llamado desnaturalización.
Cuando la proteína no sufre ningún cambio en su interacción con el solvente, se
dice que tiene una estructura natural. La desnaturalización de la proteína se
denomina pérdida de conformación de orden superior (secundaria, terciaria y
cuaternaria), lo que hace que la cadena polipeptídica se reduzca a un polímero
aleatorio sin ninguna estructura tridimensional fija. Cualquier factor que altere la
interacción de la proteína con el solvente disminuirá su estabilidad en solución y
provocará precipitación. Por tanto, la desaparición total o parcial de la capa de
agua, la neutralización de las cargas repelidas o la rotura de los enlaces de
hidrógeno facilitarán la aglomeración intermolecular y provocarán la
precipitación. La precipitación suele ser el resultado de un fenómeno conocido
como desnaturalización y luego se dice que la proteína está desnaturalizada.

▪ Precipitación

Es el proceso o fenómeno de formación de un segundo estado o fase de la

materia, dentro de una primera fase (véase Regla de las fases). Si por ejemplo,
el aire que contiene vapor de agua se enfría por debajo del punto en que se
forma el rocío, se crea un precipitado de agua líquida dentro de la fase gaseosa.

Las proteínas son solubles en agua debido a las interacciones entre sus grupos
polares y con las moléculas de agua. Algunas muestras de proteínas, como el
plasma, a menudo se analizan en busca de fármacos menores y sus respectivos
metabolitos, utilizando una técnica conocida como precipitación de proteínas
 6. Señale tres métodos de fraccionamiento de las proteínas y
fundamente en forma breve.

MÉTODOS DE ROTURA CELULAR Y EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS

El primer paso para aislar una proteína es romper la célula, de modo que la
proteína pueda luego extraerse con un tampón adecuado. El método de
disrupción elegido depende de las características mecánicas del tejido o de la
célula de la que se aísla la proteína, así como de su ubicación. Entre los diversos
métodos, se encuentran:

1. Lisis celular: Válido para células sin pared celular como las células de tejidos
animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Implica la
ruptura de las membranas celulares de las células o bacterias y provoca la
liberación de orgánulos o materia celular.

Esta ruptura puede ocurrir por medios químicos o físicos o incluso por infección
viral. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida
que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior
de la célula, causando su hinchamiento y rotura.

2. Destrucción mecánica: Entre estos métodos se encuentran la

homogenización (hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que
ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina; molino con
perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las células a gran velocidad
a través de un pequeño orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones
de ultrasonido).

3. Congelación-descongelación: La rotura se produce al someter las células a

un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno
líquido) y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25 ºC).

7. ¿Cómo se clasifican las proteínas?

La clasificación de las proteínas se realiza desde varios puntos de vista, así:

>SEGÚN SU COMPOSICIÓN

▪ Proteínas simples u Holoproteínas.

▪ Proteínas conjugadas; Según la naturaleza de este grupo
consideramos:

✔ Glicoproteínas.
✔ Lipoproteínas.
✔ Nucleoproteínas.
✔ Metaloproteínas.
✔ Hemoproteínas o Cromoproteínas.

>DE ACUERDO CON SU MORFOLOGIA Y SOLUBILIDAD

1. Proteínas fibrosas.

2. Proteínas Globulares: A su vez las proteínas globulares se pueden

clasificar de acuerdo con su solubilidad:

✔ Albúminas.
✔ Globulinas.
✔ Glutelinas.
✔ Prolaminas.

>DE ACUERDO CON SU FUNCIÓN BIOLÓGICA:

● Proteínas estructurales.
● Proteínas de transporte.
● Proteínas de defensa.
● Proteínas hormonales.
● Proteínas como factores de crecimiento.
● Proteínas catalíticas o enzimas.
● Proteínas contráctiles.
● Proteínas receptoras.
● Proteínas de transferencia de electrones.

8. Diga ocho funciones de las proteínas. (solo funciones)

Las proteínas determinan la forma y estructura de las células y dirigen la mayoría

de los procesos vitales. Las funciones de las proteínas son específicas de cada
tipo y permiten que las células mantengan su integridad, se protejan contra
agentes externos, reparen daños, controlen y regulen funciones, y más. Todas
las proteínas realizan sus funciones de la misma manera: uniéndose
selectivamente a moléculas.

Dentro de sus funciones encontramos las siguientes:

 ▪ FUNCIÓN ESTRUCTURAL

-Algunas proteínas constituyen estructuras celulares.

-Otras proteínas confieren elasticidad y resistencia a órganos y tejidos:

o El colágeno del tejido conjuntivo fibroso.

o La elastina del tejido conjuntivo elástico.
o La queratina de la epidermis.

▪ FUNCIÓN ENZIMATICA

Las proteínas con funciones enzimáticas son numerosas y muy especializadas.

Actúan como catalizadores biológicos de reacciones químicas en el metabolismo
celular.

▪ FUNCIÓN HORMONAL

Algunas hormonas son de naturaleza protéica, como la insulina y el glucagón

(que regulan los niveles de glucosa en sangre) o las hormonas segregadas por
la hipófisis como la del crecimiento o la adrenocorticotrópica (que regula la
síntesis de corticosteroides) o la calcitonina (que regula el metabolismo del
calcio).

▪ FUNCIÓN REGULADORA

Algunas proteínas regulan la expresión de ciertos genes y otras regulan la

división celular (como la ciclina).

▪ FUNCIÓN HOMEOSTATICA

Algunas mantienen el equilibrio osmótico y actúan junto con otros sistemas

amortiguadores para mantener constante el pH del medio interno.

▪ FUNCIÓN DEFENSIVA
o Las inmunoglobulinas actúan como anticuerpos frente a posibles
antígenos.
o La trombina y el fibrinógeno contribuyen a la formación de coágulos
sanguíneos para evitar hemorragias.
o Algunas toxinas bacterianas, como la del botulismo, o venenos de
serpientes, son proteínas fabricadas con funciones defensivas.

▪ FUNCIÓN DE TRANSPORTE
o La hemoglobina transporta oxígeno en la sangre de los vertebrados.
o La hemocianina transporta oxígeno en la sangre de los invertebrados.
o Los citocromos transportan electrones.
▪ FUNCIÓN CONTRACTIL
 o La actina y la miosina constituyen las miofibrillas responsables de la
contracción muscular.
o La dineina está relacionada con el movimiento de cilios y flagelos.
▪ FUNCIÓN DE RESERVA

o La ovoalbúmina de la clara de huevo, la gliadina del grano de trigo y la

hordeina de la cebada, constituyen la reserva de aminoácidos para el
desarrollo del embrión.
o La lactoalbúmina de la leche.

9. ¿En qué se fundamenta la electroforesis?

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o

ácidos nucleícos) sobre la base de su tamaño molecular y carga eléctrica.
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en
un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo
que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas
cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y
aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo
positivo).
La electroforesis es una técnica utilizada por los científicos en el laboratorio para
separar ADN, ARN o moléculas o proteínas en función de su tamaño y carga
eléctrica. Se utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas y separarlas
a través de un gel. Los poros del gel actúan como un filtro, lo que permite que
las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las moléculas más
grandes. Las condiciones utilizadas durante la electroforesis se pueden ajustar
para separar moléculas dentro del rango de tamaño deseado.
10. ¿En qué se fundamenta el método cromatográfico de exclusión?

A la cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) también conocida como

cromatografía en xel permeable o cromatografía de filtrado en xel, separa
partículas según o su tamaño. Así moléculas más pequeñas entran por medio
poroso y tardan más tiempo en salir de la columna, mientras que las partículas
mayoressalen antes. Normalmente es una cromatografía de baja resolución, a
reservase para los pasos finales de purificación.
La cromatografía de exclusión por tamaño es un tipo de cromatografía líquida en
la que la fase estacionaria es un sólido y la fase móvil es un líquido. Se utiliza el
término "cromatografía de exclusión por tamaño". También se conoce como
"cromatografía de permeación en gel" (GPC) o cromatografía de permeación en
gel. Su principal aplicación es la de separar moléculas por tamaño para estudiar
la masa molecular y distribución de polímeros).
También es útil para determinar a estrutura terciaria y una estrutura cuaternaria
de proteínas purificadas, especialmente porque se puede llevar a cabo en
condiciones excitadas de disolución.

11. ¿En qué se fundamenta la cromatografía líquida de alta precisión?

 ▪ Elución por alta presión (hasta 500 atmósferas).
▪ Alta resolución, rapidez y reproducibilidad.
▪ Purificación de moléculas biológicas de gran variedad de Propiedades y
tamaños.

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es la técnica cromatográfica

más utilizada. La separación cromatográfica se puede definir como la
transferencia de masa entre las fases estacionaria y móvil. La mezcla que
contiene los compuestos a separar se disuelve y se inyecta en una columna que
contiene la fase estacionaria, a través de la cual se fuerza a pasar a través de la
fase móvil arrastrada por la bomba de alta presión. Dentro de la columna, la
mezcla se separa en sus componentes según sus interacciones entre las dos
fases. Esta separación puede modificarse mediante la selección adecuada de
las fases móvil y estacionaria, el caudal de la fase móvil o la temperatura de
separación. De esta forma, la técnica HPLC obtiene un alto grado de flexibilidad
difícil de encontrar en otras técnicas, que pueden separar componentes de
muchos tipos de mezclas.

VII. CONCLUSIONES
 ▪ La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar
los componentes de una mezcla de compuestos químicos.

▪ Hemos podido recoger el concepto de punto isoeléctrico siendo este el

PH en que cualquier proteína tiene el 50% de sus cargas ácidas y el 50%
de sus cargas básicas.

▪ La única proteína termoestable es la “CACEINA”.

▪ Cada proteína posee su composición en aminoácidos característicos, la

cual determina su comportamiento como electrolito.

▪ Existen varios métodos de separación de compuestos, pero una de las

más fáciles y accesibles es el método de cromatografía en papel filtro.

VIII. BIBLIOGRAFÍA

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▪ http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa.

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