Cultivo e Identificacion Rhizobium AV 2020 URP

UNIVERSIDAD RICARDO PALMA
Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela Profesional de Biología
Asignatura: MICROBIOLOGIA APLICADA – PRÁCTICA DE LABORATORIO
CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE
Rhizobium sp.
Mg. Blgo. Juan Carlos Ramos Gorbeña

CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE Rhizobium sp.
GÉNERO Rhizobium
✓ Su nombre enfatiza la peculiaridad que tiene de nodular las raíces (rhiza:

raiz, bius: vida, Rhizobium: vida en las raíces).
✓ Los rizobios invaden las raíces de las leguminosas a través de los pelos
radiculares.
✓ Forman nódulos de color rosa efectivos en las raíces.
✓ Viven simbióticamente dentro de los nódulos y fijan el nitrógeno.
✓ Convierten el nitrógeno atmosférico en formas accesibles para las plantas.
✓ La mayoría de los rizobios son de naturaleza específica del huésped.

Características del género Rhizobium
✓ Son gramnegativos, de 0.5-1.0 x 1.2-3.0 μm.

✓ Forma de bastones pleomórficos.
✓ No esporulados.
✓ Móviles flagelos peritricos o polares.
✓ Son bacterias quimiorganotrofos (crecen en medio en una
amplia fuentes de carbono)
✓ Utilizan la glucosa sin producir acidez.
✓ Son aerobios estrictos.
✓ Temperatura óptima de 20°C – 30°C
✓ Forman asociación simbiótica con las leguminosas.
GÉNERO Rhizobium
Características del género Rhizobium

CLASIFICACIÓN DE Rhizobium
El manual Bergey de bacteriología Sistemática establece que la familia

Rhizobiaceae tiene cinco géneros:
✓ Rhizobium,
✓ Bradyrhizobium,
✓ Azorhizobium,
✓ Phyllorizobium y
✓ Agrobacterium.
OBJETIVO
✓ Aislar bacterias del género Rhizobium de los nódulos de la raíz

de plantas leguminosas.
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIAL BIOLOGICO
Muestra: raíces de plantas leguminosas
MEDIOS DE CULTIVO
✓ Caldo de Cultivo Levadura Manitol (LMC)
✓ Caldo de Cultivo Levadura Manitol + Triptófano
✓ Medio de Cultivo Levadura Manitol Agar (LMA)
✓ Medios para realizar la bioquímica de Rhizobium.
SOLUCIONES Y REACTIVOS MATERIALES

✓ Baguetas y espátulas de Driglasky
✓ Alcohol al 70°y 96° ✓ Beakers
✓ Buffer pH 7 y 4 ✓ Tubos de Prueba
✓ Frascos de Vidrio con tapa estériles
✓ Hipoclorito de sodio 2% y 3% ✓ Pinzas
✓ Solución salina al 0.85% ✓ Pipetas de
✓ Placas Petri 15 x 100 mm
✓ Solución NaOH 1N y HCl 1N ✓ Probetas graduadas
✓ Solución de Rojo Congo ✓ Potenciómetro
✓ Bañomaría
EQUIPOS DE LABORATORIO
✓ Autoclave ✓ Microondas
✓ Balanza Analítica y de platillo ✓ Refrigeradoras
✓ Congeladoras ✓ Centrífuga
✓ Estufa u Horno ✓ Potenciómetro
✓ Incubadora ✓ Baño María
METODOLOGÍA
AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y CONSERVACIÓN DE CEPAS
1. Muestreo de plantas, colecta y evaluación de nódulos

✓ Se realiza el muestreo al azar de las plantas.
✓ Se escogerán aquellas plantas que tengan un buen aspecto

así como un buen número de nódulos. Con la ayuda de una
lampa se sacara la planta con todo y raíz, provenientes de
campos de cultivos de leguminosas.
✓ Las muestras serán llevadas al laboratorio en bolsas de

plástico con previa rotulación de las plantas.
METODOLOGÍA
2. Aislamiento de Rhizobium
✓ Los nódulos se colocaran en sobres de papel de filtro para hidratarse en agua destilada
estéril durante 30 minutos.
✓ Luego se desinfectaran en alcohol al 70% por 1 minuto en un vaso de precipitación y en
hipoclorito de sodio al 3% por espacio de 3min.
✓ Se enjuagaran con agua destilada estéril.
✓ Se sacaran los nódulos de sus sobres, con una pinza estéril y se colocaron en placas Petri
estériles, agregándole una gota de agua destilada estéril por nódulo.
✓ Luego con la ayuda de una bageta, se aplastaron lo nódulos y el macerado se sembrara
en placas Petri con LMA (Agar-levadura-Manitol) con rojo congo por estrías.
✓ La placas serán incubadas a 28°C de 2 – 15 días. (Para identificar Rhizobium o
Bradyrhizobium).
✓ Después de este tiempo se escogerá los posibles rizobios, para su posterior
caracterización bioquímica.
Rhizobium sp.
METODOLOGÍA
AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y CONSERVACIÓN
DE CEPAS
METODOLOGÍA
3. Evaluación de las colonias y conservación de cepas
La evaluación de las colonias se realizara después del la
incubación, determinándose:
✓ El diámetro de las colonias.
✓ Cantidad de goma (que puede ser abundante o escasa)
✓ Textura de la colonia (elástica o cremosa), apariencia
(traslúcida u opaca)
✓ Color según las recomendaciones del CIAT (1987).
✓ Las cepas aisladas se conservaran en tubos con LMA a 10°C
y glicerol a -20°C.
Colonias de la cepas Rhizobium

aislados de la variedad ´Canario
Centenario, cepa ligosa, de
2mm, rosada, opaca, tiempo de
aparición en LMA, 48h.
METODOLOGÍA
(A) Corte transversal de nódulos de Cajanus cajan con coloración rojiza

(leghemoglobina). (B) Aislados de nódulos sembrados en medio LMARC. (C) Bacilos
Gram (-) observados con objetivo100x (inmersión en aceite).
Rhizobium sp.
MATERIALES Y MÉTODOS Caracterización morfológica de 20 cepas de Rhizobium colectadas en plantas de frijol

común (Phaseolus vulgaris L.) silvestre y domesticado en los estados de Jalisco y
Michoacán, México.
METODOLOGÍA
4. Pruebas de Pureza
Se realizara para identificar posibles contaminantes. La metodología consiste en la
siembra de las cepas en los medios de cultivo: agar levadura lactosa (LLA), Luria-Bertani
(LB) y peptona glucosa (PG).
4.1 Medio Luria-Bertani (LB)
✓ Se sembraran las cepas a analizar de un cultivo de 24 a 48h en LMA, se
tomara un poco de cepa con la ayuda del asa de Colle y se sembraran por
estría en el medio LB.
✓ Luego, se incubaran las placas a 28°C por 2 a 15 días. Finalmente se
anotara el crecimiento de la cepa.
✓ En este medio de cultivo Rhizobium tiene mucha dificultad de crecer. Por
lo tanto si se observa crecimiento de alguna colonia en este medio, no
corresponde a Rhizobium.
METODOLOGÍA
4.2 Medio Peptona- Glucosa (PG)

✓ Se sembraran las cepas por estría en los medios PG, desde un medio de
Rhizobium creciendo en LMA, se llevaran a incubar a 28°C por 2 a 15 días.
Finalmente se anotara el viraje y crecimiento de la cepa.
✓ Este es un medio nutritivo que utiliza un indicador, el púrpura de

bromocresol, su rango de pH es de 5.2 a 6.8 (debajo de 5.2 vira a amarillo y
sobre 6.8 vira a púrpura).
✓ Si el medio vira de morado a amarillo, la colonia no corresponde a

Rhizobium. Los rizobios se desarrollan bien en este medio de cultivo, pero
no viran el color del medio.
METODOLOGÍA
4.3 Medio Levadura Lactosa Agar (LLA)
✓ El medio utilizado LLA, es el medio LMA con lactosa en lugar de manitol como fuente de
carbono, con una concentración de lactosa en el medio de 10g/L.
✓ Tiene muchas características similares para los rizobios. Este medio permite la
identificación de azúcares que son liberados al reaccionar con la enzima cetolactasa con la
lactosa. Esta enzima es propia de Agrobacterium y los rizobios carecen de esta enzima.
El procedimiento es el siguiente:
✓ Se sembraran las cepas en el medio de cultivo LLA, las placas se incubaran a 28°C por 3
días.
✓ Luego de la incubación, se agregara al medio 10 a 15 mL de reactivo de Benedict. El viraje
amarillo después de 10 minutos indica la presencia de Agrobacterium.
Rhizobium sp.
METODOLOGÍA
Pruebas de Pureza
Se realizara para identificar posibles
contaminantes. La metodología consiste en la
siembra de las cepas en los medios de cultivo:
agar levadura lactosa (LLA)
Luria-Bertani (LB) y
peptona glucosa (PG).
METODOLOGÍA
5. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE Rhizobium
La caracterización fenotípica se realiza a través de la caracterización bioquímica.
5.1 Producción de acidez o alcalinidad
✓ Se sembraran las cepas de rizobios en el medio LMA con azul de bromotimol al 0.5%.
Estas placas Petri serán llevadas a incubar a 28°C por 2 a 12 días.
✓ Los rizobios de crecimiento lento (3 días a más), Bradyrhizobium producen alcalinidad

cuando hay un viraje del medio de verde al azul, mientras que los rizobios de
crecimiento rápido producen acidez y cambian dicha coloración a amarillo.
✓ El rango de viraje del azul de bromotimol es de pH comprendidos entre 6.2 a 7.6,

valores inferiores a 6.2 indican que es un medio ácido y se torna amarillo en cambio
valores por encima de 7.6 se torna azul.
Rhizobium sp.
METODOLOGÍA
5.2 Crecimiento a varios niveles de pH
✓ Se sembrara cada una de las cepas aisladas en medios con diferentes valores de pH
(4, 5, 8 y 8.8) mas el control y se llevaran a incubación a 28°C.
✓ Luego de 2 a 10 días se evaluara el grado de desarrollo de las cepas.
5.3 Crecimiento a varios niveles de temperatura

✓ Las cepas serán sembradas en el medio LMA e incubadas a 8°C, 28°C, 37°C y 40°C.
✓ Luego de 48 horas a 10 días se evaluará el grado de desarrollo de las cepas.

METODOLOGÍA
5.4 Crecimiento a diferentes concentraciones de NaCl
✓ Se cepas que crecieron en el medio LMA con diferentes concentraciones
de NaCl (0.5%, 1% y 2%) y se incubaran todas a 28°C.
✓ Luego se evaluará el grado de desarrollo de las cepas desde 48 horas

hasta 10 días.
✓ Todas estas placas serán comparadas con las placas control (pH 7.0, NaCl
0,02% y 28°C de temperatura).
✓ Estas cepas también serán controladas de 48 horas hasta 10 días.

Rhizobium sp.
BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology - Second Edition - Volume
Two - The Proteobacteria
BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology - Second Edition - Volume Two - The Proteobacteria
BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology - Second Edition - Volume Two - The Proteobacteria
FUENTE: Peña, Haydee B., & Reyes, Isbelia. (2007). Aislamiento y evaluación de bacterias fijadoras
de nitrógeno y disolventes de fosfatos en la promoción del crecimiento de la lechuga (Lactuca
sativa L.). Interciencia, 32(8), 560-565. Recuperado en 20 de mayo de 2020, de
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0378-
18442007000800013&lng=es&tlng=es.
GRACIAS…

Cultivo e Identificacion Rhizobium AV 2020 URP

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Cultivo e Identificacion Rhizobium AV 2020 URP

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD RICARDO PALMA

Facultad de Ciencias Biológicas

Asignatura: MICROBIOLOGIA APLICADA – PRÁCTICA DE LABORATORIO

Mg. Blgo. Juan Carlos Ramos Gorbeña

✓ Su nombre enfatiza la peculiaridad que tiene de nodular las raíces (rhiza:

✓ Forman nódulos de color rosa efectivos en las raíces.

✓ Viven simbióticamente dentro de los nódulos y fijan el nitrógeno.

✓ Convierten el nitrógeno atmosférico en formas accesibles para las plantas.

✓ La mayoría de los rizobios son de naturaleza específica del huésped.

Características del género Rhizobium

✓ Son gramnegativos, de 0.5-1.0 x 1.2-3.0 μm.

Características del género Rhizobium

El manual Bergey de bacteriología Sistemática establece que la familia

✓ Aislar bacterias del género Rhizobium de los nódulos de la raíz

SOLUCIONES Y REACTIVOS MATERIALES

1. Muestreo de plantas, colecta y evaluación de nódulos

✓ Se escogerán aquellas plantas que tengan un buen aspecto

✓ Las muestras serán llevadas al laboratorio en bolsas de

Colonias de la cepas Rhizobium

(A) Corte transversal de nódulos de Cajanus cajan con coloración rojiza

MATERIALES Y MÉTODOS Caracterización morfológica de 20 cepas de Rhizobium colectadas en plantas de frijol

4.2 Medio Peptona- Glucosa (PG)

✓ Este es un medio nutritivo que utiliza un indicador, el púrpura de

✓ Si el medio vira de morado a amarillo, la colonia no corresponde a

✓ Los rizobios de crecimiento lento (3 días a más), Bradyrhizobium producen alcalinidad

✓ El rango de viraje del azul de bromotimol es de pH comprendidos entre 6.2 a 7.6,

✓ Luego de 2 a 10 días se evaluara el grado de desarrollo de las cepas.

5.3 Crecimiento a varios niveles de temperatura

✓ Luego de 48 horas a 10 días se evaluará el grado de desarrollo de las cepas.

✓ Luego se evaluará el grado de desarrollo de las cepas desde 48 horas

✓ Estas cepas también serán controladas de 48 horas hasta 10 días.

También podría gustarte