Detección de Salmonella a partir

de alimentos
Método tradicional
Ma Ofelia Rodríguez García

Dra. Julia Aurora Pérez Montaño

M. En C. Jorge Adrián Muñiz Flores

 Aislamiento, identificación y recuento

• A partir:
– alimentos, agua, especímenes humanos y
animales, equipo, utensilios y muestras
ambientales

• Es necesidad cotidiana:
– decisivo en el diagnóstico, la prevención y el
control de la salmonelosis
 Aislamiento de Salmonella de alimentos
inertes vs especímenes humanos
Razones de las diferencias:
• El germen suele encontrarse en números muy
reducidos (una o unas cuantas células en 25 a 500 g)
• Células dañadas (calor, frío, desecación, radiaciones,
germicidas)
• Requieren de un tratamiento restaurador
• Los alimentos son matrices complejas, pueden
interferir con los métodos de detección.
 Detección. Tradicional
Etapas
Pre-enriquecimiento

Enriquecimiento

Aislamiento en medios selectivos

Identificación bioquímica

Pruebas complementarias

Serología
Factores que influyen en las técnicas para
investigar Salmonella
• Variantes en la preparación de la muestra
– Homogeneizado en licuadora
– Inmersión en caldo de preenriquecimiento durante la incubación
– Stomacher
– Enjuague con agitación
– Torunda de Moore
– Filtración por membrana
– Enjuague o inmersión de canales de pollo en bolsa
• Composición química del alimento
– Aletargamiento fisiológico de células presentes
– Efecto adverso de los componentes del alimento sobre la selectividad del
medio de enriquecimiento
• Diferentes técnicas de pre-enriquecimiento
• Adición de sustancias químicas neutralizantes
– Grenetina/gelatinasa
– Grasa/tween 80
• Cantidad de alimento analizado
– sensibilidad
– Aumentar el tamaño de la alícuota o el número de alícuotas analizadas
Factores que influyen en las técnicas para
investigar Salmonella
• Tipo y abundancia de flora asociada
– tipo de caldo de enriquecimiento
• Número de salmonelas presentes y homogeneidad de su
distribución
– Las técnicas
– Análisis por separado de ingredientes, mayor tamaño de muestra
• Vitalidad de las células en la muestra
– Agentes físicos y químicos en dosis subletales - susceptibilidad a
sustancias selectivas de medios de cultivo
– Sales biliares
– Efectos de calor, liofilozación
– Poner de manifiesto células afectadas- restauración
• Serotipos de Salmonella involucrados
– Diferencia en grado de tolerancia a agentes selectivos
Factores que influyen en las técnicas para
investigar Salmonella
• Efecto del pre-enriquecimiento
– Alimentos: Número escaso, merma de su vitalidad.
– Procesamiento de alimentos. Estrés celular. Flora asociada.
– Según alimento
• Agua destilada con verde brillante (cárnicos, leche polvo)
• Caldo lactosado con tergitol (huevo en polvo)
• Agua peptonada (jamón cocido)
• Caldo lauril (alimentos grasosos)
• Leche (chocolate)
• Caldo nutritivo ajuste pH*
• Efecto del Enriquecimiento
– Algunos pierden poder selectivo con el alimento
• Diferentes para cada tipo de alimento. Diferentes condiciones: concentración del
inóculo, temperatura, tiempo incubación
– Dos grupos de medios:
• Originalmente: Tetrationato y Selenito
• Ahora: Tetrationato y Rapapport
• Efecto de la temperatura
 Aislamiento de Salmonella a partir de
alimentos
• Etapa
– Preparación de la muestra
• Acondicionar la muestra para liberar, separar o
concentrar las salmonelas antes de inocularla a los
medios de enriquecimiento (o pre-enriquecimiento).
Etapa
Pre-enriquecimiento
• Restituir la vitalidad de las células de Salmonella
dañadas.
• Está contraindicado en productos con alta carga
bacteriana a menos que se utilicen periodos de
incubación cortos o elevada temperatura de
incubación.
Etapa
Enriquecimiento

• Favorecer el desarrollo de Salmonella e impedir a la

vez el de la flora asociada.
• La influencia de la composición del alimento y de la
susceptibilidad del o de los serotipos presentes
obliga el empleo simultaneo de dos medios de
cultivo para cada muestra.
• En ciertos productos la incubación a 43° mejora la
positividad de la prueba.
Etapa
Aislamiento

Pérez et al., 2009

• Obtener un desarrollo de las salmonelas

presentes, aislado de la flora asociada.
• Favorecer la aparición de las características
discriminatorias de las colonias de ambos
tipos de microorganismos.
 Aislamiento en medios selectivos
• Tres grupos:
– Ligeramente selectivos
• Endo, EMB, MacConkey
– Moderadamente
selectivos
• DCLS, desoxicolato
citrato, SS y XLD
– Fuertemente selectivos
• Verde brillante, sulfito de
bismuto

• Ningún agar es ideal para todas las situaciones, uso de dos o más
medios selectivos
• Adicionados de: antibióticos, surfactantes y otras sustancias químicas.
Etapa
Identificación bioquímica (Género y especie)

• Ensayar una lista de pruebas bioquímicas

para perfilar al género. Son insuficientes
por sí solas, aún tratándose de cepas con
típica morfología colonial, para
identificar al germen.
Identificación bioquímica con sistemas
miniaturizados
Etapa
Serología somática
• Demostrar por aglutinación la presencia
de antígenos somáticos de Salmonella.
Otros microorganismos pueden
aglutinar; por sí sola, en consecuencia,
tampoco decide el diagnóstico.
Etapa
Serología Flagelar
• Demostrar por aglutinación la presencia
de antígenos muy específicos entre los
miembros del género a fin de identificar
al serotipo.
 Identificación serológica
≈200 antisueros para serotipificación
Sólo con fines de investigación epidemiológica
Aglutinación en látex
Etapa
Fagotipia

• Identificar el tipo fágico al

que corresponde el serotipo
aislado. Se aplica en algunas
investigaciones
epidemiológicas especiales
para rastrear fuentes de
contaminación y
mecanismos de
Vidas UP
diseminación.
 Métodos oficiales
USDA-FSIS
MLG 4.07
Title: Isolation And Identification of Salmonella From Meat, Poultry, Pasteurized Egg,
and Catfish Products and Carcass and Environmental Sponges
Revision: .07
Replaces: MLG 4.06
Effective: 10/01/2013
BAM
February 2014 Version
Bacteriological Analytical Manual
Chapter 5
Salmonella
Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la
determinación de Salmonella en Alimentos
AOAC
ICMSF
CODEX Alimentarius Commission
ISO
 Aislamiento e identificación de Salmonella
Muestra (25 g)

225 ml Agua peptonada

amortiguada

35°C / 24 h + 2 h

Caldo Rappaport- Caldo Tetrationato B

Vassiliadis (42 °C / 24±2h) Verde brillante (35°C / 24± 2h) baja carga A
(43°C / 24± 2h) alta carga M

Double Agar Agar Agar Sulfito Agar Agar

U modified lysine XLT4 Verde de Bismuto XLT4 Verde
iron agar brillante sulfa brillante sulfa
S
D XLD HE
A 35°C / 24-48 h
Colonias sospechosas

Pruebas bioquímicas y serología

Medios selectivos para Salmonella
Re-Aislamiento en medios selectivos
cromogénicos
 Atypical Salmonella Colony Morphology
BAM 8° ed. February, 2014 Version

• In the absence of typical or suspicious Salmonella

colonies, search for atypical Salmonella colonies as
follows:
• HE and XLD agars. Atypically a few Salmonella cultures produce
yellow colonies with or without black centers on HE and XLD agars.
In the absence of typical Salmonella colonies on HE or XLD agars
after 24 ± 2 h incubation, then pick 2 or more
atypical Salmonellacolonies.
• BS agar. Atypically some strains produce green colonies with little
or no darkening of the surrounding medium. If typical or
suspicious colonies are not present on BS agar after 24 ± 2 h, then
do not pick any colonies but reincubate an additional 24 ± 2 h. If
typical or suspicious colonies are not present after 48 ± 2 h
incubation, then pick 2 or more atypical colonies.
Swarming de Proteus spp
 Realizar actividad sobre
fundamentos de los medios de
cultivo empleados para el
aislamiento e identificación de
Salmonella
 Difco™ Rappaport-Vassiliadis R10
Broth
Formula
Difco™ Rappaport-Vassiliadis R10
Broth
Approximate Formula* Per Liter
Pancreatic Digest of Casein...... 4.54 g
Sodium Chloride......................... 7.2 g
Monopotassium Phosphate..... 1.45 g
Magnesium Chloride (anhydrous)..
……………………………………………….13.4 g
Malachite Green Oxalate...... 36.0 mg
*Adjusted and/or supplemented as
required to meet performance
criteria.
Principles of the Procedure
Rappaport-Vassiliadis R10 Broth
contains :
peptone as the carbon and nitrogen
source for general growth
requirements.
Magnesium chloride raises the
osmotic pressure in the medium.
Malachite green is inhibitory to
organisms other than salmonellae.
The low pH of the medium,
combined with the presence of
malachite green and magnesium
chloride, helps to select for the
highly resistant Salmonella spp. vs G-
 Difco™ TT Broth Base, Hajna
Formula
Difco™ TT Broth Base, Hajna
Approximate Formula* Per Liter
Yeast Extract…................................... 2.0 g
Tryptose.......................................... 18.0 g
Dextrose............................................ 0.5 g
D-Mannitol........................................ 2.5 g
Sodium Desoxycholate..................... 0.5 g
Sodium Chloride............................... 5.0 g
Sodium Thiosulfate......................... 38.0 g
Calcium Carbonate......................... 25.0 g
Brilliant Green................................ 0.01 g
*Adjusted and/or supplemented as
required to meet performance criteria.
Principles of the Procedure
Peptone provides nitrogen and amino acids.
Yeast extract supplies growth factors and
vitamins. Dextrose and mannitol are
fermentable carbohydrates. Selectivity is
accomplished by the combination of sodium
thiosulfate and tetrathionate, suppressing
coliform organisms. Tetrathionate is formed
in the medium by the addition of a solution
containing iodine and potassium iodide.
Organisms containing the enzyme
tetrathionate reductase will proliferate in
this medium; VS enzimas, Tio-Te 3:1.
Sodium desoxycholate and brilliant green
are selective agents that suppress coliform
bacteria and inhibit gram-positive
organisms. Sodium chloride maintains the
osmotic balance of the medium. Calcium
carbonate is a neutralizer that absorbs toxic
metabolites.
 Difco™ Hektoen Enteric Agar
Formula
Difco™ Hektoen Enteric Agar
Approximate Formula* Per Liter
Proteose Peptone............ .............. 12.0 g
Yeast Extract...................................... 3.0 g
Bile Salts No. 3.................................. 9.0 g
Lactose............................................ 12.0 g
Saccharose...................................... 12.0 g
Salicin................................................ 2.0 g
Sodium Chloride............................... 5.0 g
Sodium Thiosulfate........................... 5.0 g
Ferric Ammonium Citrate................. 1.5 g
Agar................................................. 14.0 g
Bromthymol Blue......................... 65.0 mg
Acid Fuchsin...................................... 0.1 g
*Adjusted and/or supplemented as
required to meet performance criteria.
This medium contains three carbohydrates,
lactose, sucrose (saccharose) and salicin, for
optimal differentiation of enteric pathogens
by the color of the colonies and of the
medium adjacent to the colonies. The lactose
concentration is higher than in many other
media used for enterics in order to aid in the
visualization of enteric pathogens and
minimize the problem of delayed lactose
fermentation. Ferric ammonium citrate and
sodium thiosulfate in the medium enable the
detection of hydrogen sulfide production,
thereby aiding in the differentiation process
due to the production of blackcentered
colonies. The indicator system, consisting of
acid fuchsin and bromthymol blue, has a lower
toxicity than that of many other enteric
media, resulting in improved recovery of
enteric pathogens.
 Difco™ MacConkey Agar
Formulae
Difco™ MacConkey Agar
Approximate Formula* Per Liter
Pancreatic Digest of
Gelatin............................................ 17.0 g
Peptones (meat and casein)............. 3.0 g
Lactose............................................ 10.0 g
Bile Salts No. 3.................................. 1.5 g
Sodium Chloride............................... 5.0 g
Agar................................................. 13.5 g
Neutral Red..................................... 0.03 g
Crystal Violet.................................. 1.0 mg
Principles of the Procedure
Peptones are sources of nitrogen and other
nutrients.
Yeast extract is a source of trace elements,
vitamins, amino acids and carbon.
Lactose is a fermentable carbohydrate.
When lactose is fermented, a local pH drop
around the colony causes a color change in
the pH indicator (neutral red) and bile
precipitation.
Bile salts, bile salts no. 3, oxgall and crystal
violet are selective agents that inhibit growth
of gram-positive organisms.
Sodium chloride maintains osmotic balance
in the medium. Magnesium sulfate is a
source of divalent cations. Agar is the
solidifying agent.
 Difco™ XLD Agar
Difco™ XLD Agar
Approximate Formula* Per Liter
Xylose................................................ 3.5 g
L-Lysine............................................. 5.0 g
Lactose.............................................. 7.5 g
Saccharose........................................ 7.5 g
Sodium Chloride............................... 5.0 g
Yeast Extract...................................... 3.0 g
Phenol Red...................................... 0.08 g
Sodium Desoxycholate…................... 2.5 g
Ferric Ammonium Citrate................. 0.8 g
Sodium Thiosulfate........................... 6.8 g
Agar................................................. 13.5 g
*Adjusted and/or supplemented as
required to meet performance criteria.
Principles of the Procedure
Xylose is incorporated into the medium because it is
fermented by practically all enterics except for the
shigellae. This property enables the differentiation
of Shigella species. Lysine is included to enable the
Salmonella group to be differentiated from the
nonpathogens. Without lysine, salmonellae rapidly
would ferment to add to the differentiating ability
of the formulation, and H2S indicator system,
consisting of sodium thiosulfate and ferric
ammonium citrate, is included for the visualization
of the hydrogen sulfide produced, resulting in the
formation of colonies with black centers. The
nonpathogenic H2S producers do not decarboxylate
lysine; therefore, the acid reaction produced by
them prevents the blackening of the colonies.
Sodium chloride maintains the osmotic balance.
Yeast extract supplies B-complex vitamins which
stimulate bacterial growth. Agar is the solidifying
agent. XLD Agar is both a selective and differential
medium. It utilizes sodium desoxycholate as the
selective agent and, therefore, it is inhibitory to
gram-positive microorganisms.
 Difco™ SS Agar
Formulae
Difco™ SS Agar
Approximate Formula* Per Liter
Beef Extract....................................... 5.0 g
Proteose Peptone............................. 5.0 g
Lactose............................................ 10.0 g
Bile Salts No. 3.................................. 8.5 g
Sodium Citrate.................................. 8.5 g
Sodium Thiosulfate........................... 8.5 g
Ferric Citrate..................................... 1.0 g
Agar................................................. 13.5 g
Brilliant Green.............................. 0.33 mg
Neutral Red.................................. 25.0 mg
Principles of the Procedure
SS Agar and Salmonella Shigella Agar are
designated as moderately selective media
based upon the degree of inhibition of gram-
positive microorganisms that they inhibit due
to their content of bile salts, brilliant green
and citrates. Differentiation of enteric
organisms is achieved by the incorporation
of lactose in the medium. Organisms that
ferment lactose produce acid which, in the
presence of the neutral red indicator, results
in the formation of red colonies. Lactose
nonfermenters form colorless colonies. The
latter group contains the majority of the
intestinal pathogens, including Salmonella
and Shigella. The sodium thiosulfate and
ferric citrate enable the detection of
hydrogen sulfide production as evidenced by
colonies with black centers.
 Difco™ Bismuth Sulfite Agar
Formula
Difco™ Bismuth Sulfite Agar
Approximate Formula* Per Liter
Beef Extract................................... 5.0 g
Peptone........................................... 10.0 g
Dextrose............................................ 5.0 g
Disodium Phosphate......................... 4.0 g
Ferrous Sulfate.................................. 0.3 g
Bismuth Sulfite Indicator................... 8.0 g
Agar................................................. 20.0 g
Brilliant Green.............................. 25.0 mg
*Adjusted and/or supplemented as
required to meet performance criteria.
In Bismuth Sulfite Agar, beef extract and
peptone provide nitrogen, vitamins and
minerals. Dextrose is an energy source.
Disodium phosphate is a buffering agent.
Bismuth sulfite indicator and brilliant
green are complementary in inhibiting
gram-positive bacteria and members of
the coliform group, while allowing
Salmonella to grow luxuriantly. Ferrous
sulfate is included for detection of H2S
production. When H2S is present, the
iron in the formula is precipitated, giving
positive cultures the characteristic
brown to black color with metallic
sheen. Agar is the solidifying agent.
 BG Sulfa Agar
Formulae
Difco™ BG Sulfa Agar
Approximate Formula* Per Liter
Yeast Extract .................................... 3.0 g
Proteose Peptone No. 3 ................ 10.0 g
Lactose .......................................... 10.0 g
Saccharose ..................................... 10.0 g
Sodium Sulfapyridine ...................... 1.0 g
Sodium Chloride .............................. 5.0 g
Agar ................................................ 20.0 g
Brilliant Green ............................ 12.5 mg
Phenol Red ..................................... 0.08 g
Principles of the Procedure
In BG Sulfa Agar, peptone and yeast extract
provide nitrogen, vitamins and minerals.
Lactose and sucrose are the sources of
carbohydrates in the medium. Brilliant green
and sodium pyridine are complementary in
inhibiting gram-positive bacteria and most
gram-negative bacilli other than Salmonella
spp. Phenol red is the pH indicator that turns
the medium a yellow color with the formation
of acid when lactose and/or sucrose is
fermented. Agar is the solidifying agent. Yeast
extract is the vitamin source. D-Mannitol is the
carbon source to stimulate organism growth.
Sodium taurocholate, sodium selenite and
brilliant green are the selective agents. The
selective agents are used to inhibit gram-
positive organisms and enteric bacteria other
than Salmonella. Sodium sulfapyridine is added
to increase selectivity.
Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella,
Proteus mirabilis y Citrobacter freundii

Pruebas bioquímicas Salmonella Proteus Citrobacter

enterica mirabilis freundii
subesp.
enterica (I)
SH2 (TSI) + + + + +
Urea (hidrólisis) - d - + D
Lisina decarboxilasa + - + - -
Ornitina decarboxilasa + d + + D
Lactosa (fermentación) - d - - D
Sacarosa (fermentación) - d - D
Dulcita (fermentación) + d + - D
Malonato (fermentación) - d - D
ONPG - - +
 Métodos alternativos
• Anticuerpo fluorescente • Identificación rápida:
• Inmunodifusión – API 20 E
• Filtro por membrana – Enterobacteriacea II
hidrofóbica – Enterotube II
• Pruebas con fagos de – Sistema MICRO-ID
Salmonella – Minitek
• Prueba de la – Vitek GNI
Inmunoabsorción ligada a
enzimas (ELISA)* • Coductancia
• Pruebas de hibridación • Electroforesis de campo
DNA/DNA (DNAH)* pulsado (PFGE)
* Aprobadas por Association of Official
Analytical Chemists
 Métodos rápidos
• Término subjetivo utilizado indistintamente para
describir una gran cantidad de pruebas
microbiológicas que son modificaciones de
pruebas convencionales para agilizar la obtención
de resultados.
• Algunas de estas pruebas también se han
automatizado para reducir manipulación manual.

• Ahorro: tiempo y trabajo.

 Dogma central
Replicación
DNA de DNA

Métodos Transcripción
moleculares

mRNA
Traducción

Métodos Proteínas/
clásicos Enzimas

Toxinas y
otros
metabolitos
 Conclusiones Métodos rápidos
• No siempre es “rápido”
– Requiere métodos de pre-enriquecimiento y
enriquecimiento con periodos de incubación igual
que en el método oficial.
– Requiere de preparación de la muestra después
del enriquecimiento.
– El tiempo “anunciado” en obtener el resultado
puede variar de minutos a horas, que concuerda
con el tiempo del último paso requerido para la
identificación del microorganismo de interés.
 Conclusiones
• Los métodos rápidos generalmente se utilizan
como técnicas de “screening”, los resultados
negativos se aceptan como tal. Sin embargo,
los resultados positivos requieren
confirmación por el método oficial apropiado,
que en muchas veces, requiere técnicas de
cultivo.
• En muchas ocasiones, el método rápido no ha
sido validado.