TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE OAXACA

INGENIERIA QUÍMICA
DESARROLLO SUSTENTABLE
HORARIO: 02:00-03:00 pm

UNIDAD V: “ESCENARIO MODIFICADO”

ACTIVIDAD 4: "REPORTE DE PRÁCTICA AISLAMIENTO DE

RHIZOBIUM”

INTEGRANTES:
1. CRISOSTOMO MENDOZA EMILI JAQUELINE
2. HERNÁNDEZ PALMA ANA LUZ
3. GONZÁLEZ MARTÍNEZ MARCOS DANIEL
4. MENDOZA LUIS CLARA JHOANNA
5. REYES AYUSO MIRIAM
GRUPO: 5Q-C

DOCENTE: DRA. LÓPEZ SÁNCHEZ CLAUDIA

LUNES 05 DE DICIEMBRE DEL 2022
 INTODUCCION
Las cepas de Rhizobium se obtienen de los nódulos de las leguminosas. Al
seleccionar los nódulos para aislar la sepa es necesario tomar en cuenta que los
nódulos sean grandes, de color rosado, superficie rugosa y con estrías claras o
blancas más acentuadas. La coloración interna roja, producida por la
legehemoglobina, indica que hay actividad de la nitrogenasa y en consecuencia,
fijación biológica de nitrógeno.

OBJETIVO
Aislar e identificar bacteroides del genero Rhizobium a partir de nódulos radicales
de las leguminosas.

PROCEDIMIENTO
MATERIAL
-Matraces Erlenmeyer de 500 ml
-Vasos de precipitado cubiertos con gasa
-Tubos de ensayes estériles
-Gasa
-Varilla de vidrio
-Cajas petri
-Porta objetos
-Asas bacteriológicas
REACTIVOS
-Medio ELMARC
-Medio ELMATBT
-Medio CELM
-Bicloruro mercurio al 0.1 %
PARTE 1
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTEROIDES DE GENERO
RHIZOBIUM
1. Identificar nódulos, separando los nódulos más grandes y de color rosado,
cuidando de dejar un pequeño fragmento de raíz adherido al nódulo.

2. Lavar al chorro de agua y separar (con el objetivo de eliminar los restos de

suelo)
3. Colocar en el vaso de precipitado estéril con pinzas flameadas en ambiente
aséptico

4. Agregar Cloralex y dejar actuar 10 segundos

5. Lavar con agua destilada estéril
 6. Agregar etanol y dejar actuar por un minuto

Lavar por tres ocasiones de forma continua

7. Colocar en el tubo de ensaye que contiene 1 ml de H2O destilada estéril

8. Hacer diluciones hasta 1x 10 ^-0.3 con 0.5 ml

9. Una vez colocadas en el tubo de ensayo son machacadas (trituraron uno a
uno con ayuda de una varilla de vidrio estéril)

10. Inocular 50ml de cada una de las diluciones con una caja Petri con medio
ELMARC

PARTE 2
 SIEMBRA EN EL AGAR (SIEMBRA POR ESTRÍA)

11. Marcar las diluciones con su factor correspondiente

12. Marcar las placas Petri que contienen el medio de cultivo para aislamiento.
Los rótulos deben ser nombrados como Rhizobium ELMAR 09/11/22 con el
factor correspondiente a agregar.

En condiciones de esterilidad se hará un barrido en las cajas Petri con la dilución.

13. Transferir con una pipeta estéril 5 ml de cada dilución de la muestra, a una
serie de placas Petri

14. Con ayuda de una espátula drigalsky o rastrillo bacteriológico en vidrio estéril
se reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Esta asa tiene que
sumergirse en alcohol y flamear esperar aproximadamente 20 s y después
de esto repartir por la superficie.
15. Después de esto se cierran las cajas Petri y se sellan con papel film
transparente.

16. Incubar las placas, a una temperatura de 28°C

17. Posteriormente al periodo de incubación, se examinan las placas. Las
colonias se caracterizan, es decir se realiza la caracterización morfológica de
Rhizobium.
 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE RHIZOBIUM
CARACTERÍSTICAS CAJA 1 CAJA 2 CAJA 3
Número de colonias 2 incontable incontable
Tamaño Grande Chico chico
Color rosa Blanco Blanco opaco
transparente
Forma Circular Irregular irregular
Elevación Sí Sí Sí
Borde ondulado ondulado ondulado
Superficie Liso Liso Liso
Aspecto Húmedo Húmedo Húmedo
Luz transmitida Opaca Opaca Opaca
Luz reflejada Mate Mate Mate
Consistencia Suave Suave Suave

A) Morfología macroscópica

En el medio ELMARC, las colonias presentan regularmente morfología convexa,

pulvinada o cónica; su color es variante desde blanco opaco hasta translucido
acuoso, salvo algunas excepciones que presentan colonias rosas o rojas e incluso
amarillas. Las colonias opacas tienen desarrollo firme y con algo de goma mientras
que las colonias menos densas son a menudo gomosas y blandas, en ocasiones
las colonias de mayor edad pueden desarrollar centros oscuros. Los contaminantes
comúnmente son de color rojo oscuro.
B) Morfología microscópica
Colocar una gota de agua destilada en el centro del portaobjetos y en ella hacer
una ligera sepa de suspensión de la sepa a observar, deja secar la gota a
temperatura ambiente y proceder a fijarla con una ligera flama del mechero. Una
vez fijado el frotis, se proceda a teñirlo con los colorantes de gram. En este frotis se
observará morfología, inclusiones de polihidroxibutirato y la reacción positiva o
negativa que da la bacteria a la tinción.
 ANÁLISIS DE RESUTADOS

Dentro de las características microscópicas

podemos observar que tenemos bacterias del
tipo Gram negativo lo cual coincide en primera
parte con la bibliografía referida al Genero
Rhizobium, morfológicamente en esta muestra
podemos ver que son estreptobacilos.

En esta segunda muestra observamos

solamente bacilos exparcidos en toda el
área, además de que volvemos a observar el
color rojo por la tinción característica por las
bacterias Gram negativas.

En esta muestra podemos observar

notoriamente un grupo de bacterias Gram
positivas siendo una contaminación dentro
del cultivo por algún otro tipo de bacteria que
pueda tener los mismos requerimientos de
agar el las bacterias Gram negativas del
Genero Rhizobium.
En esta muestra se vuelve a observan con
claridad la morfología de estreptobacilos
confirmando que el genero y las especie
que se encuentra en los nódulos de las
raíces de garbanzo son Gram negativas
haciendo referencia a la bibliografía
consultada.

CONCLUSIÓN

El rizobio es un habitante natural del suelo que subsiste como heterótrofo, pero no
necesariamente existe en todo los suelos como podemos observar en la búsqueda
previa a la práctica por la estación del año fue difícil el encontrar suelos con
leguminosas que tuvieran en sus raíces la asociación de las bacterias del género
Rhizobium, en cuanto a la siembra de los macerados obtenidos por los nódulos de
la bacteria benéfica en las raíces de garbanzo, observamos claramente la existencia
de la bacteria en los medios de cultivo dando como resultado la identificación de las
bacterias y su clasificación por medio de la Tinción de Gram, confirmando que estas
pertenecen a las Gram negativas, por ultimo se logró diferenciar dos tipos de
Rhizobium una con una morfología de bacilos y la otra de estreptobacilos, a fines
de muestreo del suelo podemos decir que el terreno en que se recolectaron las
muestras de los nódulos podemos decir que es altamente eficiente pues en
comparación con algún otro cultivo que no contenga estas bacterias puede estar
asimilando un 60 a 80 porciento mas de nitrógeno generando un mejor cultivo y
mejor cosecha.
 BIBLIOGRAFIA
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