Aspectos teóricos y prácticos de medios de

cultivo para identificar enterobacterias,

pruebas bioquímicas y prueba de oxidasa

Integrantes:
➢ Aranda Vilchis Karen América
➢ Barrera Lira Cristian Omar
➢ Martínez Hernández Lidia Sofía
➢ Ramírez Gutiérrez Hiram Mauricio
➢ Sandoval Espinosa Carlos
Equipo 6
 Conjunto de nutrientes, factores de

Medios de Cultivo crecimiento y otros componentes que

crean las condiciones necesarias para el
desarrollo de los microorganismos.

Constituyentes habituales
Tipos de Medios de Cultivo
de los Medios de Cultivo

➢ Agar ➢ Medios generales

➢ Extractos ➢ Medios de Enriquecimiento
➢ Peptonas ➢ Medios Selectivos
➢ Fluidos corporales ➢ Medios Diferenciales
➢ Sistemas Amortiguadores
➢ Indicadores de pH
➢ Agentes Reductores
➢ Agentes Selectivos
 Preparación de
Medios de Cultivo
 Medio de cultivo selectivo
Son ideales para sembrar
Son aquellos agares y caldos que
pruebas polimicrobianas,
permiten el crecimiento de un tipo de
permitiendo recuperar el
microorganismos determinado,
patógeno buscado entre la
inhibiendo el desarrollo de los demás.
microbiota acompañante

➢ Digerido pancreático de caseína

Se fundamentan en contener SUSTANCIAS
➢ Extracto de levaduras
sustancias nutritivas que NUTRITIVAS
➢ Polipeptonas
favorezcan el crecimiento de una
bacteria u hongo específico, y al
mismo tiempo deben contener
sustancias inhibidoras que no ➢ Antibióticos
permitan el desarrollo de otros ➢ Sales biliares
SUSTANCIAS ➢ Verde brillante
microorganismos no deseables INHIBIDORAS ➢ Cristal violeta
➢ Azul de metileno
➢ Citrato de amonio, entre otros
Agar MacConkey
➔ Agar selectivo para las bacterias
gram negativas y diferencial
para distinguir las bacterias que
fermentan lactosa y las que no.

➔ Incluye peptonas digeridas, sales

biliares, lactosa, rojo neutro y
violeta cristal.

➔ Las bacterias que fermentan la

lactosa producen acidos, que
precipitan las sales biliares y
provocan un color rojo del
indicador rojo neutro.
Agar EMB (Eosina azul de Metileno)
➔ Este medio de cultivo permite una
diferenciación muy clara entre las
colonias de organismos fermentadores
de lactosa y aquellos que no la
fermentan; el contenido de eosina y azul
de metileno inhibe en cierto grado
organismos Gram positivos.

➔ Contiene una mezcla de peptonas y

presenta dos carbohidratos lactosa y
sacarosa.

➔ Este medio permite que se observen

claramente sus colonias, las cuales
desarrollan un color brillante negro
verdoso
Agar Sal y Manitol
➔ Medio selectivo empleado para aislamiento de
estafilococos a partir de diversas muestras
➔ La degradación del manitol con producción de
ácido cambia el color del medio, de rosado a
amarillo.
➔ La formación de colonias de estafilococos no
patógenos son de tamaño pequeño rodeadas
de una zona roja. Los estafilococos patógenos
producen ácido del manitol, desarrollan
colonias más grandes rodeadas de una zona
amarilla.
➔ La elevada concentración de cloruro de sodio
inhibe a la mayoría de las bacterias que son
halo-sensibles y favorecen a los estafilococos
halo- resistentes.
Agar Verde Brillante
➔ Medio selectivo para el aislamiento de
cepas del género Salmonella.

➔ Contiene verde brillante como sustancia

inhibidora. Esta impide el desarrollo de las
bacterias Gram positivas y un gran número
de microorganismos Gram negativos

➔ Los nutrientes los aporta el extracto de

levadura y dos peptonas; la lactosa y
sacarosa con rojo fenol forman un sistema
de diferenciación para excluir los
fermentadores de lactosa o sacarosa (por
ej., E. coli), mientras que las salmonellas no
producen ácidos a partir de estos
azúcares.
Agar SS
➔ Medio selectivo para el aislamiento de los
géneros Salmonella y Shigella.

➔ Contiene sustancias inhibidoras, tales como

sales biliares, citrato de sodio y verde brillante.
Estas sustancias suprimen el crecimiento de
bacterias Gram positivas, ciertas bacterias
Gram negativas y algunos coliformes.

➔ Por ser un medio altamente selectivo, algunas

pocas cepas de Shigella pueden no desarrollar
adecuadamente en el mismo.

➔ Ocasionalmente pocos microorganismos no

patogenos pueden desarrollar pero son
facilmente diferenciados por su capacidad de
fermentar lactosa.
 Medio de cultivo diferencial
Son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre varios
géneros y especies de microorganismos. por su crecimiento
diferencial en el mismo, usando las propiedades metabólicas de
ambos en presencia de un determinado nutriente.

Contienen sustancias que ponen de manifiesto alguna característica de la

especie o grupo de microorganismos. Por ejemplo, el agar MacConkey
contiene lactosa y rojo neutro (como indicador).
Citrato de Simmons

Este medio nos permite comprobar la capacidad de la bacteria de

utilizar el citrato Como fuente de exclusiva de carbono.

Esta degradación con lleva la alcalinizacion del medio y el viraje

del indicador azul bromotimol de verde a azul prusia

Con este medio podemos diferenciar entre los califormes fecales y

bacterias de los Grupos (Enterobactery y citrobacter así como
algunas de especies del grupo salmonella).
Citrato de Simmons
Para la formula del medio del citrato de Simmons es la siguiente:

● Fosfato dipotasico 1 g
● Cloruro de sodio 5 g
● Citrato de sodio 2 g
● Sulfato de magnesio 0.20 g
● Agar 15 g
● Azul de bromotimol 0.08 g
● Agua destilada 1 L
● PH final= 6.9
Procedimiento
Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de
aislamiento primario y se siembra en forma de estria única en el pico de
flauta (agar inclinado) del tubo de Agar citrato.

El tubo se incuba a 35°c

Durante 24 a 48 hrs
La prueba positiva está representada por la
producción de color azul prusia, en el término de 24 a
48 hrs que indica que el microorganismo en la prueba
ha sido capazDe utilizar el citrato contenido del medio
con formación de productos Alcalinos.
Microorganismos positivos

● Salmonella
● Arizona
● Citrobacter
● Enterobacter
● Klebsiella
● Serratia licuefaciencis
● Pseudomonas cepacia Microorganismos negativos

● Edwasiella
● Yersenia enterocolitica
● Escherichia coli
● Shigella
● Yersenia pseudotuberculosis
● Proteus morganii
SIM: Sulfuro Indol Movilidad
Es un medio semisólido utilizado para la diferenciación de
bacterias entéricas a través de la producción de sulfuro, la
formación de indol y la motilidad.

Determina si un organismo es móvil o inmovil si es capaz de liberar ácido sulfhídrico

Por acción enzimática de los aminoácidos que contiene azufre produciendo una
reacción visible de color Negro y por último en desdoblar el indol de la molécula de
triotofano.
Medios y Reactivos
Caldo de triptofano 1%

● Peptona 2 g
● Cloruro de sodio 0.5 g
● Agua destilada 100 mL
Reactivo de Kovac
● Alcohol amilico 150 mL
● Pdimetilaminobenzaldehido 10 g
● HCl concentrado 50 mL

Reactivo de Ehrlich

● Alcohol etílico 190 mL

● Pdimetilaminobenzaldehido 10 g
● HCl concentrado 50 mL
 Procedimiento

Se siembra el caldo de triptofano con el microorganismo para

Probar e incubar a 35 °c durante 18 a 24 hrs

Una vez transcurrido el tiempo se agregan 1 gota del reactivo

KOVAC haciendo que se realice por la pared del tubo.

LA PRODUCCIÓN DE H2S

+ Ennegrecimiento de la zona de
crecimiento o de todo el medio
Debido a la presencia de tiosulfato
sodico.

- No presenta ningun
cambio de coloración
significativo
MOVILIDAD
+ Se presenta cuando se observa turbidez del
medio de cultivo alrededor Del inserto

- Crecimiento bacteriano acentuado

Siguiendo la línea de siembra

Producción de Indol

Positivo: Anilllo Rojo en la superficie

del medio

Negativo: No se produce color

 Medio de cultivo enriquecido
Medios generales a los que se añaden nutrientes especiales para mantener el
crecimiento de microorganismos heterótrofos exigentes. Ejemplo: el agar sangre
 Características
1.Peptonas
2.Extractos de levadura
3.Digeridos pancreáticos
4.Algunas veces glucosa
 Agar de sangre

● Útil crecimiento de m.o aerobios y

anaerobios exigentes
● Observar las hemólisis: alfa, beta y
gama.
● Ayuda para la clasificación de
Streptococcus.
 PRUEBAS
BIOQUÍMICAS
 Prueba de LIA
Consiste básicamente en demostrar Se utiliza para la separaciòn de
la presencia de la lisina Enterobacterias, especialmente
descarboxilasa, capaz de reaccionar Salmonella, sobre la base de la
con el grupo carboxilo del aminoácido descarboxilación y desaminación de la
L-lisina. lisina, y la producción de H2S.

Inocular e incubar a 35±2 ºC durante 20-40 horas.

Los cultivos que van a producir a la lisina descarboxilasa provocan

una reacción alcalina (color púrpura) en todo el medio.

Los organismos que no descarboxilan a la lisina, producen un plano

inclinado alcalino y un fondo ácido (color amarillo).
 Prueba de LIA
● Las enterobacterias, por fermentación de la glucosa producen ácido, el cual
hace virar el indicador a color amarillo.

● Si la bacteria tiene la lisina descarboxilasa, por la descarboxilación de la lisina

se producirá una amina, lo cual arrojará en el medio un color violeta.
 Agar Hierro de Kliguer
En presencia de tiosulfato en el
medio, algunos microorganismos Específica para la identificación
forman H2S gaseoso, por medio de de enterobacterias y otras
las enzimas tiosulfato y cisteína bacterias Gram negativas.
desulfurilasa.

El gas incoloro se forma en

condiciones ácidas y reacciona con
citrato de amonio férrico para
producir un precipitado de color
negro.
 Prueba TSI
El TSI Agar, es un medio de diferenciación para organismos entéricos gram negativos,
basada en su capacidad para fermentar dextrosa, lactosa y sacarosa y para producir
sulfuro.
 Prueba TSI
0.1% Glucosa y el 1.0% de lactosa y
sacarosa.

Cuando se fermeta la glucosa, el

acido producido se torna amarillo.

Cuando se fermenta la lactosa y

sacarosa, el acido vira a color
amarillo.

ROJO = Cuando no se produce

fermentación de ninguno de los
azúcares.
 Prueba TSI
● Si hay formación de gas en el

proceso de fermentación, en el

fondo del medio se observan

burbujas o ruptura del agar.

● Si las bacteria son productoras

del SH2 este se evidencia como

un precipitado negro en el fondo

del tubo.
 Prueba de la Ureasa
Establece la capacidad de un
organismo para desdoblar la urea,
formando una molécula de dióxido
de carbono y dos moléculas de
amoniaco por la acción de la enzima
ureasa.
Esta actividad enzimática es
característica de todas las especies
de Proteus y se usa sobre todo para
separar este género de otras
enterobacterias

Se cultiva el microorganismo en
agar.

Autoclavado con 50 ml/l de

urea.

Produce amoniaco que hará

variar el color del indicador de
amarillo a rojo.
 Prueba de la Ureasa
● Se va a realizar la siembra en agar urea de Christensen.
● Se introduce el microorganismo a incubación a 35 - 37° C durante 24 horas.
 Prueba de oxidasa Reactivo de oxidasa
de Kovacs

● Formado por diclorhidrato de

Método diagnóstico que evidencia
tetrametil-p-fenilendiamina al 1%.
la presencia del complejo
● Interpretación de 10 a 15 seg.
enzimático citocromo oxidasa.

Induce la transformación del
citocromo reducido a oxidado.
Reactivo de Gordon y
McLeod
● Formado por diclorhidrato de
dimetil-p-fenilendiamina
● Interpretación de 10 a 30 min.
Procedimiento
-Método indirecto sobre papel:
-Método de la placa directa:

10-15 segundos 5-10 segundos

Interpretación

Reacción positiva: cambio de Reacción negativa: no hay

color a lavanda o púrpura cambio de color.
Usos:

Enterobacteria (-) Aeromonas (+)

Neisseria (+) Acinetobacter (-)

Recomendaciones:
● Los reactivos son incoloros, si cambian de color deben ser desechados.
● Medios que contengan glucosa interfieren en la prueba, dando falsamente negativos.
● Los reactivos son inestables y tienden a auto-oxidarse se recomienda congelar
alícuotas de 1 a 2 ml e ir sacando conforme se va necesitando.