LABORATORIO I

Laboratorio de microbiología

Este lugar físico posee diferentes áreas donde se van a llevar a cabo procesos que
permitirán reconocer al agente causal de una patología infecciosas. Los laboratorios
tienen diferentes niveles de complejidad y de bioseguridad biológica para la identificación
de diferentes mo según el riesgo que estos imponen para la salud pública.

La OMS clasificó a los laboratorios según el riesgo de trabajo con distintos grupos de
microorganismos. El nivel de riesgo de los microorganismos se va a asociar a:
- Patogenicidad
- Modo de transmisión
- Potencial de difusión
- Disponibilidad de medidas de prevención y tratamiento
- Resultado potencial de la exposición al MO
Grupo 1  Bacillus subtilis, Escherichia coli NO patógena, Lactobacillus

Grupo 2  patógenos infecciosos que pueden infectar al hombre (bajo riesgo de

propagación entre personas) y animales, por ejemplo: Escherichia coli, Virus Estein Barr,
Virus de sarampión, Salmonella, Virus de Hepatitis B.

Grupo 3  patógenos para hombres y animales, incluye: vitus de la fiebre amarilla,

Mycobacterium tuberculosis, Coronavirus, Virus de la inmuno deficiencia humana.

Grupo 4  unidades de patógenos peligrosos como Ébola, Marburg y virus de la viruela.

Medidas respecto a instalaciones y condiciones ambientales del laboratorio

(independientemente de su complejidad)

 Áreas suficientemente espaciosas

 Las unionen entresuelos, paredes y terchos deben ser cóncavas
 Evitar el uso de cortinas y/o uso de persianas internas
 Paredes, techos, suelo y superficies de trabajo: LISAS
 Evitar uso de maderas rugosas y sin revestimiento
 Minimizar la apertura de puertas y ventanas durante el ensayo
 Contar para lavado de manos del personal con canillas no manuales
 Jabón en dispensadores, toallas descartables
 Evitar la presencia de objetos innecesarios
 Armarios, estanterías y equipos colocados de forma tal que eviten la acumulación
de polvo

Protección personal
Vacunas  cada operador debe tener su carnet de vacunación actualizado

Prácticas conductuales
 NO se debe beber/comer
 NO se debe fumar
 NO se debe tocar nada SIN guantes
 NO se pueden tener accesorios como pulseras a la vista (deben estar debajo del
camisolín)
 El cabellos SIEMPRE debe estar recogido

Cumpliendo todas estas normas y cuidados se trata de minimizar los riesgos de contagio y
que el operador trabaje en un ambiente lo más seguro posible

En laboratorios de MEDIO o ALTO riesgo, luego del trabajo los ambientes son sometidos
a una desinfección con luz ultravioleta.

Aparatos e instrumental del laboratorio

 Microscopio
 Estufas para desarrollo de MO
 Balanza

 Microcentrífugas (10.000 a 14.000 rpms) para colocar tubos ependor

 Soporte con lupa para llevar a cabo recuento de colonias
 Campana de flujo laminar (se trabajan mo de alto riesgo de contagio)
 Mechero eléctrico
 Mechero común de gas

 Gradilla metálica
 Tubos ependor
 Placas de Petri
 Asas de cultivo (tálicas o plásticas) estas pueden terminar en aro (siembra en
sólidos y superficie) o en punta (siempra en profundidad)
 Micropipetas
Áreas del laboratorio de microbiología
1. Toma, recepción y registro de muestras
La muestras se pueden tomar allí mismo en el laboratorio, o ser receptadas si es
que proviente de algún centro de salud. Estas luesgo son registradas en un
sistema informático para posteriormente ser derivadas al área correspondiente
2. Área de procesamiento  es aquí donde se derivan las muestras a:
 Micología
 Virología
 Parasitología
 Bacteriología
 Urocultivos
 Coprocultivos
 Hemocultivos
 Exudados y líquidos de punción
 Micobacterias
 Biología molecular
Dentro de cada una de estas áreas hay material de procesamiento el cual es
exclusivo, los materiales no se pueden compartir entre los distintos sectores.

3. Área de preparación de medios de cultivo y esterilización

Aquí se preparan los medios de cultivo a utilizar en el laboratorio que vienen en
polvo, se dosifica según lo que se desee preparar, se hidratarán, se mezclarán
bien y se esterilizaran en un autoclave.
 Luego fraccionan y colocan en placas de Petri, se someten a una prueba de
calidad y luego son almacenados en un lugar adecuado.

4. Área de depósito y eliminación de residuos

Aquí se almacenan reactivos, generalmente colorantes, medios de cultivo,
ácidos y álcalis (se deben colocar en la parte inferior de los armarios).
Los residuos se desechan en bolsas rojas que se encuentran dentro de
contenedores rígidos, luego se cierran adecuadamente y se depositan en un
área especializada hasta que el personal especializado autorizado las retire.

El laboratorio debe contar con un plan de limpieza y desinfección. Este debe

documentarse en cuanto al procedimiento y monitorearse de modo de demostrar su
efectividad.

Control de calidad en el laboratorio

Todos los procedimientos que se realizan a una muestra desde que esta ingresa hasta
que sale del laboratorio, deben ser susceptibles a controles. Se deben controlar:
 Procedimientos
 Instrumentos y productos
 Técnicas aplicadas por el personal
 Resultados emitidos

Microscopía
Proviene del griego μικρός micrós, 'pequeño', y σκοπέω scopéo, 'mirar'. El microscopio
es un aparato que va a permitir observar una dimensión la cual se encuentra por fuera
del rango de resolución del ojo humano
Límite de resolución del microscopio  es la menor distancia que puede haber entre
dos puntos para ser distinguidos como entidades separadas

Poder de resolución del microscopio  capacidad para distinguir detalles pequeños y

percibir por separado a dos puntos pequeños adyacentes cercanos

+ PODER DE RESOLUCIÓN - LÍMITE DE RESOLUCIÓN

Cuanto MENOR sea la distancia que hay entre dos puntos que se distinguen
separadamente, MAYOR será el poder de resolución del microscopio

El poder resolutivo va a depender de la apertura numérica y de la longitud de onda de la

luz enviada. La apertura numérica es un valor ya determinado entre otros por el diámetro
de la lente.
Microscopios

ÓPTICOS
 De campo claro
 De campo oscuro
 De contraste de fases
 De fluorescencia
 Láser con focal

ELECTRÓNICOS
 De transmisión
 De barrido

MICROSCOPIO ÓPTICO

 Sistema mecánico
 Sistema óptico
 Sistema de ilumnación
Sistema óptico

Objetivos
 ROJO  4X
 AMARILLO  10X Objetivos secos
 AZUL  40X
 BLANCO  100X  Objetivo de inmersión

¿Por qué se usa aceite de inmersión con el objetivo 100x?

Esto se debe a que cuando hay mayor aumento, la distancia focal es muy pequeña y a su
vez la lente del objetivo tiene un diámetro muy pequeño, por lo que los rayos que
atraviesan la muestra y se dirigen al objetivo, atraviesan el vidrio y al pasar al aire se
separan más de lo normal, incluso algunos rayos pueden sufrir una refracción total en la
interface vidrio – aire, lo que lleva a que el objeto observado no se vea nítido.

Al intercalar entre el objetivo y la preparación una gota de aceite de inmersión o aceite

de cedro, el índice de refracción casi iguala al vidrio, y hará que los rayos ya no se desvíen
y llega mayor cantidad de luz al objetivo, lo que mejora la resolución del microscopio.
Se utiliza este aceite que tiene un alto índice de refracción

10x  exploración del preparado

40x  permite observar en detalle células eucariotas (hongos, protozoos y algas)
100x  permite determinar tamaño, forma y detalles de ciertas estructuras de
bacterias, hongos y protozoos
Coloraciones

Estructuras celulares con carga negativa se tiñen con:

 Violeta de Genciana
 Fucsina básica
 Cristal violeta
(Ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos)

Estructuras celulares con carga positiva se tiñen con: Ácido banionicos

 Fusciana ácida
 Eosina

Colorante neutro  Isocianato de azul de metileno

Para que una muestra pueda ser coloreada primero debe ser FIJADA, esto se puede
realizar por métodos físicos (calor) o químicos (alcohol).

Simples  se tiñe todo con un solo colorante

 Azul de metileno

Diferenciales o compuestas  implica más de un colorante, el primario

generalmente el ácido, un mordiente que ayuda a que el colorante primario se fije a los
microorganismos, un decolorante que suele ser alcohol o acetona, y un colorante
secundario básico cuyo color contrasta con el colorante primario.
 GRAM (1° cristal violeta – 2° )
 Ziehl Neelsen (es para microorganismos ácido alcohol resistentes)
Tinciones especiales
Ponen en evidencia estructuras bacterianas por ejemplo la presencia de endoesporas o
flagelos.
Se emplea verde de malaquita y safranina o fucsina.

Tinción negativa
Suele ser útil para poner en evidencia las cápsulas de bacterias y hongos, al ser
estructuras hidrosolubles generalmente se eliminan con las coloraciones habituales. No
se colorea el microorganismo, sino el medio circundante.
Se emplea tinta china o negrosina (insolubles en agua)

Coloración de GRAM

Esta es una coloración compuesta ya que utiliza más de un colorante, y es diferenciasl

porque permite distinguir bacterias en Gram positivas y Gram negativas.
Permite apreciar tamaño, forma, disposición de los microorganismos y la observación de
una microbiota polimicrobiana o monomicrobiana.

Técnica
- Extendido del material en un portaobjeto
- Se fija el preparado con calor, exponiéndolo a la llama de un mechero
- Se colorea
 Se coloca cristal violeta (colorante básico)
 Se deja actuar de 1 a 2 y minutos y se lava
  Se agrega un mordiente (lugol) que actúa aproximadamente 2 minutos
para fijar el colorante primario
 Se lava y se forma un complejo yodo – primer colorante
 Se decolora (alcohol-acetona)
 Se lava
 Se coloca un segundo colorante que puede ser Safranina o Fucsina básica
que se deja actuar durante un minuto
 Se lava
 Se seca
- Se observa al microscopio con el objetivo de inmersión

Las bacterias positivas y negativas se ven de distinto color debido a la composición

química de la pared celular bacteriana, el cristal violeta tiene afinidad por el
peptidoglicano, se forma el complejo yodo-cristal violeta y ocupa todos los espacios de la
pared, pero cuando este se decolora la pared se deshidrata y pierde todo el colorante
debido a que la pared se desorganiza, pero luego al agregar el segundo colorante que las
tiñe de fucsia.

Microscopio de campo oscuro

Posee un condensador paraboloide que hace que los rayos luminosos no penetren
directamente el objetivo si no que oblicuamente iluminen la preparación, viéndose así un
fondo oscuro y microorganismos refringentes. Se pueden observar protozoos y bacterias,
permite ver motilidad y morfología pero no estructuras específicas. Pone en evidencia
triponema pallidum y también se utiliza para el estudio de la biopelícula subgingival.
 Microscopio de inmunofluorescencia

La molécula fluorescente emite una longitud de onda que se encuentra dentro del
espectro visible cuando se le pone una fuente luz ultravioleta. El preparado se va a marcar
con una sustancia fluorescente como isotiocianato de fluoresceína o rodamina que
permiten en caso de presencia de un mo, apreciar la fluorescencia verde manzana o color
rojo según la sustancia empleada.
FLUORESCENCIA: propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando
inciden sobre ellas radiaciones energéticas

 Inmunofluorescencia directa: se detectan antígenos estructurales

 Inmunofluorescencia indirecta: se detectan anticuerpos en el suero del paciente

Microscopio de contraste de bases

Permite la observación de células sin teñir. Hay una modificación en la trayectoria de los
haces de luz que generan contrastes entre la muestra entonces se originan distintos
grados de brillo y oscuridad. El sistema de de este microscopio incluye objetivos
espeeciales y un condensador que hace visibles componenetes celulares que van a diferir
ligeramente en sus índices de refracción. Como la luz es transmitida a través de una
muestra con un índice de refracción diferente al del medio, una parte de esta es luz
refracta debido a distintas densidades y espesor de los componenetes celulares, esa
diferencia entre la luz transmitida y los rayos refractados va a generar una imagen
 Microscopio con focal

Se utiliza para eliminar las estructuras desenfocadas ubicadas por encima y por debajo
del foco, cuyas estructuras interfieren con la imagen obtenida. Este permite obtener una
sección óptica de gran definición, este microscopio posee un rayo láser como sistema de
iluminación, se puede utilizar sistema de rayo laser de multifrecuencia en el rango del
UV, luz visible e infrarrojo, adaptados a distintos marcadores fluorescentes empleados
para el contraste de los componentes celulares. Se produce un barrido poco profundo de
la muestra qyue va iluminando un unto a la vez, y luego el recorrido del rayo de cada
punto genera una imagen bidimensional de alta resolución que el operador puede
observar digitalmente.
Ventajas:
 Puede tomar imágenes de cortes muy finos de muestra
 Permite generar distintas imágenes a distintas profundidades en la muestra
 Crear reproducciones tridimensionales
 Permite estudiar procesos como fagocitosis, apoptosis y comunicaciones
intercelulares
 Microscopio electrónico de transmisión (MET)

Permite la observación de partículas celulares submicroscopicas, este posee una

resolución de aproximadamente 0,1 nanómetro.
La muestra es iluminada por un haz de electrones y la focalización es llevada a cabo por
electromagnetos en lugar de lentes, estos componentes se encuentra sellados dentro de
un tubo en el cual se establece un completo vacío puesto que el aire impide el flujo de
los electrones, es por ello mismo que no se pueden utilizar para ver microorganismos
viables.
Permite estudiar elementos menores a los 2,2 milímetros y observar estructuras celulares
internas. Como la longitud de la radiación de los electrones es mucho más pequeña que
la de la luz visible, y el poder de resolución es inversamente proporcional a la longitud de
onda utilizada, la rresolución de un MET es de aproximadamente 0,5 a 1 nanómetro,
puede amplair una imagen de 10.000 a 100.000 veces, y con diferentes técnicas de
amplificación fotográfica hasta 1.000.000 de veces.
La muestra se somete a cortes ultrafino de entre 20 a 100 nanómetros, es fijada y
deshidratada para que el haz de electrones pase libremente a través de ella, y mientras
pasan las imágenes son formadas dirigiendo los electrones sobre un film fotográfico, de
esta manera hace visible las estructuras internas.

Coronavirus

Microscopio electrónico de barrido (MEB)

A diferencia del MET, aquí los electrones no atraviesan la muestra, por lo que no es
necesario que se encuentre en capas para observarlo. Esta muestra debe ser preparada
disecandose y cubriéndola con un metal pesado (oro,plata,paladio) en una capa fina,
entonces al ser barrida los electrones reproducen una imagen tridimensional al ser
dispersados por el metal por la superficie de la muestra.
Puede amplificar la imagen hasta 200.000 veces
 Bacterias Glóbulo blanco

SARS –CoV-2

Diferencias entre microscopio óptico y electrónico

M. Óptico M. Electrónico
Utiliza luz visible para Utiliza un haz de
Funcionamiento formar una imagen del electrones para formar
objeto bajo estudio una imagen del objeto
bajo estudio
Limitada a la longitud Mayor resolución
Resolución de onda de luz visible debido a la corta
(aprox 500 nm) longitud de onda de los
electrones (aprox
0,005 nm)
Aumento máximo Alrededor de 2000x Alrededor de 2
millones de veces
Costo Relativamente Más costoso que el
económico óptico
Ampliamente utilizado Comunmente utilizado
Uso común en la observación de en la observación de
células y tejidos estructuras a nivel
biológicos atómico y molecular