UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMÒN

FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS

PECUARIAS Y FORESTALES
“DR. MARTIN CARDENAS”

BIOTECNOLOGIA 1
CUESTIONARIO
PRIMER PARCIAL

CARRERA: INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

DOCENTE: ING. JUAN VILLARROEL
PRACTICAS: ING. GINO AGUUIRRE
ESTUDIANTE: JORGE DAVID ROMERO CHAMACA
GRUPO: MARTES 12:45- 14:15

CBBA – BOLIVIA
 CAPITULOI.  
Introducción.
1.- Cuestionario: 
 Realizar un resumen del capítulo o un mapa mental
La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones más
generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micropropagación, a partir de un
fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme, con
plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. El explante más usado para los
procesos de propagación in vitro son las yemas vegetativas de las plantas. Los frascos
que contienen las plantas se ubican en estanterías con luz artificial dentro de la cámara
de crecimiento, donde se fija la temperatura en valores que oscilan entre los 21 y 23°C,
además de controlar la cantidad de horas de luz. Por su parte, el medio de cultivo se
compone de una mezcla de sales minerales, vitaminas reguladores de crecimiento,
azúcar, agua y agar. La composición del medio depende de la especie vegetal y de la
etapa del proceso de micropropagación.
Con finalidad puramente descriptiva se puede clasificar los principales factores no
biológicos que afectaran al desarrollo del cultivo in vitro , incluyendo:
• Ambiente químico
• Composición del medio de cultivo
• pH
• Ambiente físico
• temperatura
• luz y fotoperíodo
• humedad
Dentro del proceso de micropropagación diferenciamos varias fases o etapas:
• 0: Selección y Preparación de la planta madre
• 1: Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de semillas
• 2: introducción del material seleccionado in vitro
• 3: Multiplicación de brotes
• 4: Enraizamiento
• 5: Aclimatación
Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicación de plantas in
vitro ; puede ser aplicada a diferentes especies vegetales, en cada caso se podrán
incluir simplificaciones o cambios de acuerdo a las características de las plantas,
pero en términos generales son comunes al proceso de propagación in vitro .
 Mencione las diferencias entre la propagación vegetativa normal y la Biotecnología.
La propagación vegetativa normal consiste en crear condiciones favorables en el laboratorio para el
desarrollo de meristemos con el fin de obtener plántulas iniciales pero libres de organismos patógenos
que la planta madre podría tener. Permite obtener pequeñas plántulas iguales o semejantes a la planta
madre a partir de pequeños trozos de tejidos, estimulando o induciendo sus capacidades innatas de
multiplicación.

La biotecnología consiste en el uso de técnicas que permiten aprovechar las propiedades y

posibilidades de los mico organismos u cultivos celulares, gracias a la aplicación integrada de los
conocimientos y técnicas de la Bioquímica, microbiología, genética, e ingeniería química.

 Explique qué factores son importantes para el éxito.

A) Determinar cuidadosamente las especies a micro propagarse considerando la demanda de
mercado.
B) Contar con un plantel de plantas madres bajo condiciones controladas.
C) Determinar las condiciones de cultivo que aseguren una alta velocidad de multiplicación para la
especie en cuestión.
D) Contar con una buena estructura de aclimatación (invernadero), con temperatura y humedad
controlada.
 Explique qué desventajas se tendrían en nuestro laboratorio de la Facultad.
  Falta de terminación de construcción.
 Ubicación algo alejada
 Falta de invernaderos para cultivo
 Mantenimiento en los Equipos
 Explique el beneficio para la Universidad de contar con un laboratorio de cultivo de tejidos será: económico,
social para nuestro medio, solo educativo u otro.
El laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Mayor de San Simón empezó a funcionar
desde 1993, a partir de esa fecha ha sido equipada con el tiempo mediante las donaciones de Bélgica,
y hasta ahora sigue siendo una buena infraestructura que por el momento se encuentra en reparación,
a través de tiempo ha sido utilizada para la investigación de diferentes tesis, por lo cual es económico
y esencial para las prácticas de tesistas e investigaciones.
2.- Investigación:
 Buscar en internet, los laboratorios de cultivo de tejidos, que existen en el mercado internacional: para
empresas hortícolas, frutícolas y floricultura.,  
 CAPITULO. II.
Edificaciones y equipos de Laboratorio
1.- Cuestionario: 
 Realizar un resumen del capítulo o un mapa mental.
EQUIPOS DE PROTECCIÓN PERSONAL
 Utilizar antiparras de seguridad para evitar salpicaduras
 No utilizar lentes de contacto, ya que en caso de accidente las salpicaduras de
productos químicos o sus vapores pueden pasar detrás de los lentes y provocar
lesiones en los ojos antes de poder retirar las lentes.
 Se debe usar guardapolvo de mangas largas en el laboratorio.
 La ropa y el calzado deberá cubrir la mayor superficie del cuerpo posible. Por lo
tanto, no llevar ropa corta, ni sandalias.
 El pelo largo supone un riesgo que puede evitarse fácilmente recogiéndolo en una
cola.
 Se recomienda utilizar guantes que correspondan al riesgo al que se está expuesto
(sobre todo cuando se utilizan sustancias corrosivas o tóxicas).
 Evitar que las mangas, puños o pulseras estén cerca de las llamas o de la máquina
eléctrica en funcionamiento.
MANTENIMIENTO DEL LABORATORIO
 Inspeccionar todos los equipos antes de su utilización.
 Para la limpieza, utilizar soluciones limpiadoras que no contenga cromato que son
tóxicos)
 El suelo del laboratorio debe estar siempre seco. Hay que limpiar inmediatamente
cualquier salpicadura de sustancias químicas/agua.
 Todos los aparatos que estén en reparación o en fase de ajuste deben estar
guardados y etiquetados.
NORMAS HIGIÉNICAS - CONDICIONES GENERALES DE TRABAJO
 No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que los alimentos
o bebidas se hayan contaminado con productos químicos.
 Los recipientes de laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y
conservación de alimentos y bebidas, tampoco las heladeras u otras instalaciones
destinadas al empleo de los laboratorios.
 Lavarse las manos después de cada trabajo práctico: y, antes de salir del
laboratorio.
 No fumar en el laboratorio.
 No inhalar, probar u oler productos químicos.
 Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de utilizarlos.
 El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros,
abrigos, bolsas, productos químicos vertidos, exceso de frascos de productos
químicos, equipos innecesarios y cosas inútiles.
 Todos los productos químicos derramados tienen que ser limpiados
inmediatamente.
 Señale las áreas de un laboratorio.
Area de Oficina
Area de lavado de los materiales de vidrio
Area de preparado de los medios nutritivos
Area de Auto anclaje
Area de Flujo Laminar
Area de Crecimiento
Area de Invernadero y Aclimatacion
Area de Vivero
 Que áreas serían las más importantes para un cultivo de tejidos y cuales podríamos obviar. 
AREAS IMPORTANTES
Área de lavado y esterilización
 Área de preparación de medios de cultivos
Área de Incubación
Área de Oficina
Área de Flujo Laminar
Área de Observación y examen
AREAS QUE SE PUEDEN OBVIAR
Área de Cuarentena
Área de almacén
Área de transferencia

 Explique qué equipos son los más importantes y cuales podríamos sustituir u obviar si estaríamos
implementando un Laboratorio con equipos mínimos.
1. En el área de preparación: Refrigerador, balanzas (una macrobalanza y una de precisión), potenciómetro,
plancha eléctrica con agitador magnético, frascos Erlenmeyer (125, 250 y 500 mi), botellas y material de vidrio o
plástico.
2. En el área de lavado y esterilización: Autoclave manual O automático grande o de mesa, destilador de vidrio,
gradillas para secado, bandejas de aluminio y de plástico de varios tamaños, recipientes de plástico grandes,
estufas para esterilización y secado.
3. En el área de trasferencia: Gabinete de flujo laminar ; microscopio de disección con luz incidente, e
instrumentos de disección: cuchillas no. 10 y no. 11, mangos para cuchillas, agujas de disección, pinzas, tijeras,
navaja de afeitar . También se necesitan frascos con alcohol, mechero de alcohol, máscaras, guantes,
marcadores a prueba de agua, bandejas, y tacho para basuras.
4. En el área de incubación: Un cuarto con temperatura, iluminación y humedad relativa controladas;
estanterías con iluminación para los cultivos, bandejas, termómetros de máxima y mínima, y gradillas para tubos
de varios tamaños.
5. En el área de examinación: Microscopio estereoscópico, microscopio compuesto, lentes dé aumento, y
elementos ópticos complementarios.
6. En el área de crecimiento in vivo: Macetas, suelo, bandejas, cámaras de alta humedad
2.- Investigación:
 Buscar en internet, un plano de un Laboratorio tipo, con sus respectivas áreas.
 Buscar en internet, los equipos necesarios para la implementación de un laboratorio. 

CAPITULO III. –
Composición y comparación de los medios nutritivos
1.- Cuestionario: 
 Realizar un resumen del capítulo o un mapa mental.
Los medios de cultivo que se utilizan el laboratorio dependen del microorganismo que se pretende
cultivar y de la finalidad de su cultivo. Puede hacerse una descripción global de los mismos atendiendo
a su composición química, a su estado físico y la finalidad del cultivo. Como la distribución se hace
atendiendo a diferentes criterios un medio de cultivo puede incluirse en más de una categoría.

Composición: definidos/indefinidos

Según su composición química Para preparar los medios de cultivo definidos o sintéticos (ej el
medio de Koser para la utilización del citrato) se utilizan componentes de alta pureza, por lo que se
conoce su composición química (cualitativa y cuantitativamente).
 Cuando no es decisivo conocer la composición exacta del medio de cultivo se utilizan medios
indefinidos, naturales o complejos, como el Agar nutritivo preparados con mezclas de nutrientes como
peptonas, extracto de carne, extracto de levadura, agar-agar, etc.

Estado físico: Líquidos/ sólidos/ semisólidos

Según su estado físico . Los medios de cultivo sólidos (como el TSA) contienen el agente
solidificante (generalmente agar al 1,5-2%) y los medios de cultivo líquidos (como el agua de peptona)
no llevan adicionados agentes solidificantes; los medios de cultivo semisólidos (como el Agar de
Hugh-Leiffson contienen el agente solidificante en menor concentración que los sólidos.

Finalidad: Ordinarios/ enriquecidos/ diferenciales/, selectivos/de enriquecimiento

Según su finalidad Cuando se cultivan microorganismos que requieren nutrientes comunes, se

utilizan medios de cultivo ordinarios (como el Agua de peptona): sus nutrientes permiten el crecimiento
de gran número de microorganismos, pero no de los que requieren nutrientes particulares. Las
bacterias mas exigentes nutricionalmente se cultivan en medios enriquecidos (como Agar chocolate
que es Agar nutritivo añadido del 10% de sangre calentada –hemolizada-): Contienen los nutrientes
ausentes de los medios ordinarios, como por ejemplo factores orgánicos de crecimiento.

 Señale como afecta la constitución genética en la Micropropagación de las plantas.

Cuando una planta se multiplica vegetativamente, sea por cultivo de tejidos o medios convencionales,
a la progenie se denomina clon porque su constitución genética es idéntica que su progenitor.
 Mencione las principales sales minerales de macronutrientes y micronutrientes que se utilizan en los medios
nutritivos. 
Macronutrientes
Nitrogeno, fosforo, potasio, azufre, calcio, magnesio y cloro
Micronutrientes:
Hierro, Boro, Molibdeno, manganeso, cobre, zinc, cobalto e iodo.
 Explique las principales nutrientes orgánicas que se utilizan en los medios nutritivos.
Carbohidratos: Son compuestos como el azúcar o la celulosa y la sucrosa como fuente principal
como carbono.
Complejo de Vitamina B: Inositol 100mg x litro
Tiamina Vitamina B1: funciona como coenzima de añade en mg.
Piridoxina B6: Se añade para el crecimiento cloruro de piridoxina 10mg x litro
Acido Pantotenico: Activo con la conezima10mg x litro
Acido Folico: Actica como coenzima del medio nutritivo 10mg x litro
Colina: Alcaloide se añade como colina 10mg x litro

 Elaborar una lista de los reactivos necesarios para la compra. 

Nitrato de potasio 19 g
Nitrato de amonio 16.50 g
Cloruro de calcio di hidratado 4.4 g
Sulfato de magnesio epta hidratado 3.7 g
Fosfato mono potásico 1.7 g
Sulfato de manganeso 1680 mg
Sulfato de zinc 860mg
Acido bórico 620 mg
Ioduro de potasio 83 mg
Cloruro de cobalto 2.5 mg
Sulfato cúprico 2.5 mg
Sulfato ferroso 2.78 g
Na2 EDTA 3.72 g
Inositol 10g
Tiamina 10 mg
25 mg de BAP
 25 mg de IBA
50 mg de AG3
 Comparación de los medios nutritivos utilizados en el Contenido en macro sales de los medios más
importantes Knudson, Gamborg Schenk y Hildebrandt, Murashige y Skoog.

           gr/litro    Molar
Macronutrientes
Ca (N03)2 4H2O 0.94 4.0 mM

MgSO4    7H2O 0.52 2.0 mM

KNO3 0.66 6.0 mM

NH4 H2 PO4 0.12 1.0 mM

Fe 330 sulfato de 0.07 0.01 mM

hierro
  Concentración g/l Concentración final (molar)
Micronutrientes
H3BO3 28 45 uM

Mn SO4 H2O 34 20 uM

Cu SO4  7H2O 1.0 0.4 uM

ZnSO4   7H2O 2.2 0.2 uM

(NH4)6 Mo7O24  4H2O 1.0 0.7 uM

H2SO4 (concentrado) 5 ml  

2.- Investigación:
 Buscar en internet, Sigma cell culture catalogue & Price lista la composición del medio Murashige and &Skoog.
 Mezclas de sales basales
M5524 - Mezcla de sal basal (MS) Murashige y Skoog
M0654 - Solución de macronutrientes de sal basal Murashige y Skoog
M0529 - Solución de micronutrientes de sal basal Murashige y Skoog
M2909 - Mezcla de sal basal modificada Murashige y Skoog

Componente (mg / L) M5524 M0654 M0529 M2909

Cloruro de aluminio • 6H   O
2        
Nitrato de amonio 1650,0 1650,0    
Fosfato de amonio monobásico        
Sulfato de amonio        
Ácido bórico 6.2   6.2 6.2
Cloruro de calcio anhidro 332,2 332,2   332,2
Nitrato de calcio        
Fosfato de calcio tribásico        
Cloruro de cobalto • 6H   O 2 0,025   0,025 0,025
Sulfato cúprico • 5H   O
2 0,025   0,025 0,025
Na   -EDTA
2 37,26   37,3 37,26
ZnNa   -EDTA
2        
Cloruro férrico • 6H   O
2        
Citrato férrico        
Sulfato férrico        
Tartrato férrico • 2H   O 2        
Sulfato ferroso • 7H   O
2 27,8   27,8 27,8
Sulfato de magnesio 180,7 180,7   180,7
Cloruro de manganeso • 4H   O 2        
Sulfato de manganeso • H   O 2 16.9   16.9 16.9
Trióxido de molibdeno        
Ácido molibdico (sal de sodio) •
0.25   0.25 0.25
2H   O
2

Cloruro de níquel • 6H   O 2        

Sulfato de níquel • 6H   O 2        
Cloruro de potasio        
Yoduro de potasio 0,83   0,83 0,83
Nitrato de potasio 1900,0 1900,0   1900,0
Fosfato de potasio monobásico 170,0 170,0   170,0
Sulfato de potasio        
Nitrato de sodio        
Fosfato de sodio monobásico        
Sulfato de sodio        
Nitrato de zinc • 6H   O
2        
Sulfato de zinc • 7H   O
2 8.6   8.6 8.6
Orgánicos (mg / L) M5524 M0654 M0529 M2909
Carbón activado        
Hemisulfato de adenina        
Agar        
6-bencilaminopurina (BA)        
D-biotina        
6gamma-gamma-
       
dimetilalilaminopurina
Glicina (base libre)        
Ácido indol-3-acético        
Ácido indol-3-butírico        
Cinetina        
MES (ácido libre)        
mioinositol        
ácido alfa-naftaleneacético        
Ácido Nictotínico (ácido libre)        
Peptona        
Piridoxina • HCl        
Sacarosa        
Tiamina • HCl        
  M5524 M0654 M0529 M2909
Gramos de polvo para preparar 1 L 4.3 4.3 n/A n/A 2.7
pH ± 0.5 a temperatura ambiente 3.9 4.3 4.3 3.2 3.9

 Buscar en internet, los reactivos y precios para el medio de cultivo Murashige and % Skoog.  para la
implementación de un laboratorio. 
Sales principales (macronutrientes)
Nitrato de amonio (NH4NO3) 1,650 mg/l
Cloruro de calcio (CaCl2 · 2H2O) 440 mg/l
Sulfato de magnesio MgSO4 · 7H2O) 370 mg/l
Fosfato de potasio (KH2PO4) 170 mg/l
Nitrato de potasio (KNO3) 1,900 mg/l
Sales menores (micronutrientes)
Ácido bórico (H3BO3) 6.2 mg/l
Cloruro de cobalto (CoCl2 · 6H2O) 0.025 mg/l
Sulfato cúprico (CuSO4 · 5H2O) 0.025 mg/l
Sulfato ferroso (FeSO4 · 7H2O) 27.8 mg/l
Sulfato de manganeso (MnSO4 · 4H2O) 22.3 mg/l
Yoduro de potasio (KI) 0.83 mg/l
Molibdato de sodio (Na2MoO4 · 2H2O) 0.25 mg/l
Sulfato de zinc (ZnSO4·7H2O) 8.6 mg/l
 Na2EDTA · 2H2O 37.2 mg/l

Vitaminas
i-Inositol 100 mg/l
Niacina 0.5 mg/l
Piridoxina · HCl 0.5 mg/l
Tiamina · HCl 0.1 mg/l
Glicinas 2 mg/l
Edamina (opcional) 1 g/l

CAPITULO IV.- Preparación de los medios nutritivos

1.- Cuestionario: 
 Realizar un resumen del capítulo o un mapa mental.
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento
y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo
de los microorganismos. La diversidad metabólica de estos es tan grande
que la variedad de medios de cultivo es enorme, no existiendo un medio de
cultivo universal adecuado para todos ellos, ni siquiera refiriendonos a las
bacterias con exclusividad.
CONSTITUYENES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO
A continuación se da una idea general sobre algunos de los constituyentes
habituales de los medios de cultivo.
AGAR. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de
cultivo. En el agar bacteriológico el componente dominante es un
polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas y que presenta la
indudable ventaja de que a excepción de algunos microorganismos
marinos, no es utilizado como nutriente. Un gel de agar al 1-2% se licua
alrededor de los 100ºC y se gelifica alrededor de los 40ºC, dependiendo de
su grado de pureza.
EXTRACTOS. Su preparación consiste en que ciertos órganos o tejidos
animales o vegetales (p.e. carne, hígado, cerebro, semillas, etc.) son
extraídos con agua y calor y posteriormente concentrados hasta la forma
final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son a menudo
empleados en la elaboración de los medios de cultivo. Los más utilizados
son el extracto de carne, de levadura y el de malta.
PEPTONAS. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos,
nitrogenados y sales minerales, que se obtienen por digestión enzimática o
química de proteínas animales o vegetales (soja caseína carne, etc.). Las
peptonas son muy ricas en pépticos y aminoácidos, pero pueden ser
deficientes en determinadas vitaminas y sales minerales.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran

comercializados; normalmente bajo la forma de liofilizados a los que es
preciso rehidratar. En estos casos la preparación del medio de cultivo se
reduce sencillamente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en
 agua destilada siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias
termolábiles, se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los
componentes después de que estos hayan sido previamente esterilizados en
el autoclave y enfriados a temperatura ambiente ó a 40-50ºC si se trata de
medios con agar.
Antes de su esterilización los medios líquidos se reparten en los recipientes
adecuados (tubos, matraces, etc.). Si es un medio sólido y se ha de
distribuir en tubos ó en matraces será necesario fundir el agar en baño
Maria u horno microondas, una vez fundido y homogenizado, se distribuye
en caliente a los tubos ó matraces (no en placas Petri) se tapa y se esteriliza
en el autoclave.
Una vez finalizada la esterilización los medios se dejaran enfriar a
temperatura ambiente y en el caso de medios sólidos contenidos en tubos
deberán, en su caso, inclinarse para que al solidificarse adopten la forma de
agar inclinado ó pico de flauta(slant) si tal es su finalidad.
Las placas de Petri se preparan vertiendo el medio fundido y estéril dentro
de ellas y en un ambiente aséptico (por ejemplo en la proximidad de la
llama de un mechero Bunsen) es conveniente homogenizar el medio en el
transcurso de la operación para evitar que el agar sedimente en el fondo del
recipiente y no se distribuya por igual en todas las placas.
También es posible conservar el medio destinado a preparar placas Petri solidificado y
estéril en tubos que se fundirán al baño Maria en el momento de la
preparación de las mismas.
Los caldos y medios sólidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a
temperatura ambiente pero para reducir su deshidratación y el consiguiente
cambio en las concentraciones de sus componentes es preferible
conservarlos a 4ºC.

 Explique cómo se prepara las soluciones: Stock1 de Macronutrientes, solución Stock 2 Micronutrientes,
Solución stock 3 del Hierro quelatado, solución stock 4 de vitaminas, solución stock 5 de Bencil amino purina
BAP concentración de 0.1mg/ml., Solución stock 6 de Ácido indol butírico IBA concentración 0.1 mg/ml.,
solución stock 7 ácido Giberelico concentración 0,5 mg/ml.

1.- Solución stock Sales mayores (stock 10X)

Nitrato de potasio 19 g
Nitrato de amonio 16.50 g
Cloruro de calcio di hidratado 4.4 g
Sulfato de magnesio epta hidratado 3.7 g
Fosfato mono potásico 1.7 g
Disolver y completar a1000 ml Esta solución equivale a una concentración de 10 veces. Con 100 ml de
esta solución se emplea para preparar 1 L de medio.

2.- Sales menores ( stock 100x)

Sulfato de manganeso 1680 mg
Sulfato de zinc 860mg
Acido bórico 620 mg
Ioduro de potasio 83 mg
Cloruro de cobalto 2.5 mg
Sulfato cúprico 2.5 mg
Los dos últimos se pesan 25 mg , se diluyen en 100 ml de agua del cual se saca 10 ml que contienen
los 2.5 mg
Posteriormente se disuelve en 1000.ml que es la solución final.

3.- Solución stock del Hierro (100 x)

Sulfato ferroso 2.78 g
Na2 EDTA 3.72 g
 Disolver en agua destilada y completar hasta 1000ml
Para preparar un litro de medio se usa 10 ml y se debe guardar el resto en refrigeración en botella de
color ambar por que no es estable en presencia de la luz.

4.- Solución stock de vitaminas (100 x)

Inositol 10g
Tiamina 10 mg
Disolver en 1000ml del cual se extrae 10 ml de esta solución que proveen 100 mg de inositol y 0.4 de
tiamina cantidad requerida para el medio nutritivo.

5.- Solución stock Benzil amino purina (BAP) concentración 0.1 mg/ml
Pesar 25 mg de BAP en un vaso de precipitación añadir 5 ml de agua, posterior añadir con un gotero
1M de HCl hasta que se disuelva .
Agregar 250 ml de agua
Si se extrae 1ml de esta solución provee 0.1 mg de BAP para 1 litro de medio nutritivo.

6.- Solución Stock del Acido Indol Butírico (IBA) concentración de 0.1 mg/ml.
Pesar 25 mg de IBA en un vaso de precipitación añadir 5 ml de gua y con un gotero añadir solución 1m
NaOH en plena agitación , gota a gota hasta que se disuelva el IBA luego completar con agua
destilada hasta 250 ml, esta solución provee 0.1 mg de IBA por ml.

7.- Solución stock del acido Giberelico (AG3) concentración de 0.5mg/ml

Pesar 50 mg de AG3 vaciar en un vaso de presipitacion , añadir 5 ml de agua . Con un gotero añadir
1m de NaOH gota a gota hasta que se disuelva agitar continuamente , añadir agua hasta 100 ml . Esta
solución contiene 0.5 mg de AG3 por ml .
Con i ml de esta solución será añadido 0.5 mg de AG3 que requiere el medio nutritivo.

 Cuáles son las diferencias en los medios nutritivos para las fases de iniciación, multiplicación y enraizamiento.
Fase de Iniciacion: Lavado y desinfección (hipoclorito de calcio) Extracción de meristemos y cultivos en
crecimiento sin contaminar
Fase de Multiplicacion: Frascos con explantos (medio con citoquininas) Proliferación 4-5 semanas
Fase de enraizamiento: Frascos con brotes (medio con auxinas – IBA) Enraizamiento de brotes durante 3-4
semanas

2.- Investigación:
 Buscar en internet, la preparación de las soluciones Stock para la fase de Iniciación, Multiplicación y
enraizamiento.
Solución Nº1: Macronutrientes y micronutrientes
En una probeta colocar 1000 ml de agua bidestilada.
Pesar, añadir y agitar hasta disolver (uno a uno), los siguientes compuestos:
Macronutrientes
NO3NH4 PO4H2K 1,70 gr/l IK 0,0083 gr/l
16,50 gr/l Micronutrientes MoO4Na2 2H2O 0,0025
gr/l
NO3K 19,00 gr/l H3BO3 0,062 gr/l
SO4Cu 6H2O 0,00025 gr/l
Cl2Ca 2H2O 4,40 gr/l SO4Mn 4H2O 0,223 gr/l
Cl2Co 6H2O 0,00025 gr/l
SO4Mg 7H2O 3,70 gr/l SO4Zn 4H2O 0,086 gr/l
Envasar, rotular y colocar la solución en la heladera.
 Solución Nº2: Quelato de hierro.
Pesar 0,373 gr de Na2
EDTA y disolver en 350 ml de agua bidestilada, con calor.
Pesar 0,278 gr de FeSO4 7H2O y disolver en 350 ml de agua bidestilada, con calor.
Mezclar ambas soluciones y completar el litro.
Envasar en un frasco acaramelado, rotular y colocar la solución en la heladera.
Solución Nº3: Vitaminas.
En una probeta colocar 1000 ml de agua bidestilada.
Pesar, añadir y agitar hasta disolver (uno a uno), las siguientes vitaminas:
Glicina 0,020 gr/l
Ac. Nicotínico 0,005 gr/l
Tiamina 0,001 gr/l
Piridoxina 0,005 gr/l
(el mio inositol se agrega directamente al preparar el medio de cultivo 1 gr/l)
Envasar, rotular y colocar la solución en la heladera.
Capítulo V
Elección del material vegetal

1.- Cuestionario: 
 Realizar un resumen del capítulo o un mapa mental de los protocolos.
El desarrollo de un protocolo de propagación in vitro para una especie ornamental determinada,
implica el ajuste de las condiciones nutricionales, hormonales y ambientales óptimas propias de ese
genotipo, en cada una de las cuatro etapas, que permitan alcanzar los objetivos de cultivo, crecimiento
y multiplicación de yemas y posteriores plantas completas, a partir de una pequeña porción de vegetal
introducida inicialmente, en un tubo de ensayo u otro recipiente.

La clonación in vitro presupone la existencia de un laboratorio, apropiado para el cultivo en condiciones

de esterilidad.

El equipamiento está compuesto por: autoclave, balanza de precisión, destilador, flujo laminar,
heladera, medidor de pH, cámara de cultivo con condiciones controladas de luz y temperatura e
invernáculo de aclimatación.

Las metodologías para cultivar in vitro células, tejidos y órganos vegetales han tenido un enorme
desarrollo. Las técnicas de propagación in vitro tienen la ventaja de producir altos números de plantas
en espacios pequeños durante cualquier época del año; asimismo, el crecimiento de las plantas
propagadas in vitro con frecuencia es más vigoroso que el de las propagadas in vivo, debido al
rejuvenecimiento de la planta y a la obtención de plantas libres de enfermedades.
 Explique cada una de las fases de la Micropropagación in vitro
Dentro del proceso de micropropagación se pueden diferenciar varias fases o etapas:

 1: Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de semillas

 2: Introducción del material seleccionado in vitro
 3: Multiplicación de brotes
 4: Enraizamiento
 5: Aclimatación
Preparación de la planta madre
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un
grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la
planta donante de yemas, durante un período que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero
bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de
la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.
Desinfección del material vegetal
Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos. Los
explantos pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces o semillas. Antes de extraer los explantos se hará una
desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes más
comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material
vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.
Introducción del material in vitro
Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio
de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de
nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.
Multiplicación de los brotes
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron las fases anteriores originen brotes (de procedencia
axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en
contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio
mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados.
Elección de un medio de enraizamiento de los explantos
Para enraizar los explantos se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 cm. Los
brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que
solo contenga hormonas del tipo de las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten
sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y
enraizamiento transcurren en forma simultánea.
Aclimatación de los explantos enraizados
Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de
todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán
la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales.

 Explique Cómo se obtienen los tejidos meristematicos, apicales, laterales, intercalares y meristemoides.
MERISTEMOS APICALES
Es un conjunto de células meristematicas situados en el ápice de los brotes y raíces, que por
división periclinal producen tejidos que determinan el crecimiento en longitud del tallo y la raíz
y la formación de ramas hojas y flores del vástago de la planta. Los meristemos apicales son de
dos Clases:
Ápice vegetativo del Brote. Ápice vegetativo de la Raíz.
En Biotecnología se usan los del brote muy poco de la raíz
MERISTEMOS LATERALES
Conjunto de células meristematicas situadas en las partes laterales a lo largo del tallo y raíces a
diferentes profundidades en forma de tubos cilíndricos huecos , que por división tangencial de
sus células, producen simultáneamente al interior y al exterior grupos de células que
determinan el crecimiento en grosor o espesor de la planta.
 Estos tejidos se encuentran a lo largo del tallo algunas plantas tienen tejidos meristematicos
laterales que determinan el crecimiento en grosor. Como los sauces, álamos, eucaliptus,
algunas plantas forestales.
En Biotecnologia se usan este tipo de meristemos para propagar algunas plantas como la
zanahoria, la alfa alfa y otras.
MERISTEMO INTERCALAR.
Es una zona de tejido meristematico formado de grupos de células que se dividen y crecen
activamente y se encuentran en regiones de tejidos apartados del meristemo apical, en los
entrenudos y las vainas de las hojas monocotiledóneas, que determina el crecimiento en
longitud del tallo y las hojas.
En Biotecnología se usan estos tejidos Meristematicos sacando de las nervaduras de las hojas,
las raíces falsas de los helechos, el Gino foro del maní, los nudos del tallo de las gramíneas.
También se usan en plantas herbáceas el peciolo de las hojas como en la Gloxínea, violetas
africanas etc.

 Cuáles son los pasos para el aislamiento, inoculación, y repicado de los explantes in vitro.

 Por qué aparecen las variaciones soma clónales en cultivo de tejidos.
Se debe al cambio genético producido durante el proceso de diferenciación in vitro por acumulaciones de
errores durante sucesivas divisiones.
 Explique la influencia de los factores físicos en el crecimiento y desarrollo.

 Explique los sustratos y la forma de esterilización para la aclimatación de plántulas in vitro en el invernadero.
 Se usa el vapor de agua en un autoclave, este método es eficaz para la eliminación de los microorganismos que
pudiesen entrar durante la preparación del medio.
El autoclave permite esterilizar los medios de cultivo a 15 lb/pulg2 durante 20 minutos con esta presión la
temperatura de vapor es aproximadamente 121°C suficiente para matar a los microorganismos en 5 minutos.
Es importante indicar que algunos componentes del medio nutritivo pueden ser termolábiles por tal razón se
deberán esterilizar usando un filtro
2.- Investigación:
 Buscar en internet, las fases de la Micropropagación 
FASE 0:
PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes
con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos
explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora
de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o
varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas.
FASE 1:
DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se
obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones
de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los
fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los
contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma
natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en
condiciones de asepsia.
FASE 2:
INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO
Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material
seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o
quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos
vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.
 FASE 3:
MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2
originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de
cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el
medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un
nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes
adecuados.
FASE 4:
ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS
Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un
tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de
multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo
contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar
por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan
yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en
forma simultánea.
FASE 5:
ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS
Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de
manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En
esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación
de las mismas a vivir en condiciones naturales.
 Buscar en internet, la extracción de los tejidos meristematicos apicales, laterales, intercalares y
meristemoides.

 Buscar en internet, la preparación de sustratos, esterilización y nebulización del invernadero.

Capítulo VI
Preparación de los medios nutritivos Protocolos para las siguientes especies vegetales
1.- Cuestionario:
 Realizar un resumen del capítulo o un mapa mental para cada uno de los cultivos señalados.

 Explique cómo se prepara los medios de cultivo Protocolos para cada uno de los cultivos señalados
Micropropagacion del Café
Las hormonas se adecuan de acuerdo a la altitud, presión atmosférica.
FASE I
1.- Buscar la planta plus, sana se utilizara esquises de tallos.
2.- Desinfectar con hipoclorito de sodio al 1,6% por 30 minutos.
3.-Enjuagar con agua destilada esteril varias veces
4.- Lavar 3 veces con agua esteril
5.- Luego sacar el apice y colocar al medio nutritivo.
6.- Colocar en caja por 48 horas en la cámara de crecimiento donde estará a 26° C.
Si no le colocas en la oscuridad entonces se produce la fenolizacion o aparición de sustancias fenoles.
Y para evitar eso es mejor prepara acido cítrico 1,5% y acido ascórbico 1,5%, mete, saca y listo los 2
en uno preparar. La fenolizacion ocurre en el momento en que entra a la planta al laboratorio en la
Fase 1 estara 2-4 semanas hasta que salga unas 2 hojas, para que no se contamine hacer esto en
tubo.
FASE II
En los medios de frascos, el café tiene 2n cromosomas diploides, pueden estar por un buen tiempo, de
una yema tendrá 8 plantas, en la papa puede tener en un año un millón de plantas, puede multiplicar
aunque unas 10 veces.
Analizar el enraizamiento
Micropropagacion para Eucalipto
 FASE I
1.- Hacer rejuvenilizacion para obtener el material, también funciona en palta.
2.- Lavar con agua corriente.
3.- Cortar las partes terminales del tallo
4.- Enjuagar
5.- Poner con hipoclorito de sodio por 15 minutos.
6.- Lavar 3 veces con agua esteril.
7.- Sacar luego el meristemo.
FASE II
Aplicar por 15 minutos en cloruro de calcio y luego en Ag3 eso hace que no respire mucho, gracias a
eso se mantiene verde.
Lavar con agua y jabon.
Conservacion: Con un poco de luz, lo que tenia que crecer en un mes crece en un año, se puede luego
a Fase 3.
FASE III
Realizar la tuberización en cajas
Los nutrientes que necesuta se puede hacer la hidroponía en papa
En fase II no cortar mas de 6 veces.

 Cuáles son las diferencias en los medios nutritivos para las fases de iniciación, multiplicación y enraizamiento.
Fase de iniciación: una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se
obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces o semillas. Antes
de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los
contaminantes externos.
Fase de Multiplicación: durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron las fases anteriores
originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que
se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo.
Fase de Enraizamiento: Para enraizar los explantos se utilizan principalmente plantines individuales de un
tamaño aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio
libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de las auxinas.
2.- Investigación:
 Buscar en internet, la preparación de los medios nutritivos para la fase de Iniciación, Multiplicación y
enraizamiento de los cultivos mencionados.
Medios de cultivo para Cafe

Macroelementos KI Yoduro de potasio 0.415

CaCl₂.2H₂O Cloruro de calcio bihidratado 220.000 MnSO₄.4H₂O Sulfato de manganeso tetrahidratado

11.150
KH₂PO₄ Fosfato monobásico de potasio 85.000
Na₂MoO₄.2H₂O Molibdato de sodio bihidratao 0.125
KNO₃ Nitrato de potasio 950.000
ZnSO₄.7H₂O Sulfato de zinc heptahidratado 4.300
MgSO₄.7H₂O Sulfato de magnesio heptahidratado
185.000 Hierro

NH₄NO₃ Nitrato de amonio 825.000 FeNa EDTA Sal férrica sódica de ácido 25.000

Microelementos Etilendiaminotetraacético

H₃BO₃ Ácido bórico 3.100 Vitaminas

CoCl₂.6H₂O Cloruro de cobalto hexahidratado 0.013 Inositol 100.000

CuSO₄.5H₂O Sulfato de cobre pentahidratado 0.013 Ácido Nicotínico 0.250

Piridoxina 0.250

Tiamina 0.200

Auxinas

Ácido Naftaleneacético 0.190

6-bencilaminopurina 2.250

Sacarosa 30000.000