Manual Diseño de Biofarmacéuticos Ago-Dic 2023 Aprobado Por CEID

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
PROGRAMA DE INGENIERÍA DE BIOPROCESOS
Laboratorio de Diseño de Biofarmacéuticos

Manual Elaborado por:
Dra. Luz María Teresita Paz Maldonado

Dra. Ruth Elena. Soria Guerra
Dr. Sergio Rosales Mendoza
M. en C. María Guadalupe Martel Gallegos
Actualizado por:
Dra. Aída Jimena Velarde Salcedo

Dr. Sergio Rosales Mendoza
Aprobación por el Comité de Ética en Investigación y Docencia (FCQ, UASLP):

CEID2023-01R1
Nombre del alumno: Objetivo General:
_____________________________________________
Índice
Plan de estudios ......................................................................................................................................... 2
Objetivo del espacio de formación de la asignatura ............................................................................. 3
Misión del Programa Educativo ................................................................................................................ 3
Competencias y desempeños desarrollados en el laboratorio ............................................................ 3
Evaluación y Acreditación .......................................................................................................................... 3
Marco de seguridad del laboratorio ......................................................................................................... 7
Reglamento del laboratorio ....................................................................................................................... 8
Medidas en caso de accidentes ............................................................................................................... 8
Distribución del laboratorio ....................................................................................................................... 9
Uso y manejo de OGMs y resguardo de RPBIs ................................................................................... 10
Plan de emergencia.................................................................................................................................. 13
Calendario de prácticas ........................................................................................................................... 14
Tema 0. Preparación de soluciones ...................................................................................................... 15
Tema 1. Ensayo de producción y purificación de la proteína recombinante .................................. 17
Sesión 1. Ensayo de producción de una proteína recombinante con aplicaciones biomédicas
................................................................................................................................................................ 20
Sesión 2. Purificación de proteínas recombinantes. Obtención del extracto proteico.............. 23
Sesión 3. Purificación de proteínas recombinantes. Cromatografía de afinidad ........................ 26
Sesión 4. Análisis de proteína recombinantes mediante electroforesis ...................................... 29
Sesión 5. Formulación de un prototipo de vacuna ........................................................................ 32
Tema 2. Análisis de la inmunogenicidad del polipéptido C4(V3)6 purificado ............................... 35
Sesiones 6,7 y 8. Inmunogenicidad del prototipo vacunal. Inmunización.................................. 37
Sesión 9. Inmunogenicidad del prototipo vacunal. Obtención del antisuero ............................. 42
Sesión 10. Eficacia biológica de biofarmacéuticos ......................................................................... 47
Reporte Post-laboratorio ......................................................................................................................... 50
Referencias bibliográficas ........................................................................................................................ 52
1
Plan de estudios
2
Objetivo del espacio de formación de la asignatura
Analizar, proponer, diseñar y evaluar la eficacia (bajo un enfoque integral) de

procesos involucrados en la elaboración de productos biotecnológicos de
aplicación médica con un énfasis en la Ingeniería de Bioprocesos (producción y
optimización) y en los aspectos normativos aplicables a nivel nacional e
internacional para resolver problemas relevantes en la sociedad y en el sector
productivo.
Misión del Programa Educativo
Formar Ingenieros de Bioprocesos habilitados disciplinariamente para analizar los

proceso biológicos que ocurren a nivel fundamental con las competencias a
desarrollar, operar y optimizar procesos que permitan obtener productos y servicios
biotecnológicos a una escala comercial, en beneficio del sector productivo y social
a nivel local, regional y global; con un espíritu emprendedor para que sean agentes
de cambio en la sociedad, promoviendo la creación o desarrollo de empresas
biotecnológicas y el cuidado del medio ambiente con actitud ética y socialmente
responsable.
Competencias y desempeños desarrollados en el laboratorio
Competencia B. Habilidad para diseñar y realizar experimentos relacionados con la

Ingeniería de Bioprocesos para comprobar hipótesis y establecer conclusiones.
Desempeño B2. Analiza estadísticamente datos experimentales.
Competencia F. Participa efectivamente en equipos inter y multidisciplinarios que

trabajan con eficacia y eficiencia para la solución de problemas del entorno.
Desempeño F2. Trabaja en equipo con actitud de tolerancia y liderazgo,

fomentando el desarrollo de habilidades interpersonales.
Evaluación y Acreditación
El programa de teoría deberá cursarse simultáneamente con el laboratorio. Se

requiere el 100% de la asistencia a las sesiones prácticas incluyendo las sesiones
de discusión. Previo a la sesión práctica, el alumno deberá responder un
3
cuestionario pre-laboratorio que aborda conceptos teóricos y técnicos importantes
para la realización de esta. El reporte del alumno consistirá en un trabajo escrito
en formato artículo que incluirá la metodología realizada a lo largo del curso, donde
se examinarán los conocimientos adquiridos y se pedirá al alumno que describa
sus propias conclusiones del tema, además de una discusión bien documentada
acerca de preguntas especificadas por el profesor. El conjunto del desempeño del
alumno durante el desarrollo de las prácticas, los cuestionarios pre-laboratorio, así
como el reporte escrito y la sesión de discusión del tema, constituirán un 16.6%
de la calificación del curso de acuerdo con la siguiente ponderación y rúbricas de
evaluación:
• Cuestionarios Pre-laboratorio (20%)
Criterios Escala de calificación

Contenido 5 3.75 2.5 1.25
Aplica los conocimientos prácticos Excelente Bueno Regular Deficiente
adquiridos, la información que presenta
refleja una comprensión del tema y que
cuenta con las habilidades necesarias
para realizar la práctica
Redacción 2 1.5 1 0.5
Entrega un trabajo ordenado, bien Excelente Bueno Regular Deficiente
redactado en español, con un lenguaje y
vocabularios apropiados y una ortografía,
gramática y sintaxis correctas
Información bibliográfica 2 1.5 1 0.5
Cita correctamente en el texto, muestra la Excelente Bueno Regular Deficiente
lista de referencias siguiendo el formato
establecido y las fuentes consultadas son
apropiadas
Actitudes y responsabilidad 1 0.75 0.5 0.25
Entrega un trabajo puntualmente y acata Excelente Bueno Regular Deficiente
las indicaciones de entrega
Total de puntos: 10
4
• Reporte Post-laboratorio (40%)

Redacción 2 1.5 1 0.5
Entrega un escrito bien redactado en Excelente Bueno Regular Deficiente
español, con ortografía, gramática y
sintaxis correctas, ordenado, siguiendo
las indicaciones de formato y con un
manejo correcto de referencias
Contenido 4 3 2 1
Entrega un escrito cuyo contenido sigue Excelente Bueno Regular Deficiente
una secuencia lógica de trabajo, aplica los
conocimientos teóricos y prácticos
adquiridos y la información de respaldo
es apropiada para la comprensión y
discusión de resultados
Argumentación y claridad 4 3 2 1
Expresa correctamente los resultados Excelente Bueno Regular Deficiente
obtenidos y los discute de una manera
clara, crítica y objetiva
Total de puntos: 10
5
• Desempeño práctico (40%)

Trabajo en equipo 1 0.75 0.5 0.25
Colabora con los miembros de su equipo Excelente Bueno Regular Deficiente
y el resto del grupo para optimizar el
tiempo de trabajo en el laboratorio
Aplicación de medidas de 1 0.75 0.5 0.25
seguridad Excelente Bueno Regular Deficiente
Sigue el reglamento y las medidas de
seguridad dentro del laboratorio. Porta
bata blanca y el equipo de seguridad
acorde a la práctica.
Manejo de residuos 1 0.75 0.5 0.25
Muestra una actitud consciente del medio Excelente Bueno Regular Deficiente
ambiente, minimiza la generación de
residuos y les da el tratamiento adecuado
para reducir el impacto ambiental de las
sustancias y residuos generadas.
Participa en la limpieza y acomodo del
material y equipo del laboratorio
Organización y 1 0.75 0.5 0.25
responsabilidad Excelente Bueno Regular Deficiente
Se comporta de manera ordenada
durante la práctica y sigue las
indicaciones del profesor. Aplica las
buenas prácticas de laboratorio
Resultados obtenidos 1 0.75 0.5 0.25
Logra los objetivos de la práctica Excelente Bueno Regular Deficiente
Discusión de resultados y 1 0.75 0.5 0.25
conclusiones Excelente Bueno Regular Deficiente
Interpreta y discute los resultados
obtenidos durante la práctica para la
elaboración de conclusiones
Razonamiento teórico- 1 0.75 0.5 0.25
práctico Excelente Bueno Regular Deficiente
Resuelve los problemas o razonamientos
planteados durante la práctica, integra los
conocimientos adquiridos en la teoría
para el desarrollo de la práctica
Participación 1 0.75 0.5 0.25
Participa activamente durante la práctica, Excelente Bueno Regular Deficiente
ya sea respondiendo preguntas,
apoyando al profesor y mostrando una
actitud proactiva
Documentación 1 0.75 0.5 0.25
Registra de manera ordenada los cálculos Excelente Bueno Regular Deficiente
y resultados obtenidos durante la práctica
Puntualidad 1 0.75 0.5 0.25
Asiste puntualmente a la práctica, dentro Excelente Bueno Regular Deficiente
de los 10 minutos de tolerancia
Total de puntos: 10
6
Marco de seguridad del laboratorio
La Unidad de Biotecnología de Ingeniería de Bioprocesos, y por ende el Laboratorio
de Diseño de Biofarmacéuticos, están adscritos a la Facultad de Ciencias Químicas
de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí, dentro del cual se realizan diversas
técnicas analíticas y manejo de organismos genéticamente modificados y animales
de laboratorio, por lo tanto debe considerarse como una entidad o establecimiento
que almacena sustancias potencialmente peligrosas y a su vez genera residuos que
cumplen con la característica de ser peligrosos y/o biológico infecciosos. Debido a
esto, la Unidad de Biotecnología es considerada como un microgenerador y deberá
de acatar lo indicado en la normativa siguiente:
• Ley General de Equilibrio Ecológico y Protección al Ambiente

• Ley general para la Prevención y Gestión integral de los Residuos
• Reglamento de la Ley General para la Prevención y Gestión Integral de los
Residuos
• Reglamento de la Ley General de Equilibrio Ecológico y Protección al
Ambiente en Materia de Residuos Peligrosos
• Reglamento de la Ley General de Equilibrio Ecológico y Protección al
Ambiente en Materia de Evaluación del Impacto Ambiental
• Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, que establece las
características, el procedimiento de identificación, clasificación y el listado de
los residuos peligrosos
• Norma Oficial Mexicana NOM-053-SEMARNAT-1993, que establece el
procedimiento para llevar a cabo la prueba de extracción para determinar los
constituyentes que hacen a un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente
• Norma Oficial Mexicana NOM-054-SEMARNAT-1993, que establece los
procedimientos para determinar la incompatibilidad entre dos o más residuos
considerados como peligrosos por la Norma Oficial Mexicana NOM-052-
SEMARNAT-1993
• Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Protección
Ambiental-Salud Ambiental-Residuos Peligrosos biológico infecciosos-
Clasificación y especificaciones de manejo
• Norma Oficial Mexicana NOM-020-STPS-2011, Recipientes sujetos a
presión, recipientes criogénicos y generadores de vapor o calderas-
Funcionamiento- Condiciones de seguridad
• Norma Oficial Mexicana NOM-018-STPS-2015, Sistema armonizado para la
identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas
peligrosas en los centros de trabajo
7
• Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999 Especificaciones técnicas
para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio
• Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados
• Reglamento de manejo, tratamiento y minimización de residuos de la
Facultad de Ciencias Químicas de la UASLP
• Guía para el manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos RPBI de la
Facultad de Ciencias Químicas de la UASLP
Reglamento del laboratorio
1.- La práctica se iniciará 10 minutos después de la hora indicada, una vez

transcurrido este tiempo no se permitirá la entrada a ningún estudiante.
2.- Es obligatorio el uso de bata blanca de laboratorio durante las prácticas. Cuando
se indique deberá usar cubre boca y guantes.
3.- El alumno debe realizar la práctica en orden y deberá seguir indicaciones.
4.- No se permite fumar y consumir alimentos o bebidas durante el desarrollo de
la práctica.
5.- No se permite ausentarse durante la práctica.
6.- Es obligatorio que el alumno lea la práctica antes de la sesión de laboratorio.
7.- Los alumnos deberán limpiar su mesa de trabajo antes y después de la práctica.
Medidas en caso de accidentes

INGESTIÓN DE SUSTANCIAS CORROSIVAS:
1. Evaluar el estado inicial de la persona accidentada y revisar signos vitales.
2. Revisar la hoja de seguridad de la sustancia ingerida.
3. Llevar a la persona al Centro de Salud Universitario e informar al médico sobre
el accidente.
QUEMADURAS EN OJOS Y PIEL POR SUSTANCIAS CORROSIVAS

1.- Enjuagar con agua fría la zona accidentada.
2. Buscar en la hoja de seguridad del producto sobre la atención médica necesaria.
3. Trasladar a la persona al centro de salud para que sea revisada por el médico.
LESIONES OCASIONADAS POR OBJETOS PUNZOCORTANTES.

1. Evaluar la severidad de la lesión, revisando si existe daño en órganos o tejidos.
2. Revisar si el objeto aún se encuentra en el lugar de la lesión y si es posible
retirarlo sin causar más daño.
3. Enjuagar con agua potable fría.
8
4. Si el sangrado no es abundante aplicar presión intentando frenar la hemorragia.
5. Si el sangrado es abundante, trasladar al paciente para recibir atención
médica.
Distribución del laboratorio
9
Uso y manejo de OGMs y resguardo de RPBIs
El manejo de organismos genéticamente modificados (OGMs) en la Unidad de
Biotecnología de Ingeniería de Bioprocesos se lleva a cabo bajo las condiciones que
garanticen su uso confinado. El congelador indicado en el croquis alberga la
colección de clonas bajo acceso restringido y control de bitácora de acceso,
regulado por el profesor responsable del laboratorio. La incubadora empleada para
el cultivo de bacterias recombinantes se señala en el croquis y su uso es restringido
a los alumnos y el profesor que realizan la práctica, lo cual se registra en una
bitácora. El tratamiento de los residuos generados se especifica en los
procedimientos específicos de cada práctica.
Un residuo peligroso biológico-infeccioso (RPBI) es aquel que contiene agentes

biológico-infecciosos, los cuales a su vez se encuentran en una concentración
suficiente, en un ambiente propicio y estar en contacto con una persona susceptible
a la cual le pueden causar efectos nocivos a la salud y al ambiente. Este tipo de
residuos incluyen sangre y hemoderivados (no sangre seca), cultivos y cepas de
agentes biológico-infecciosos, patológicos (tejidos, órganos y partes del cuerpo)
que no se encuentren en formaldehído, muestras biológicas (excepto orina y
excremento), cadáveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes
enteropatógenos, residuos no anatómicos y objetos punzocortantes que hayan
estado en contacto con muestras biológicas.
Los RPBIs tendrán un área específica de almacenamiento y resguardo temporal en

el laboratorio y no deberán mezclarse con ningún otro tipo de residuos municipales
o peligrosos. El periodo de almacenamiento temporal de los RPBIs del laboratorio
no deberá ser mayor a 30 días.
Los residuos patológicos, humanos o de animales (que no estén en formol)

deberán conservarse a una temperatura no mayor de 4°C, en refrigeradores
destinados a este fin. Las bolsas y recipientes destinados para el almacenamiento
de RPBIs deberán cumplir con los lineamientos establecidos en la Norma Oficial
Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección Ambiental - Salud Ambiental –
Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos – Clasificación y Especificaciones de
Manejo.
10
Las personas que recolecten los RPBIs deberán contar con equipo de protección
personal tal como guantes, mascarilla, lentes de protección, bata y zapato de
seguridad con suela antiderrapante.
En caso de que ocurriera un derrame, accidente o cualquier tipo de liberación no
intencionada de material biológico potencialmente peligroso en el laboratorio, el
sitio y área afectados deberán marcarse y clausurarse temporalmente hasta que se
lleve a cabo la desinfección apropiada. Las medidas y estrategias de desinfección
serán proporcionales al tipo de exposición y el riesgo potencial a la salud que se
presente.
El responsable del laboratorio será el encargado del desalojo periódico de los RPBIs
al lugar asignado de almacenamiento temporal de los residuos en la Facultad.
Para solicitar el acopio de residuos correspondiente por parte de la Subcomisión

Mixta de Higiene y Seguridad de la Facultad se deberá de seguir el siguiente
procedimiento:
• Llenar el formato establecido de Solicitud para la Disposición de Residuos

Peligrosos/Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos
• Enviar la solicitud de los residuos generados a la Subcomisión Mixta de
Higiene y Seguridad de manera impresa o vía electrónica
La ruta de salida de los RPBIs en la Facultad de Ciencias Químicas es la siguiente:
11
12
Plan de emergencia
El siguiente plan de emergencia ha sido elaborado para el conocimiento del personal académico,
administrativo, de intendencia y estudiantes que se encuentren en el interior de la Unidad de
Biotecnología del programa educativo de Ingeniería de Bioprocesos de la Facultad de Ciencias
Químicas de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí. En caso de presentarse alguna
emergencia, particularmente del tipo incendio, se encenderá la señal de alerta ya que esta es la
principal amenaza dentro del mismo. De esta manera se proponen los siguientes puntos a seguir
estrictamente en el caso de la activación durante una emergencia real:
1. Ante la presencia de un conato de incendio se dará aviso a todas las personas que se
encuentren en ese momento en el laboratorio, ya sea laborando o de visita.
2. El personal no capacitado deberá evacuar el laboratorio de una manera ordenada, es
decir, SIN GRITAR, SIN CORRER y SIN EMPUJAR. Para lo anterior es importante conocer
las rutas de evacuación. ÚNICAMENTE el personal que está capacitado en el uso de
extintores será el primer respondiente ante esta situación e igualmente deberá conocer
la ubicación del extintor. (Analizar croquis del laboratorio ubicado en la entrada el
mismo).
3. El primer respondiente analizará si se puede hacer frente al conato de incendio
dependiendo de sus capacidades; en caso contrario, deberá evacuar el inmueble junto
con los demás asistentes. En caso de que exista la presencia de humo denso provocado
por el fuego, se deberá evacuar a nivel del suelo. Lo anterior es recordando que en caso
de un siniestro primero está MI SEGURIDAD, después MI SEGURIDAD y finalmente MI
SEGURIDAD.
4. Si el fuego no pudo ser controlado con el manejo de extintores deberá ser activada la
alarma para recibir apoyo e inmediatamente después ponerse a las órdenes de los
brigadistas de evacuación (reconocibles por la portación de chalecos verdes y altavoces),
quienes son los encargados de dirigir al personal evacuado hacia el punto de reunión
más cercano y libre de peligro.
Números telefónicos importantes:
• Emergencias: 911
• Bomberos: 444 815 8090, 444 815 3583, Celular 116
• Cruz Roja: 065, 444 815 3322, 444 815 3635, Celular 114
• Hospital Central: 444 820 3902
• Centro de Salud Universitario: 444 826 2366, 444 826 2367
• Protección Civil Municipal: 444 815 8767
• Unidad Interna de Protección Civil de la Facultad de Ciencias Químicas: 444 826 2300
Ext. 6547 y 6584
“LA PREVENCIÓN DE ACCIDENTES ES NUESTRA MEJOR PROTECCIÓN, SI NO HAY
PREVENCIÓN, HAY QUE ASUMIR LAS CONSECUENCIAS”
13
Calendario de prácticas
Tema Sesión Práctica Día
0 Introducción al laboratorio 14 ago

0. Introducción al laboratorio
0 Preparación de soluciones 15 y 16 ago
Ensayo de producción de una proteína recombinante

1 22 y 23 ago
con aplicaciones biomédicas
Purificación de proteínas recombinantes. Obtención
2 29 y 30 ago
del extracto proteico
1. Ensayo de producción y Purificación de proteínas recombinantes.
purificación de la proteína 3 05 y 06 sep
Cromatografía de afinidad
recombinante
Análisis de proteínas recombinantes mediante
4 12 y 13 sep
electroforesis
5 Formulación de un prototipo de vacuna 19 y 20 sep
26 y 27 sep
03 y 04 oct
6-9 Inmunogenicidad del prototipo vacunal
2. Análisis de la 10 y 11 oct
inmunogenicidad del 17 y 18 oct
polipéptido C4(V3)6 31 oct y 01
10 Eficacia biológica de biofarmacéuticos
purificado nov
11 Retroalimentación para entrega de reporte 07 y 08 nov
Entrega bitácora de laboratorio 07 y 08 nov
Entrega de reporte final en formato artículo 14 y 15 nov
14
Tema 0. Preparación de soluciones
Cuestionario Pre-laboratorio
Consultar las hojas de seguridad de los siguientes reactivos de acuerdo con sistema
global armonizado (SGA):
• Ácido clorhídrico
• Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)
• Isopropil-β-D-1-galatopiranósido
• Dodecilsulfato de sodio
• Imidazol
• Sulfato de níquel(II)
• Isopropanol
• Ácido acético
• 2-mercaptoetanol
• Azul de Coomassie G-250
No es necesario consultar la información específica de la marca disponible en el

laboratorio, se pueden utilizar otras marcas como respaldo (Sigma, BioRad,
J.T.Baker, etc.).
Elaborar un breve resumen de las medidas de seguridad de cada reactivo

incluyendo la siguiente información:
• Nombre del reactivo

• Código Chemical Abstracts Service (CAS)
• Pictogramas de riesgo/peligro y clasificación de acuerdo con el SGA
• Códigos de identificación de peligro y consejos de prudencia de acuerdo con
el SGA
• Medidas de seguridad en caso de exposición accidental
• Tratamiento para el desecho o disposición final
Protocolo
Entre todos los grupos de laboratorio se prepararán las siguientes soluciones para
trabajar a lo largo del semestre:
• 2 L Medio Luria-Bertani (LB) con ampicilina

• 5 mL IPTG 1 M
• 5 mL ampicilina 100 mg/mL
15
• 250 mL de solución de extracción: Tris 20 mM, pH 8.0 (HCl)
• 5 mL de PMSF 10 mM en isopropanol
• 50 mL de solución de Tris para gel separador SDS-PAGE: Tris 1.5 M pH,
8.8 (HCl)
• 50 mL de solución de Tris para gel concentrador SDS-PAGE: Tris 0.5 M, pH
6.8 (HCl)
• 500 mL de solución de corrida SDS-PAGE 10X: Tris 250 mM, Glicina 1.92
M, SDS 1.0%
• Solución de carga Laemli 5X: Tris 60 mM, Glicerol 25%, SDS 2%, 2-
mercapto etanol 14.4 mM, Azul de bromofenol 0.1%, pH 6.8
• 100 mL de solución de unión para cromatografía de afinidad: Imidazol 5
mM, NaCl 500 mM, Tris 20 mM, pH 7.9 (HCl)
• 250 mL de solución de lavados para cromatografía de afinidad: Imidazol 60
mM, NaCl 500 mM, Tris 20 mM, pH 7.9 (HCl)
• 100 mL de solución de elución para cromatografía de afinidad: Imidazol 1M,
NaCl 500 mM, Tris 20 mM, pH 6.0 (HCl)
• 100 mL de solución de Níquel para cromatografía de afinidad: NiSO4 20
mM
• 500 mL de solución salina de fosfatos: KCl 2.63 mM, KH2PO4 1.46 mM,
NaCl 136.89 mM, Na2HPO4•7H2O 13.5 mM, pH 7.4
• 50 mL de solución de reacción para fosfatasa alcalina: Tris 100 mM,
MgCl2 50 mM, NaCl 100 mM, pH 9.5
• 50 mL de solución de carbonatos para ELISA: NaHCO3 200 mM,
Na2CO3 200 mM
• 250 mL de solución A para tinción de Coomassie: Azul de Coomassie G-
250 0.05%, isopropanol 25%, ácido acético 10%
• 250 mL de solución B para tinción de Coomassie: Azul de Coomasssie
0.008%, isopropanol 10%, ácido acético 10%
• 250 mL de solución C para tinción de Coomassie: Azul de Coomassie
0.002%, ácido acético 10%
• 250 mL de solución D para tinción de Coomassie: Ácido acético 10%
De manera adicional se esterilizará el siguiente material:
• 1 caja de puntas de micropipeta de 200 μL
• 1 caja de puntas de micropipeta de 1000 μL
• 10 tubos cónicos de 15 mL
• 4 matraces de 250 mL
• Tubos de 2.5 mL
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Tema 1. Ensayo de producción y purificación de la proteína
recombinante
Objetivo:
Realizar un ensayo de expresión de la vacuna de subunidades C4(V3)6 a partir de
E. coli recombinante, obtener mediante cromatografía de afinidad la proteína
purificada y elaborar una formulación líquida inyectable para su evaluación como
prototipo de vacuna.
Introducción
El Síndrome de inmunodeficiencia Adquirida causado por el VIH constituye un

problema de salud a nivel mundial. El Programa Conjunto de las Naciones Unidas
sobre el VIH/SIDA (ONUSIDA) estima que, desde el inicio de la epidemia, más de
84 millones de personas se han infectado por el VIH, de las cuales casi la mitad
han fallecido. Sólo durante el año 2021 se calcula que ocurrieron en el mundo 1.5
millones de nuevas infecciones y más de 650,000 defunciones causadas por VIH.
En los últimos años se han logrado avances significativos en el entendimiento de
la patogénesis del VIH/SIDA, así como en el desarrollo de medicamentos
antirretrovirales. Sin embargo, la mejor alternativa para abatir este problema de
salud pública es la vacunación. A la fecha no se ha logrado el desarrollo de una
vacuna efectiva, por lo que deben continuarse los esfuerzos para desarrollar
candidatos vacunales que ofrezcan nuevas posibilidades para lograr dicha meta
(ONUSIDA, 2021).
El desarrollo de una vacuna contra el VIH se enfrenta a enormes desafíos científicos

relacionados principalmente con la alta variabilidad genética del virus y los
mecanismos de evasión frente al sistema inmune. Las evidencias generadas
después de casi tres décadas de investigación sugieren que una vacuna efectiva
contra el VIH debe inducir tanto respuestas humorales como celulares (Girard et
al., 2006).
La identificación de epítopos que generen anticuerpos neutralizantes de amplio

espectro constituye el principal reto. Diversos grupos de investigación se han
centrado en esta tarea y se han sugerido estrategias muy variadas. Entre estas, se
encuentran los péptidos recombinantes que incluyen el asa V3 de la proteína
gp120, secuencia que contiene un epítopo de células B. El asa V3 de gp120 es
un blanco interesante debido a que participa en la interacción con el correceptor
17
CCR5 y se ha demostrado que los anticuerpos dirigidos en contra de este dominio
son capaces de neutralizar el virus (Gaschen et al., 2002).
Por otro lado, se ha descrito un péptido que consiste del dominio conservado C4
de gp120 fusionado al asa V3 de gp120. Una de las características de esta región
de 18 aminoácidos es que debe poseer una estructura α–hélice anfipática. Se ha
demostrado que esta región C4 juega un papel importante en la unión de gp120
al CD4 (Robey et al. 1996). Frey et al. (1999) reportaron que algunos péptidos
sintéticos de la región C4 aumentan considerablemente la respuesta inmune
humoral eliminando la necesidad de adyuvantes. Dichos resultados sugieren que
este enfoque podría ser útil para la inducción de respuestas inmunes contra los
antígenos virales sin requerirse adyuvantes.
Haynes et al. (2006) han reportado un péptido llamado C4V3 basado en la

secuencia consenso del HIV-1 B (RPNNNTRKSIHIGPGRAFYATG), el cual fue capaz
de inducir anticuerpos que neutralizaron un 30% de los aislados primarios
evaluados. A la par, Varona-Santos et al. (2006) reportaron la producción en E.
coli de un polipéptido denominado rC4V3, que incluye el dominio C4, así como el
determinante neutralizante del asa V3 de gp120 del aislado VIH-1MN (Takahashi
et al., 1989). Esta proteína fue producida exitosamente en dicho sistema
heterólogo y purificado mediante el uso de una secuencia de histidinas repetidas
en el extremo carboxilo terminal. Un hallazgo relevante fue el hecho de que el
polipéptido resultó inmunogénico a nivel sistémico y de mucosas
independientemente de la coadministración de un adyuvante. Estos resultados
sugieren que este tipo de proteínas son una herramienta valiosa para el desarrollo
de modelos de vacunas de mucosas sin requerir de adyuvantes y podrían ser la
base para el desarrollo de proteínas multiepítopo contra el VIH.
Govea-Alonso et al. (2013) lograron diseñar, expresar y purificar una proteína

quimérica llamada C4(V3)6 en distintos hospederos de expresión (E. coli, plantas
de tabaco y lechuga), lo que condujo a la obtención de proteínas inmunorreactivas
con sueros de pacientes con VIH, lo que generó reportes relevantes que
contribuyen a desarrollo de candidatos vacunales contra el VIH.
Cuando se producen proteínas para uso terapéutico, ya sean vacunas, hormonas,

factores de crecimiento, anticuerpos monoclonales, etc., se deben considerar varias
normativas relacionadas con la manufactura, purificación y caracterización de estos
productos biotecnológicos. De acuerdo con la Ley General de Salud y el
Reglamentos de Insumos para la Salud de nuestro país, los medicamentos
biotecnológicos, vacunas y otros biológicos requieren de una autorización sanitaria
para su producción y de un registro sanitario para su venta, donde se demuestre
18
la seguridad, calidad y eficacia de estos productos. En general, los biofarmacéuticos
deben cumplir con especificaciones estrictas, especialmente cuando se usan estos
productos por vía parenteral. Para cumplir con los requerimientos de las
autoridades regulatorias, es importante que se establezcan las estrategias óptimas
de producción, desde la etapa “upstream” o de biosíntesis de los productos
recombinantes, hasta la etapa “downstream” o de purificación, donde se
establezcan las operaciones unitarias para lograr la separación del producto
biotecnológico a la vez que se logran las condiciones que garanticen la estabilidad
del principio activo y posibiliten la administración a seres humanos. Las Normas
Oficiales Mexicanas NOM-257-SSA1-2014: en Materia de Medicamentos
Biotecnológicos, NOM-059-SSA1-2015: Buenas Prácticas de Fabricación de
Medicamentos y la NOM-164-SSA1-2015: Buenas Prácticas de Fabricación para
Fármacos establecen las directrices generales de operación y las especificaciones
generales para el control de la fabricación de los medicamentos biotecnológicos.
Durante este curso de laboratorio se realizará la producción, purificación y

evaluación de la actividad biológica del polipéptido C4(V3)6, como un ejercicio
integrador de disciplinas y representativo de un bioproceso para generar un
biofármaco (prototipo de vacuna). De forma teórica, el alumno identificará las
normativas y atributos de calidad que aplican a la fabricación de biofármacos bajo
buenas prácticas de manufactura.
19
Sesión 1. Ensayo de producción de una proteína recombinante con aplicaciones
biomédicas
1. ¿Qué es la proteína C4(V3)6 del VIH? ¿Cuál es el antígeno blanco en el

que se basa este antígeno vacunal y porqué es relevante?
2. Menciona 4 ventajas y cuatro desventajas del uso de células procariotas
para la expresión de biofarmacéuticos
3. ¿Cuál es el objetivo de adicionar IPTG al cultivo de la cepa recombinante?
¿Qué vías moleculares se activan?
4. Describe el protocolo de trabajo para la expresión de la proteína C4(V3)6
Descripción del organismo genéticamente modificado
Se trabajará con células de E. coli TOP10 (Invitrogen) transformadas con el vector

pTrcHis2C-C4(V3)6 reportado por Govea-Alonso et al. (2013).
Genotipo E. coli TOP10: F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Δ lacX74

recA1 araD139 Δ(araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG.
Vector de expresión: pTrcHis2C (Invitrogen).
Fenotipo de la cepa transformada: Resistencia a ampicilina.
Características de la construcción: Regulación bajo el operador lac, promotor trc,

extremo de polihistidinas.
Medidas de seguridad e infraestructura requerida
Para la realización de la práctica es importante seguir las precauciones básicas de

seguridad y siempre portar bata de laboratorio limpia y guantes de nitrilo o látex.
Para el manejo del cultivo en esterilidad se requiere el uso de campana de flujo
laminar.
Materiales, reactivos y equipos
• 1 L de medio LB líquido
• Ampicilina (100 mg/mL)*
20
• IPTG 1M**
• Tubos cónicos de 15 y 50 mL estériles
• Matraces de 250 mL estériles
• Incubadora con agitación
• Espectrofotómetro
* Sensibilización respiratoria y cutánea

** Carcinogenicidad
Protocolo
I. Preinoculación. (Realizado por el profesor)

1. Encender la campana de flujo y esperar 5 min.
2. En un tubo cónico de 50 mL estéril colocar 10 mL de medio LB y
una asada de la clona de E. coli recombinante, adicionar ampicilina
para obtener una concentración final de 50 mg/L.
3. Incubar toda la noche a 37°C con agitación (180 rpm).
II. Crecimiento del cultivo de expresión. (Realizado por los equipos de trabajo)
1. Colocar 4 mL del preinóculo en dos matraces de 250 mL estériles
con 100 mL de medio LB con ampicilina (50 mg/L)
2. Incubar a 37°C hasta alcanzar una OD = 0.6 uAbs
3. Agregar a uno de los cultivos el IPTG (1 M) necesario para una
concentración final 1 mM e inducir la expresión de la proteína
recombinante, el otro matraz será usado como control negativo
4. Incubar a 28 °C toda la noche con agitación constante (18 h)
5. Centrifugar el contenido de los matraces en tubos cónicos de 50 mL
estériles por 10 min a 5000 x g. Descartar el sobrenadante
6. Guardar la pastilla celular a -20°C
Medidas de contención biológica
Nivel de bioseguridad 1. E. coli TOP10 es una cepa comercial derivada de la cepa

ancestral K-12, la cual es una cepa de laboratorio que no puede sobrevivir en el
tracto digestivo humano y no produce toxinas. La modificación genética de la cepa
C4(V3)6 no modifica el grado de virulencia o patogenicidad de la cepa comercial.
El uso de este organismo genéticamente modificado es de uso exclusivo en

investigación y por lo tanto no debe liberarse al ambiente. En caso de un derrame
accidental se debe limpiar inmediatamente las superficies contaminadas e
21
inactivarlas con una solución de etanol al 70% o hipoclorito de sodio al 0.4% por
5 minutos.
Manejo de los residuos generados
Los residuos del cultivo del organismo genéticamente modificado deberán ser
tratados previo a su disposición final mediante esterilización en autoclave (120
psi/in2 durante 30 min). Los residuos deberán ser identificados en todo momento
y el material o superficies que tengan contacto con ellos también deberán
inactivarse químicamente.
En esta sesión no se generan residuos químicos peligrosos.
Normativa vigente aplicable
Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados.
NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección Ambiental - Salud Ambiental – Residuos

Peligrosos Biológico-Infecciosos – Clasificación y Especificaciones de Manejo.
Análisis de datos
En esta sesión no se requiere realizar análisis de datos.
Resultados esperados
Se espera obtener exitosamente un cultivo bacteriano productor de la proteína

recombinante C4(V3)6, el cual será procesado sesiones posteriores para purificar
el biofármaco.
22
Sesión 2. Purificación de proteínas recombinantes. Obtención del extracto
proteico
1. ¿Discuta las ventajas y limitantes que se presentan cuando una proteína

recombinante se recupera de la fracción soluble o de la fracción insoluble?
2. Describa el fundamento de la cuantificación de proteínas por el método de
Bradford e identifique algunas de las limitantes de esta técnica
3. Describa el procedimiento para la extracción de la proteína C4(V3)6 de E.
coli

Para el manejo de cultivo se requiere el uso de campana de esterilidad.
• Solución de extracción (Tris-HCl 20 mM pH 8.0)

• PMSF 10 Mm*
• Albúmina de suero bovino (BSA)
• Reactivo de Bradford concentrado**
• Tubos cónicos 15 mL
• Tubos para microcentrífuga 1.5 mL
• Homogenizador ultrasónico de punta
• Baño de hielo
• Centrífuga
* Tóxico, provoca quemaduras oculares y cutáneas

** Toxicidad aguda, corrosión o irritación cutáneas, corrosivo para
metales, líquido inflamable
Protocolo
Obtención del extracto proteico

1. Resuspender la pastilla en 5 mL de solución de extracción (Tris-HCl
20 mM pH 8.0) con PMSF 0.1 mM
23
2. Lisar las células mediante sonicación: 3 pulsos de 8 segundos en
baño de hielo, con una amplitud 24% y 10 segundos de descanso
entre cada pulso
3. Centrifugar a 5000 x g por 15 min, colectar el sobrenadante en tubos
cónicos de 15 mL e inactivar la pastilla con restos celulares con una
solución de hipoclorito de sodio al 4%
4. Almacenar el sobrenadante en hielo o a -20°C
Cuantificación de proteína soluble por el método de Bradford
1. Preparar estándares de BSA (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL) en
solución de extracción (Tris-HCl 20 mM pH 8.0) a partir de un stock
de 10 mg/mL
2. Preparar el volumen necesario de reactivo de Bradford diluido (1:4)
en agua destilada
3. Preparar diluciones de las muestras de proteína soluble (1/10 y 1/5)
4. En una paca de 96 pozos 4 µL de blanco, estándar o muestra y 200
µL de reactivo diluido
5. Reposar 5 min a temperatura ambiente y leer la densidad óptica a
595 nm
6. Elaborar la curva patrón de BSA (Abs vs. Concentración) e interpolar
los valores obtenidos de las muestras para calcular la concentración
de proteína
Medidas de contención biológica
Nivel de bioseguridad 1. E. coli TOP10 es una cepa comercial derivada de la cepa

ancestral K-12, la cual es una cepa de laboratorio que no puede sobrevivir en el
tracto digestivo humano y no produce toxinas. La modificación genética de la cepa
C4(V3)6 no modifica el grado de virulencia o patogenicidad de la cepa comercial.
El uso de este organismo genéticamente modificado es de uso exclusivo en

investigación y enseñanza, por lo tanto, no debe liberarse al ambiente. En caso de
un derrame accidental se debe limpiar inmediatamente las superficies
contaminadas e inactivarlas con una solución de etanol al 70% o hipoclorito de
sodio al 0.4% por 5 minutos.
Los residuos del cultivo del organismo genéticamente modificado deberán ser
tratados previo a su disposición final ya sea mediante inactivación química con
hipoclorito de sodio al 4% (en el caso de superficies) o esterilizados en autoclave
24
(en el caso de residuos líquidos y medios de cultivo; 120 psi/in2durante 30 min).
Los residuos deberán ser identificados en todo momento y el material o superficies
que tengan contacto con ellos también deberán inactivarse químicamente.
Los residuos generados de la cuantificación de proteína que contengan reactivo de

Bradford deberán depositarse en un recipiente de plástico asignado para su
resguardo temporal y posterior disposición final.
NOM-005-STPS-1998. Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los

centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias
químicas peligrosas.
NOM-018-STPS-2015. Sistema armonizado para la identificación y comunicación

de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo.
NOM-052-STPS-2005. Que establece las características, el procedimiento de

identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos.
Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados.

Análisis de datos
Se deberá calcular la concentración de proteína total soluble (mg/mL) presente en

ambos extractos del cultivo, tanto para el cultivo control como el cultivo inducido.
25
Sesión 3. Purificación de proteínas recombinantes. Cromatografía de afinidad
1. Menciona el fundamento de la cromatografía de afinidad a metal

inmovilizado
2. Describa el fundamento de otros dos tipos de cromatografía empleadas en
la purificación de biofármacos
3. Investigue cuales son lo grados de pureza que se requieren para los
biofármacos de uso en humanos
4. Investigue cuáles son los niveles de endotoxinas o pirógenos permisibles en
biofármacos para uso en humanos y por qué este es un atributo relevante

Para la purificación de la proteína se requiere el uso de un cromatógrafo para uso
exclusivo de proteínas.
• Solución de unión (Imidazol* 5 mM, NaCl 0.5 M, Tris-HCl 20 mM pH

7.9)
• Solución de lavado (Imidazol* 60 mM, NaCl 0.5 M, Tris-HCl 20 mM
pH 7.9)
• Solución de elución (Imidazol* 1 M, NaCl 0.5 M, Tris-HCl 20 mM pH
6.0)
• Resina de agarosa con Níquel**
• Tubos para microcentrífuga estériles
• Columna con filtro
• Bomba peristáltica y/o cromatógrafo de proteínas
* Toxicidad aguda, corrosión cutánea, lesiones oculares, toxicidad para

la reproducción
** Líquido inflamable, contiene etanol
Protocolo
26
Configuración del equipo
Flujo: 0.5 mL/min
Colección de fracciones 1.5 mL

1. Cargar la columna con 3.5 ml de resina y lavar con H2O milliQ (2
veces)
2. Equilibrar la columna con 6 ml de solución de unión (Imidazol 5 mM,
NaCl 0.5 M, Tris-HCl 20 mM pH 7.9)
3. Inyectar 3 mL del extracto de proteína centrifugado
4. Comenzar la colección de las fracciones en tubos para
microcentrífuga de 1.5 mL
5. Lavar la columna con 10 volúmenes de solución de unión (Imidazol
5mM, NaCl 0.5 M, Tris-HCl 20 mM pH 7.9) o hasta que no haya
cambios en la absorbancia
6. Lavar con 6 volúmenes de solución de lavados (Imidazol 60 mM,
NaCl 0.5 M, Tris-HCl 20 mM pH 7.9) o hasta que no haya cambios
en la absorbancia
7. Liberar a la proteína con solución de elución (Imidazol 1 M, NaCl 0.5
M, Tris-HCl 20 mM pH 6.0) por 3 volúmenes de columna
8. Recuperar los tubos con las fracciones etiquetadas y resguardarlas a
-20°C
Los residuos eluidos de la columna cromatográfica contienen Imidazol y por lo

tanto deberán depositarse en un recipiente de plástico asignado para su resguardo
temporal y posterior disposición final.


27
identificación, clasificación y los listados de e los residuos peligrosos.
Análisis de datos
Se deberá graficar el cromatograma obtenido (Absorbancia vs. Volumen en mL) e

indicar el momento de inyección de la muestra, el inicio de la colección de las
fracciones y la elución de la proteína purificada.
28
Sesión 4. Análisis de proteína recombinantes mediante electroforesis
1. Menciona el fundamento de la separación de proteínas mediante

electroforesis con geles de poliacrilamida
2. Mencione cuál sería la estrategia para validar la estabilidad de un biofármaco
con base en las normas internacionales.
3. ¿Cuál será el patrón electroforético observado para la proteína C4(V3)6
purificada? ¿En qué fracción y en qué rango de peso molecular esperas
observar una banda?

Durante esta sesión se trabajará con acrilamida, la cual es neurotóxica, por lo que
las soluciones, material y superficies que hayan tenido contacto con ella deberán
manipularse con guantes.
• Gel SDS-PAGE al 12% *

• Solución de corrida 10X: Tris 250 mM, Glicina 1.92 mM, SDS**
1.0%
• Solución de carga Laemli 5X: Tris 60 mM, Glicerol 25%, SDS** 2%,
2-mercapto etanol*** 14.4 mM, Azul de bromofenol 0.1%, pH 6.8
• Solución A de tinción de Coomassie: Coomassie G-250 0.05%,
isopropanol**** 25%, ácido acético***** 10%
• Solución B de tinción de Coomassie: Coomassie G-250 0.008%,
isopropanol**** 10%, ácido acético***** 10%
• Solución C de tinción de Coomassie: Coomassie G-250 0.002%,
ácido acético***** 10%
• Solución D de tinción de Coomassie: Ácido acético***** 10%
• Cámara de electroforesis
• Horno de microondas
*Contiene acrilamida, manejar con guantes y lentes de seguridad Nocivo en

caso de ingestión, provoca irritación cutánea, irritación ocular grave, puede
29
provocar defectos genéticos, cáncer, perjudicar la fertilidad, dañar al sistema
nervioso periférico, nocivo para organismos acuáticos
** Sólido inflamable, nocivo en caso de ingestión, provoca irritación y
lesiones cutáneas, puede irritar las vías respiratorias, tóxico para organismos
acuáticos
*** Líquido combustible, tóxico en caso de ingestión o inhalación,
mortal en contacto con la piel, provoca irritación cutánea y lesiones oculares graves,
puede perjudicar la fertilidad, provocar daños en órganos, muy tóxico para los
organismos acuáticos
**** Líquido inflamable, provoca irritación ocular grave, puede provocar
somnolencia o vértigo
***** Líquido inflamable, provoca quemaduras en la piel y lesiones oculares
Protocolo
1. Preparar 1 L de solución de corrida 1X

2. Montar el gel de poliacrilamida en la cámara de electroforesis y
adicionar la solución de corrida 1X, asegurándose de que los pozos
estén inmersos en la solución y no haya fuga de líquido en el sistema
3. Mezclar 40 µL de las muestras con 10 µL de solución de carga
Laemli 5X en tubos de 1.5 mL
4. Desnaturalizar la proteína presente en las muestras calentando los
tubos a 95°C por 5 min. Centrifugar y dejar enfriar
5. Cargar 25 µL de las muestras a cada pozo del gel de electroforesis
en el siguiente orden:
1. Marcador de peso molecular
2. Proteína total sin IPTG
3. Proteína total con IPTG
4. Pozos sucesivos, fracciones seleccionadas de la
cromatografía
6. Separar las proteínas a 80 y 160 V
7. Teñir el gel con las soluciones de tinción A, B, C y D por 20 s al
microondas
8. Enjuagar el gel con agua destilada
9. Capturar imagen del gel y las bandas observadas en el
fotodocumentador
NOTA: El peso de la proteína C4(V3)6 es aproximadamente de 40 KDa.
30
Los residuos de la mezcla de la solución de carga y las muestras de proteínas

contienen 2-mercaptoetanol y deberán colectarse en el recipiente de plástico
asignado para su resguardo temporal y posterior disposición final.
Los geles de acrilamida y cualquier material de desecho (guantes o toallas de

papel) deberán colectarse en el recipiente de residuos correspondiente para su
Los residuos de la tinción de Coomassie y sus lavados contienen Azul de

Coomassie, isopropanol y ácido acético por lo que deben colectarse en el recipiente
de residuos correspondiente para su resguardo temporal. Posteriormente los
residuos serán neutralizados, el alcohol será evaporado en campana de extracción
y el remanente se almacenará hasta su disposición final.



Análisis de datos
A partir de la imagen obtenida, indicar el tamaño de las bandas del marcador de

peso molecular e identificar las muestras cargadas en cada carril del gel, así como
señalar la banda correspondiente a la proteína recombinante. Investigar la fórmula
para determinar el peso molecular con base a la movilidad electroforética y realizar
dicho cálculo para la proteína C4(V3)6.
31
Sesión 5. Formulación de un prototipo de vacuna
1. ¿Cuál es el objetivo de la purificación y la formulación de

biofarmacéuticos?
2. ¿Qué tipo de formulaciones se pueden utilizar para la dispensación
(administración) de proteínas terapéuticas?
3. Defina excipiente, adyuvante y vehículo.
4. ¿Cuál es el objetivo del uso del adyuvante hidróxido de aluminio e
identifique sus ventajas y limitantes para la formulación de vacunas
de uso en humanos?
5. ¿Qué factores pueden afectar la estabilidad de las proteínas?

• Solución de fosfatos (KCl 2.63 mM, KH2PO4 1.46 mM, NaCl

136.89 mM, Na2HPO4.7H20 13.5 mM, pH 7.4)
• Albúmina de suero bovino
• Reactivo de Bradford concentrado*
• Hidróxido de aluminio
• Centricones con un tamaño de corte de 10 KDa
• Filtros para esterilizar de 0.2 µm
• Tubos 15 y 1.5 mL estériles
• Centrífuga
• Campana de flujo laminar
* Toxicidad aguda, corrosión o irritación cutáneas, corrosivo para

metales, líquido inflamable
Purificación y concentración de la proteína C4(V3)6
1. A partir de las fracciones seleccionadas, filtrar la proteína C4(V3)6

por ultrafitración con centricones de 10 KDa a 5000 x g por 15 min
32
2. Adicionar solución de fosfatos (KCl 2.63 mM, KH2PO4 1.46 mM, NaCl
136.89 mM, Na2HPO4.7H20 13.5 mM, pH 7.4) a la fracción
concentrada y filtrar nuevamente por 5000 x g por 15 min. Repetir
este paso al menos 3 veces
3. Colectar la fracción concentrada y cuantificar el contenido de proteína
Cuantificación de proteína soluble por el método de Bradford
1. Preparar estándares de BSA (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL) en
solución de fosfatos (KCl 2.63 mM, KH2PO4 1.46 mM, NaCl 136.89
mM, Na2HPO4.7H20 13.5 mM, pH 7.4) a partir de un stock de 10
mg/mL
2. Preparar el volumen necesario de reactivo de Bradford diluido (1:4)
en agua destilada
3. Preparar diluciones de las muestras (1/10 y 1/5)
4. En una paca de 96 pozos 4 µL de blanco, estándar o muestra y 200
µL de reactivo diluido
5. Reposar 5 min a temperatura ambiente y leer la densidad óptica a
595 nm
6. Elaborar la curva patrón de BSA (Abs vs. Concentración en mg/mL)
e interporlar los valores obtenidos de las muestras para calcular la
concentración de proteína
Preparación de la formulación
1. Ajustar la concentración de proteína purificada a 0.1 mg/mL en PBS

2. Esterilizar la proteína purificada por filtración.
3. Separar en alícuotas individuales (100 µL) en tubos de 1.5 mL
estériles
4. Adicionar 100 µL de hidróxido de aluminio a las formulaciones
correspondientes al control positivo
5. Conservar a -20°C
Los residuos generados de la cuantificación de proteína que contengan reactivo de

Bradford deberán depositarse en un recipiente de plástico asignado para su

33


Análisis de datos
Se deberá calcular la concentración de proteína C4(V3)6 purificada (mg/mL), su

% de pureza y el rendimiento final del bioproceso (% de proteína purificada con
respecto a la proteína soluble total).
NOTA: Para los cálculos tomar en cuenta el volumen del extracto de proteína
soluble inyectado en la columna y el volumen final recuperado de la ultrafiltración.
34
Tema 2. Análisis de la inmunogenicidad del polipéptido C4(V3)6
purificado
Objetivo:
Analizar la capacidad del antígeno C4(V3)6 para inducir una respuesta humoral
específica en ratones BALB/c, en un esquema de inmunización subcutánea
empleando el adyuvante hidróxido de aluminio, el cual es aprobado para vacunas
de uso en humanos.
Introducción
El proceso de inmunización es aquel en el que se inyecta un antígeno bajo dosis

controladas con la finalidad de inducir una respuesta inmune. En general se divide
en dos fases: a) sensibilización o primovacunación, en la cual se administra una
dosis de antígeno y b) inmunizaciones de refuerzo ('booster'). En la primera fase
se genera una respuesta inmune primaria, la cual es madurada y expandida en la
segunda fase de administración de refuerzos. Existen numerosos protocolos de
inmunización, con una duración variable, sin embargo, un criterio común en el caso
de humanos es la administración de 2-3 dosis aplicadas a intervalos de 20-30
días. Para fines experimentales, en modelos murinos dichos intervalos pueden estar
en un rango de 7-21 días (Zhou et al. 2020).
La dosis del antígeno dependerá de la especie animal empleada, oscilando en un

rango de 1-30 µg para el caso de ratón y entre 50-200 µg para el caso del
humano.
Los ratones BALB/c albinos constituyen una cepa pura originaria de Nueva York
en 1920 que se encuentra entre las cinco cepas puras más utilizadas en
investigación biomédica. Dada la facilidad con que este biomodelo murino puede
reproducirse y mantenerse bajo condiciones controladas y el conocimiento que se
tiene de su sistema inmunológico, se aplica ampliamente para validar prototipos
de vacunación en la fase preclínica, en términos de su inmunogenicidad y seguridad
(Nakamura, 2013).
Uno de los parámetros de inmunogenicidad más valiosos y de fácil medición es la

respuesta humoral. Ante la administración del antígeno, este es procesado por
células presentadoras de antígeno que subsecuentemente presentan las
secuencias unitarias de este antígeno (epítopos) a los linfocitos B.
Alternativamente, los linfocitos B pueden reconocer algunos epítopos en el
antígeno de forma directa. Posteriormente se detona un evento de selección clonal,
35
que corresponde a una proliferación específica de linfocitos B que cuentan con un
receptor con alta afinidad hacia el epítopo en cuestión, para posteriormente
diferenciarse en células plasmáticas con la capacidad de secretar dicho receptor
que posee la capacidad de reconocimiento del antígeno. Estas moléculas
secretadas constituyen a los anticuerpos, que constituyen las moléculas efectoras
de la respuesta inmune humoral bajo distintos mecanismos (Abbas et al., 2021).
Los niveles de anticuerpos específicos constituyen por tanto un biomarcador
relevante para determinar la actividad biológica de una vacuna y se pueden
determinar mediante un ensayo de inmunoadsorición ligado a enzimas (Enzyme-
Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA).
36
Sesiones 6,7 y 8. Inmunogenicidad del prototipo vacunal. Inmunización
1. Identifique las diferencias entre el concepto de antigenicidad y de

inmunogenicidad
2. Proponga una estrategia experimental para evaluar la eficacia
inmunoprotectora del antígeno C4(V3)
3. Defina el concepto de título de anticuerpos y cómo se determina a
partir de un ELISA

Toda manipulación de animales de laboratorio será realizada en el espacio
asignado por la Unidad de Biociencias de la Facultad de Ciencias Químicas.
Descripción del modelo animal
Cada grupo de laboratorio trabajará con 6 ratones BALB/c hembras de 8-9

semanas de edad, sanas y con un peso aproximado entre 25 y 30 g. Los animales
de experimentación se mantendrán en condiciones estándar de temperatura y foto
periodo en una caja de acrílico, con alimento regular y agua ad libitum durante 4
semanas a cargo del personal responsable en la Unidad de Biociencias.
Trabajo previo requerido por el estudiante
Es importante que los estudiantes reciban una capacitación previa a la

manipulación de los animales, con el fin de crear conciencia sobre el bienestar
animal, el papel y la información que brinda la investigación con animales y
familiarizarse con los métodos más comunes para el manejo de ellos (técnicas de
sujeción, inmovilización, diferentes vías de administración, tomas de muestra y
métodos de eutanasia permitidos). Para cumplir con esta capacitación el profesor
asignado compartirá el material audiovisual pertinente y además se requiere que
los estudiantes cursen y aprueben el programa de inducción creado por la Unidad
de Biociencias de la Facultad de Ciencias Químicas que se encuentra disponible en
la plataforma DidacTIC. Solo podrán asistir aquellos estudiantes que hayan
demostrado el cumplimiento de estos requisitos.
Intervención del profesor y participación de los estudiantes
37
El profesor dará una demostración a los estudiantes de las técnicas correctas de
sujeción, inmovilización e inmunización de los animales previo a la participación de
los alumnos y deberá estar presente durante todas las sesiones para asegurar el
bienestar de los animales e intervenir o asistir en caso de que sea requerido. Los
estudiantes deberán guardar siempre el orden, la calma y el respeto hacia los
animales. Solo se permitirá que los estudiantes trabajen de forma individual con un
animal a la vez con el fin de evitar estrés innecesario.
No está permitido el uso de celulares o cámaras de video y fotográficas durante

las sesiones que se trabaje con animales de experimentación.
Materiales y Reactivos
• Proteína C4(V3)6 pura

• Solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS)
• Hidróxido de aluminio (adyuvante)
• Solución de etanol al 96%*
• Jeringas de insulina estériles 0.3 mL, aguja 31G x 6mm
• Torundas de algodón
* Líquido inflamable, provoca irritación ocular grave
Protocolo
Se realizará un protocolo de inmunización en ratones divididos en 3 grupos:
o Grupo 1: Control positivo (proteína C4(V3)6 pura). 2 ratones

o Grupo 2: Muestra problema (proteína C4(V3)6 pura + adyuvante). 2 ratones
o Grupo 3: Control negativo (PBS). 2 ratones
Desinfectar la zona de inyección con una torunda con alcohol e inmunizar a los
animales por administración subcutánea con jeringas de insulina en el lomo. Se
realizarán tres inmunizaciones a intervalos de 1 semana (días 1, 8 y 15). A
continuación, se enlistan los grupos experimentales a establecer:
• Grupo 1: Control positivo (10 µg en 0.1 mL de proteína C4(V3)6 pura)

• Grupo 2: Muestra problema, 10 µg en 0.1 mL de la proteína obtenida
coadministrada con 0.1 mL de adyuvante
38
• Grupo 3: Control negativo (100 µL de PBS)
Durante esta sesión no se generan residuos químicos peligrosos. Descartar las

jeringas usadas en el recipiente rojo para punzocortantes. Estos residuos serán
almacenados temporalmente (lapso no mayor a 30 días) hasta la fecha de acopio
por la Unidad de Biociencias de la Facultad.
NOM-062-ZOO-1999. Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso

de los animales de laboratorio

Análisis de datos
En estas sesiones no se requiere realizar análisis de datos.
Tomar el registro de peso corporal y revisar el estado general de los animales.
Indicaciones generales para la manipulación de los animales de experimentación
Inmovilización
1. Retirar al ratón de la jaula sujetándolo gentilmente de la base de la cola
(preferentemente con la mano). Colocar el animal en la tapa con rejilla de
la jaula para permitir que se aferre a las barras (Figura 1A)
2. Alcanzar la parte posterior del cuello con la mano. Sujetar firmemente la piel
detrás de las orejas con los dedos índice y pulgar (Figura 1B)
3. Mover la cola de la mano y colocarla debajo del dedo meñique de la mano
que sujeta el cuello del ratón (Figura 1C)
Inyección subcutánea
39
1. Llenar la jeringa con la solución o medicamento de interés y retirar las
burbujas de aire, ajustando el volumen requerido, de acuerdo con la dosis a
administrar
2. Sujetar manualmente al ratón (Figura 1)
3. Insertar la aguja debajo de la piel en el área interescapular que se levanta
de la misma sujeción con los dedos índice y pulgar
4. Inyectar con presión y velocidad moderadas (Figura 2)
Figura 1. Manejo y sujeción del ratón. Tomado de Donovan et al., 2003.
40
Figura 2. Inyección subcutánea. Tomado de Donovan et al., 2003.
41
Sesión 9. Inmunogenicidad del prototipo vacunal. Obtención del antisuero
1. Mencione tres procedimientos aceptados para la extracción de sangre

de roedores, incluya la información sobre las consideraciones
implicadas en cada método, ventajas y desventajas
2. Mencione cuatro métodos de anestesia utilizados para el manejo de
animales de laboratorio, duración del efecto, dosis o tiempos de
aplicación y limitantes
3. Describa cómo se evaluaría la respuesta inmune celular inducida por
un candidato vacunal en roedores.

Toda manipulación de animales de laboratorio será realizada en el espacio
asignado por la Unidad de Biociencias de la Facultad de Ciencias Químicas.
Descripción del modelo animal
Cada grupo de laboratorio trabajará con 6 ratones BALB/c hembras de 8-9

semanas de edad, sanas y con un peso corporal aproximado entre 25 y 30 g. Los
animales de experimentación se mantendrán en condiciones estándar en una caja
de acrílico, con alimento regular y agua ad libitum durante 4 semanas a cargo del
personal responsable en la Unidad de Biociencias.
Trabajo previo requerido por el estudiante
Es importante que los estudiantes reciban una capacitación previa a la

manipulación de los animales, con el fin de crear conciencia sobre el bienestar
animal, el papel y la información que brinda la investigación con animales y
familiarizarse con los métodos más comunes para el manejo de ellos (técnicas de
sujeción, inmovilización, diferentes vías de administración, tomas de muestra y
métodos de eutanasia permitidos). Para cumplir con esta capacitación el profesor
asignado compartirá el material audiovisual pertinente y además se requiere que
los estudiantes cursen y aprueben el programa de inducción creado por la Unidad
de Biociencias de la Facultad de Ciencias Químicas que se encuentra disponible en
42
la plataforma DidacTIC. Solo podrán asistir aquellos estudiantes que hayan
demostrado el cumplimiento de estos requisitos.
Intervención del profesor y participación de los estudiantes
El profesor dará una demostración a los estudiantes de las técnicas correctas de

sujeción, inmovilización, inmunización y eutanasia de los animales previo a la
participación de los alumnos y deberá estar presente durante todas las sesiones
para asegurar el bienestar de los animales e intervenir o asistir en caso de que sea
requerido. Los estudiantes deberán guardar siempre el orden, la calma y el respeto
hacia los animales. Solo se permitirá que los estudiantes trabajen de forma
individual con un animal a la vez con el fin de evitar estrés innecesario.
No está permitido el uso de celulares o cámaras de video y fotográficas durante

las sesiones que se trabaje con animales de experimentación.
Materiales y Reactivos
• Solución de etanol al 96%*

• Solución de etanol al 70% (para desinfección de superficies)
• Solución de hipoclorito de sodio al 4%
• Pentobarbital sódico inyectable de uso veterinario
• Jeringas estériles de 3 mL, aguja 21 G x 32 mm
• Jeringas de insulina estériles de 0.3 mL, aguja 31G x 6mm
• Torundas de algodón
• Aplicadores de madera
• Tubos para microcentrífuga de 1.5 mL
• Pipetas Pasteur desechables
* Líquido inflamable, provoca irritación ocular grave
Protocolo
NOTA: Asegurarse de que los animales que no serán manipulados inmediatamente

se mantengan alejados de la zona de la toma de muestra, con la finalidad de evitar
la inducción de estrés derivado de la detección del olor a sangre.
43
1. Desinfectar el vientre del animal con una torunda con alcohol y sedarlo con
una inyección de pentobarbital sódico por vía intraperitoneal a una dosis de
50 mg/kg
2. Permitir que el animal alcance la sedación en una superficie y recipiente
seguro. Verificar la sedación por la ausencia de reflejo al apretar la cola o la
almohadilla plantar
3. Colocar al animal en decúbito supino y extraer la sangre por punción
cardiaca con una jeringa de 3 mL
4. Recolectar la sangre completa en un tubo para microcentrífuga de 1.5 mL y
dejar reposar para la formación del coagulo sanguíneo durante 30 min a
temperatura ambiente.
5. Colocar al animal en decúbito prono y realizar la eutanasia mediante
dislocación cervical. Tomar al animal por la base de la cola con una mano,
con los dedos índice y pulgar de la otra mano sujetar la base del cráneo y
ejercer tracción hacia atrás a través de la base de la cola
6. Después de extraer las muestras de sangre de todos los ratones, retirar
cuidadosamente los coágulos de la pared de los tubos con un aplicador de
madera. Si se requiere mejor retracción del coágulo, mantenga la sangre
refrigerada a 4ªC durante 2 a 4 horas.
7. Centrifugue las muestras a 1000vg durante 15 min a 4°C
8. Cuidadosamente separe el suero por decantación o con pipeta Pasteur. El
suero obtenido debe estar libre de células.
9. Colecte el suero en viales de 0.2 mL y almacene a -20°C.
10. Desinfectar la superficie de trabajo con etanol al 70%.
Resguardar los cadáveres de los animales en bolsas para RPBI amarillas (residuos
anatómicos) y colocarlos en el refrigerador. Descartar las agujas y/o jeringas en el
recipiente rojo para punzocortantes. Colocar el material que se haya impregnado
con sangre en la bolsa roja. Estos residuos serán almacenados temporalmente
(lapso no mayor a 30 días) hasta la fecha de acopio por la Unidad de Biociencias
de la Facultad.
Inactivar los residuos del paquete celular sanguíneo con hipoclorito de sodio al 4%
por 10 min y descartar posteriormente en el drenaje.
44
NOM-062-ZOO-1999. Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso
de los animales de laboratorio

Análisis de datos
En esta sesión no se requiere realizar análisis de datos.
Indicaciones generales para la manipulación de los animales de experimentación
Inyección intraperitoneal
1. Llenar la jeringa con la solución o medicamento de interés y retirar las
burbujas de aire
2. Sujetar manualmente al ratón
3. Exponer el abdomen el animal inclinando la cabeza hacia abajo
4. Insertar la aguja en el cuadrante inferior izquierdo o derecho del abdomen,
evitando la zona central abdominal (Figura 3)
5. Inyectar con presión y velocidad moderadas
Figura 3. Inyección intraperitoneal. Tomado de Donovan et al., 2003.
Extracción de sangre por punción cardiaca
45
1. Anestesiar al animal y colocarlo en decúbito supino
2. Insertar una jeringa de 1 a 3 mL acoplada a una aguja calibre 20 a 22
debajo y ligeramente a la izquierda del cartílago xifoides en la base del
esternón en un ángulo de 15° a 20° (Figura 4)
3. Avanzar lentamente con la aguja, aplicando una ligera presión negativa con
el émbolo de la jeringa
4. La sangre fluirá hacia la base de la aguja cuando la punta haya entrado a
una de las cavidades del corazón. Aspirar gentilmente hasta que deje de fluir
la sangre. Avanzar o retraer la punta de la aguja puede ser necesario para
obtener el máximo volumen de sangre. Para prevenir la hemólisis, evitar una
succión excesiva en la jeringa y retirar la aguja de la jeringa antes de
transferir la sangre de la jeringa al tubo de colección.
5. Asegurar la muerte del ratón por dislocación cervical una vez que se haya
completado la colección de la sangre
Figura 4. Punción cardiaca. Tomado de Donovan et al., 2003.
Dislocación cervical
1. Retirar al animal de la jaula sujetándolo de la base de la cola y colocarlo en

una superficie dura sin soltar la cola
2. Colocar un lápiz, una barra de metal o sujetar con los dedos firmemente
detrás de las orejas y a través del cuello
3. Tirar de la cola rápidamente y con firmeza hacia atrás mientras se presiona
hacia abajo el cuello
46
Sesión 10. Eficacia biológica de biofarmacéuticos
1. Describa el fundamento de la técnica ELISA y sus variantes

2. ¿Cuáles son las aplicaciones de la técnica ELISA?
3. Elabore un esquema de trabajo que describa el protocolo que se desarrollará
durante la práctica

• Sueros de ratón
• Solución amortiguadora de carbonatos
• Solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS)
• Solución de lavados PBS-T (PBS + Tween 20 al 1%)
• Solución de incubación PBS-T (PBS + Tween 20 al 0.1%)
• Solución alcalina de fosfatos pH 9.5
• Anticuerpo secundario contra IgG de ratón producido en cabra acoplado a
fosfatasa alcalina
• Solución de p-nitrofenol fosfato*
• Leche Svelty baja en grasa
• Solución de hipoclorito de sodio al 4%
• Placas de 96 pozos para ELISA
• Lector de microplacas UV-Vis
* Carcinogenicidad, toxicidad para la reproducción, toxicidad específica en

hígado y riñón
Protocolo
Procedimiento ELISA:
a) Sensibilizar la placa con la proteína C4(V3)6 (50 ng por pozo) diluida en
buffer de carbonatos en un volumen final de 100 µL por pozo.
47
b) Incubar toda la noche a 4ºC
c) Lavar la placa 3 veces con la solución de lavados PBS-T
d) Añadir 100 µL del suero de prueba diluido 1:3000 en PBS-T
e) Incubar 1 h a 37ºC
f) Lavar la placa 3 veces con la solución de lavados PBS-T
g) Añadir 100 µL del anticuerpo secundario anti-IgG unido a fosfatasa alcalina.
Diluir el anticuerpo 1:10,000 en solución de incubación PBS-T
suplementado con 1% leche Svelty baja en grasa
h) Incubar 1 h a 37ºC
i) Lavar la placa 3 veces con la solución de lavados PBS-T
j) Añadir 100 µL del substrato p-nitrofenol fosfato a una concentración de
1mg/mL diluido en Buffer alcalino de fosfatos
k) Incubar 30 min a 37ºC
l) Leer la absorbancia a 405 nm
Los residuos generados del ELISA que contengan p-nitrofenol fosfato deberán
depositarse en un recipiente de plástico asignado para su resguardo temporal y
posterior disposición final.
Inactivar los residuos del suero animal con hipoclorito de sodio al 4% por 10 min
y descartar posteriormente en el drenaje.




48
Análisis de datos
Determinar el porcentaje de respuesta y la magnitud de la misma entre los grupos

control positivo y problema con respecto a la respuesta obtenida en el control
negativo. Realizar un ANOVA de los promedios de cada grupo para establecer si
hay diferencias estadísticamente significativas entre cada grupo (P<0.05).
Resultados esperados
Se espera detectar diferencias estadísticas entre los grupos que permitan discernir
si el tratamiento con la proteína C4(V3)6 y el uso del adyuvante indujeron en los
ratones una respuesta de anticuerpos contra la proteína recombinante, como una
primera evidencia del potencial que tiene este prototipo vacunal en términos de su
inmunogenicidad.
Al término de todas las sesiones prácticas, el alumno deberá recabar todos sus
resultados y observaciones experimentales para realizar un reporte post-
laboratorio.
49
Reporte Post-laboratorio
Indicaciones generales y cuerpo del documento
Cada alumno deberá entregar un reporte post-laboratorio que será elaborado con
formato de artículo publicado, archivo pdf, en español, siguiendo las
especificaciones de la revista Vaccine (https://www.journals.elsevier.com/vaccine).
El cuerpo del artículo incluirá:
• Información de la revista: Título, página de internet, editorial, información

bibliográfica en todas las hojas del documento.
• Título del trabajo: conciso en informativo.
• Los nombres y las afiliaciones de los autores: el alumno que elaboró el
reporte será el primer autor, los demás miembros del equipo serán los
autores subsecuentes (ordenados por orden alfabético) y el profesor del
laboratorio será el "corresponding author", que deberá ir en último lugar. La
afiliación deberá incluir los datos de la Facultad de Ciencias Químicas y el
Laboratorio de Diseño de Biofarmacéuticos.
• Abstract: deberá plasmar el objetivo del trabajo realizado durante las
prácticas del laboratorio, los resultados más relevantes y la conclusión
principal; no deberá ser mayor a 200 palabras y deberá estar en INGLÉS.
• Información/historia del artículo: fecha de término de las sesiones prácticas,
fecha de inicio de elaboración del reporte/artículo, fecha de entrega del
reporte y fecha de publicación (fecha de entrega de calificaciones).
• Palabras clave relevantes con la información presentada en el artículo y que
facilitarán la búsqueda en internet); máximo seis palabras clave.
• Una introducción breve que marque los objetivos del trabajo, un marco de
referencia y antecedentes bibliográficos pertinentes.
• Materiales y métodos: esta sección deberá tener suficiente detalle para que
otra persona con conocimientos básicos del área pueda reproducir los
experimentos.
• Resultados claros y concisos
• Discusión: esta sección deberá explorar el impacto de los resultados del
trabajo, no repetirlos. Evitar el uso excesivo de citas
• Figuras y tablas que muestren los resultados obtenidos. Estas deberán
citarse apropiadamente en el texto y mostrarse conforme el orden a lo largo
del texto.
Las figuras deberán llevar un pie de figura que iniciará con un nombre (Figura X),
un título que resuma los resultados que presenta y una breve descripción de la
50
ilustración. Es necesario describir las abreviaturas usadas y todas las mediciones
llevarán unidades.
Las tablas deberán llevar un nombre (Tabla X) y un título que resuma los
resultados que presenta. Es necesario describir las abreviaturas usadas y todas las
mediciones llevarán unidades.
• Conclusiones: esta será una sección breve que resalte por sí sola de las
secciones de resultados y discusión.
• Agradecimientos a las personas, instituciones, dependencias, departamentos,
etc. ajenos al Laboratorio de Diseño de Biofarmacéuticos que hayan
contribuido a obtener datos experimentales.
• Declaración de conflicto de interés: en este caso no hay ningún conflicto de
interés, por lo que en esta sección se tendrá que indicar la frase
"Declaraciones de interés: ninguna".
• Referencias: lista de material bibliográfico citado en el trabajo acorde con lo
establecido en el documento anexo.
Indicaciones de formato y estilo
• Tomar en consideración los lineamientos de la revista sobre el manejo de

datos provenientes de animales de laboratorio.
• Para la elaboración de tablas o figuras usar un formato uniforme (fuentes,
estilos y tamaños).
• Incluir las características de la vacuna: dosis e intervalo de dosis, vía de
administración, sitio de inyección, técnica de la administración de la vacuna
(incluido el largo de la aguja), adyuvantes y vacunas concomitantes
administradas, almacenamiento, etc.
• Incluir información relevante del modelo animal: especie, número de animales
usados, rango de peso, etc.
• Todas las hojas deberán ir numeradas.
• La fuente será Times New Roman, los tamaños pueden variar de acuerdo con
la sección.
• El número de palabras del documento, incluyendo referencias, será mínimo
de 3000 palabras y no deberá exceder las 7000 palabras.
51
Referencias bibliográficas
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https://www.elsevier.com/books/cellular-and-molecular-immunology/abbas/978-0-323-75748-5
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Haynes, B. F., Ma, B., Montefiori, D. C., Wrin, T., Petropoulos, C. J., Sutherland, L. L., Scearce, R. M., Denton, C., Xia,
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52

Manual Diseño de Biofarmacéuticos Ago-Dic 2023 Aprobado Por CEID

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

PROGRAMA DE INGENIERÍA DE BIOPROCESOS

Laboratorio de Diseño de Biofarmacéuticos

Dra. Luz María Teresita Paz Maldonado

Dra. Aída Jimena Velarde Salcedo

Aprobación por el Comité de Ética en Investigación y Docencia (FCQ, UASLP):

Nombre del alumno: Objetivo General:

Analizar, proponer, diseñar y evaluar la eficacia (bajo un enfoque integral) de

Misión del Programa Educativo

Formar Ingenieros de Bioprocesos habilitados disciplinariamente para analizar los

Competencias y desempeños desarrollados en el laboratorio

Competencia B. Habilidad para diseñar y realizar experimentos relacionados con la

Desempeño B2. Analiza estadísticamente datos experimentales.

Competencia F. Participa efectivamente en equipos inter y multidisciplinarios que

Desempeño F2. Trabaja en equipo con actitud de tolerancia y liderazgo,

El programa de teoría deberá cursarse simultáneamente con el laboratorio. Se

• Cuestionarios Pre-laboratorio (20%)

Criterios Escala de calificación

Criterios Escala de calificación

Criterios Escala de calificación

• Ley General de Equilibrio Ecológico y Protección al Ambiente

Reglamento del laboratorio

1.- La práctica se iniciará 10 minutos después de la hora indicada, una vez

Medidas en caso de accidentes

QUEMADURAS EN OJOS Y PIEL POR SUSTANCIAS CORROSIVAS

LESIONES OCASIONADAS POR OBJETOS PUNZOCORTANTES.

Distribución del laboratorio

Un residuo peligroso biológico-infeccioso (RPBI) es aquel que contiene agentes

Los RPBIs tendrán un área específica de almacenamiento y resguardo temporal en

Los residuos patológicos, humanos o de animales (que no estén en formol)

Para solicitar el acopio de residuos correspondiente por parte de la Subcomisión

• Llenar el formato establecido de Solicitud para la Disposición de Residuos

La ruta de salida de los RPBIs en la Facultad de Ciencias Químicas es la siguiente:

Tema Sesión Práctica Día

0 Introducción al laboratorio 14 ago

Ensayo de producción de una proteína recombinante

5 Formulación de un prototipo de vacuna 19 y 20 sep

11 Retroalimentación para entrega de reporte 07 y 08 nov

Entrega bitácora de laboratorio 07 y 08 nov

Entrega de reporte final en formato artículo 14 y 15 nov

No es necesario consultar la información específica de la marca disponible en el

Elaborar un breve resumen de las medidas de seguridad de cada reactivo

• Nombre del reactivo

• 2 L Medio Luria-Bertani (LB) con ampicilina

El Síndrome de inmunodeficiencia Adquirida causado por el VIH constituye un

El desarrollo de una vacuna contra el VIH se enfrenta a enormes desafíos científicos

La identificación de epítopos que generen anticuerpos neutralizantes de amplio

Haynes et al. (2006) han reportado un péptido llamado C4V3 basado en la

Govea-Alonso et al. (2013) lograron diseñar, expresar y purificar una proteína

Cuando se producen proteínas para uso terapéutico, ya sean vacunas, hormonas,

Durante este curso de laboratorio se realizará la producción, purificación y

1. ¿Qué es la proteína C4(V3)6 del VIH? ¿Cuál es el antígeno blanco en el

Descripción del organismo genéticamente modificado

Se trabajará con células de E. coli TOP10 (Invitrogen) transformadas con el vector

Genotipo E. coli TOP10: F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Δ lacX74

Vector de expresión: pTrcHis2C (Invitrogen).

Fenotipo de la cepa transformada: Resistencia a ampicilina.

Características de la construcción: Regulación bajo el operador lac, promotor trc,

Medidas de seguridad e infraestructura requerida

Para la realización de la práctica es importante seguir las precauciones básicas de

Materiales, reactivos y equipos

* Sensibilización respiratoria y cutánea