UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA

Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Bioquímicas y Biotecnológicas

Escuela de Ingeniería Biotecnológica

Bioquímica

Jefe de prácticas:

Mgter. Julitza Paredes Fuentes

Integrantes:

Anna María Bernal Chambi

Antuanet Fernanda Carpio Chavez

José Eduardo Del Carpio Dávila
Luiggina Ugarte Tassara

SEMESTRE II

Grupo 01

Arequipa - Perú
2022
 PRACTICA Nº 14

PEROXIDACION LIPIDICA

RELACION DE EXPERIMENTOS

1.- Inducción y evaluación de la peroxidación lipídica

INTRODUCCION.

Los radicales libres son definidos como moléculas o sustancias altamente reactivas,
que presentan un electrón desapareado en su orbital externa, lo cual puede iniciar una
cadena de reacciones al remover un electrón de otra molécula para completar la suya. La
transferencia de electrones hacía el oxígeno resulta en la formación de los siguientes
intermediarios como son el anión superóxido (O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el
radical hidroxilo libre (OH·). De estos intermediarios en la reducción del oxígeno hacia
agua, el radical hidroxilo es indudablemente el radical libre de oxígeno más dañino, pues
está involucrado en reacciones tales como la peroxidación lipídica y generación de otros
radicales tóxicos. El peróxido de hidrógeno, por si sólo no es un radical libre, pero éste
es convertido en radical hidroxilo a través de las reacciones de Fenton o Harver-Weiss en
presencia de Fe2+ o Cu+, prevalentes en las células.

Los radicales libres de oxígeno (o Especies Reactivas de Oxígeno), causan daño a la

mayoría de macromoléculas de las células (proteínas, ácidos nucléicos, lípidos). Así, el
radical hidroxilo se ha descrito que extrae átomos de hidrógeno de los lípidos
(fosfolípidos) de membranas (ácidos grasos poliinsaturados) e inician las llamadas
reacciones de peroxidación lipídica; los peróxidos lipídicos así formados, se
descomponen a especies carbonilo reactivas, tales como el malondialdehido y el
hidroxinonenal, los cuales a su vez reaccionan con proteínas, dañando la integridad de la
membrana celular y la integridad de proteínas transportadoras, colapsando las gradientes
de iones, y conduciendo así hacia la muerte celular. Estos procesos fueron muy bien
documentados por estudios en hematíes; sin embargo, hoy se sabe que similares procesos
también ocurre en células nucleadas, lo que explica el peligro que entraña la
sobreproducción de estos radicales.

Como se puede entender, la generación de radicales libres es un hecho natural que

ocurre normalmente en las células, sin embargo, igualmente existen mecanismos de
defensa, conocidos como antioxidantes (superóxido dismutasa, glutation peroxidasa,
glutation reductasa, etc.), que permiten contrarrestar la presencia de estos agentes
dañinos. Sin embargo, bajo ciertas condiciones tales como radiaciones, ingesta de drogas,
infecciones, injurias, etc., un organismo puede responder con una sobreproducción de
estos radicales, por lo que se hace imprescindible potenciar las defensas antioxidantes ya
sea endógenas o a través de la dieta con la ingesta de alimentos con alto potencial
antioxidante ( vitamina C, vitamina E, carotenos, flavonoides, etc.). No obstante, estas
especies reactivas de oxígeno inclusive, cumplen un rol importante en las células
fagocíticas para hacer frente a infecciones bacterianas.

La evaluación de la peroxidación lipídica a través de la determinación de

Malondialdehido, se constituye en una prueba muy útil no sólo para conocer la presencia
de radicales libres, generados por algún agente causal, sino también para poder evaluar
las bondades antioxidantes de muchos productos naturales.

EXPERIMENTO Nº 1
Determinación de Malondialdehido como medida de peroxidación lipídica.

Objetivos:
1. Preparar los sistemas biológicos de estudio, a partir de hígado de rata para la
inducción de peroxidación lipídica.
2. Determinar la concentración de malondialdehido en los sistemas de estudio.
3. Interpretar los resultados y discutir los alcances del uso de esta técnica en trabajos
de investigación.

Fundamento:
El Malondialdehido (MDA) forma un aducto 1:2 con el ácido tiobarbitúrico
produciendo el siguiente compuesto (complejo Acido Tiobarbitúrico–Malondialdehido):

S N OH HO N SH
Figura Nº 10 .- Complejo
Acido Tiobarbiturico-
Malondialdehido N N
CH – CH = CH
OH OH

de color rojo-naranja, el cual puede ser medido por fluorometría o espectrofotometría;

aunque esta reacción tiene mucha más alta sensibilidad cuando se mide por fluorometría,
sin embargo, pueden emplearse cualquiera de los dos. En la presente práctica, por razones
técnicas se la hará por espectrofotometría (colorimetría).
Muchas muestras biológicas, contienen una mixtura de Sustancias Reactivas al Acido
Tiobarbitúrico (TBARS), incluyendo aldehídos e hidroperóxidos lipídicos, los cuales se
incrementan como resultado del stress oxidativo. Estas sustancias retornan a sus niveles
normales con el tiempo, dependiendo de la presencia de antioxidantes. En la práctica, las
TBARS son expresados en términos de malondialdehido (MDA) equivalentes. En el
presente ensayo, se usa un estándar de malondialdehido para construir la curva estándar
respectiva.

Reactivos:
KCl 0.15 M
FeSO4 15 mM
Acido Tiobarbitúrico ( C4H4N2O2S ) 0.67 % en ácido acético al 50 %.
Acido tricloroacético ( Cl3CCOOH ) 5 %.

Procedimiento:
a) Preparación del homogenizado de hígado de rata al 10%.
1. Pesar 2.5 gramos de hígado y mantenerlo siempre sobre hielo.
2. Tamizar el tejido utilizando una malla metálica, presionando el tejido contra la
malla y agregando KCl 0.15 M frío, para lavar la sangre.
1. Recuperar las membranas (tejido parenquimal) que queda sobre la malla
2. Colocar las membranas en un mortero frío (sobre hielo) y triturar con 25 ml de KCl
0.15 M frío, hasta obtener un homogenizado homogéneo. El proceso de triturado no
debe demorar más de 10 minutos.
3. Filtrar el homogenizado con la ayuda de una gaza.
4. Separar y guardar el filtrado a 0 ºC, para hacer los ensayos de peroxidación lipídica.
Se recomienda utilizar el filtrado fresco para cada ensayo.

b) Inducción y determinación de la peroxidación lipídica.

1. Medir 3.0 ml. de homogenizado de hígado al 10 %e iniciar la peroxidación lipídica
añadiendo 100 l de sulfato ferroso (FeSO4) 15 mM. Preparar un sistema sin FeSO4,
que servirá como control.
2. Incubar los sistemas por 1 hora a temperatura ambiente..
3. Transcurrido el tiempo de incubación, tomar 200 l de cada sistema y mezclar por
agitación con 200 l de ácido tricloroacético al 5 %.
4. Centrifugar a 15,000 rpm durante 5 minutos.
5. Tomar 100 l de sobrenadante y mezclar con 1.0 ml de Acido tiobarbitúrico 0.67 %
en ácido acético 50%.
6. Incubar las muestras en baño de agua hirviente, durante 1 hora.
7. Transcurrido este tiempo, retirar los sistemas del baño hirviente y enfriar en hielo por
15 minutos.
8. Realizar las lecturas en un espectrofotómetro a 535 nm.
9. Determinar la cantidad de Malondialdehido (MDA) formado, a partir de la curva de
calibración.
Expresión de Resultados:

Concentración Absorbancia Absorban- Factor de Factor

de MDA (M) (DO) cia neta Calibración Promedio

Estand. 1 10 0.036 0.033 303.03 377.59

Estand. 2 20 0.061 0.058 344.83
Estand. 3 30 0.094 0.091 329.67
Estand. 4 40 0.101 0.098 408.16
Estand. 5 50 0.153 0.15 333.33
Estand. 6 100 0.250 0.247 404.86
Estand. 7 150 0.354 0.351 427.35
Estand. 8 200 0.429 0.426 469.48
Blanco 0 0.003

Sistemas de Concentración de
estudio MDA (Moles / L)

Muestra 1 abs=0.0115 1
Muestra 2 abs=0.0369 4.43
-
Haga Ud. una interpretación e los resultados:
• La muestra 1 contenía el FeSO4 a diferencia de la muestra 2,
 • El FeSO4 provocaba la formación de radicales libres hasta Malondialdehido, este
al reaccionar Acido tiobarbitúrico forma un complejo color naranja.

• Según los resultados obtenidos la muestra 2 contenía más concentración de MDA,

lo que resulta confuso pues a esta muestra no se adiciono FeSO4
• Es muy probable que durante la practica haya ocurrido algun error que altere los
resultados.

INTERROGANTES BIOQUIMICAS:

1. ¿Qué otros daños provocan los radicales libres? Descríbalos.

Los radicales libres causan envejecimiento, alteraciones en el ADN y
enfermedades cardiovasculares, arterioesclerosis, diabetes, aumentan niveles de
colesterol malo y cáncer.
El daño celular producido por las especies reactivas del oxígeno ocurre sobre diferentes
macromoléculas:
Lípidos. Es aquí donde se produce el daño mayor en un proceso que se conoce como
peroxidación lipídica, afecta a las estructuras ricas en ácidos grasos poliinsaturados, ya
que se altera la permeabilidad de la membrana celular y se produce edema y muerte
celular. La peroxidación lipídica o enranciamiento oxidativo representa una forma
de daño hístico que puede ser desencadenado por el oxígeno, el oxígeno singlete, el
peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo.

Proteínas. Hay oxidación de un grupo de aminoácidos como fenilalanina,

tirosina, histidina y metionina; además se forman entrecruzamientos de cadenas
peptídicas, por último, hay formación de grupos carbonilos.

Ácido desoxirribonucleico (ADN). Ocurren fenómenos de mutaciones y carcinogénesis,

hay pérdida de expresión o síntesis de una proteína por daño a un gen específico,
modificaciones oxidativas de las bases, de lecciones, fragmentaciones, interacciones
estables ADN-proteínas, reordenamientos cromosómicos y desmetilación de citosinas
del ADN que activan genes.

2. Describa el proceso de peroxidación lipídica.

Ataca a los carbonos adyacentes (grupos metilenos) a los dobles enlaces de ácidos grasos
y fosfolípidos. Por lo que tiene la capacidad de romper la estructura de las
membranas celulares. Pues hace que dejen de ser moléculas anfóteras. Al final del
proceso, los lípidos se fragmentan en aldehídos e hidroperóxidos tóxicos, aunque
de carácter neutro. El malonil aldehído es el principal biomarcador de la peroxidación
lipídica, porque siempre se produce).
• Iniciación: Participa el radical más potente: el hidroxilo, que le roba un electrón
aun ácido graso, convirtiéndolo en un radical. El cual se estabiliza al
formar un dieno.
• Propagación: Los radicales piróxilos le roban hidrógenos al dieno,
convirtiéndolo en un Endo peróxido.
• Ramificación: Participan el metal proteínas en la reacción de Fenton para alterar
a la molécula estable: hidroxila–peróxido, y convertirla de nuevo, en un
radical.
• Terminación: La peroxidación es ahora, iniciada por los radicales lipídicos
que se han formado. Los cuales, no son tan potentes como los anteriores.

3. ¿Qué otros métodos conoce Ud. para evaluar la producción de radicales libres de
Oxígeno?

MÉTODOS DIRECTOS
Medición de la concentración de agentes oxidantes. Durante los últimos años se ha tratado
de medir la concentración de agentes oxidantes en el organismo, pero ha resultado difícil
en muchos casos, por tener éstos un tiempo de vida media muy corto. El radical hidroxilo
tiene una vida de 10-10. La espectrometría de la resonancia de la rotación (espín)
de electrones es la única técnica analítica que mide directamente las especies
reactivas del oxígeno (EROs), pero su aplicación en el ser humano no es factible aún,
además de ser muy caros los equipos necesarios.

La prueba está basada en el hecho de que los metales de transición, una vez liberados de
su forma quelante, forma en que generalmente se encuentran en el plasma y dentro de las
células, tienen la capacidad de catalizar reacciones del tipo REDOX, cuyos productos son
atrapados por derivados fenólicos, que resultan en la formación de una solución coloreada
que puede ser medida espectrofotométricamente.

ORAC (OXYGEN RADICAL ABSORBANCE CAPACITY O CAPACIDAD

DEABSORCIÓN DE RADICALES DE OXIGENO)

Esta técnica determina la capacidad antioxidante mediante un método

fluorimétrico. En primer lugar, mediante la descomposición térmica de una
zoderivado AAPH (2,2 '-azo-bis (2-amidino-propano) di hidrocloruro) se generará
un radical piróxilo. Este intentara oxidar un sensor/marcador oxidable y fluorescente (una
proteína como la ficoeritrina o un sensor fluorescente como la fluoresceína) y por el
contrario el antioxidante intentara evitar esta oxidación. A medida que el radical oxide el
sensor fluorescente este irá perdiendo poco apoco su fluorescencia (dicha fluorescencia
se registrara con un fluorimetro).

Para calcular la capacidad antioxidante se tendrá en cuenta el rendimiento neto de en

AUC (área bajo la curva) en un periodo de tiempo, es decir, el AUC en presencia de un
antioxidante menos el AUC en ausencia del antioxidante.TRAP (TOTAL RADICAL
TRAPPING POWER O PODER DE CAPTACIÓN DERADICALES TOTALES) A
medida que se incorpore la muestra con antioxidantes se irá controlando el oxígeno
consumido por el mismo. El periodo en el que la oxidación se inhibe por el antioxidante
se compara con una muestra con el Trolox un antioxidante de referencia. Los resultados
se expresan en equivalentes de Trolox (mmol deperoxilo capturado por molécula de
Trolox/L plasma). esta prueba se puede realizar en plasma, suero o sangre. Con este
método podemos obtener resultados de antioxidantes como ascorbato, alfa-
tocoferol, acudo úrico en incluso antioxidantes con grupos tiol. Se considera un método
simple, fiable y permite un manejo rápido de las muestras. Hay que tener en cuenta que
existen posibles errores debido a la acción sinérgica entre algunos antioxidantes como es
el caso de ascórbico y los derivados tiol que pueden hacer que se produzca una pérdida
de capacidad antioxidante que si se midieran por separado.

4. Escriba la reacción del Malondialdehido con el ácido Tiobarbitúrico.

2 malondialdehído + 1 ácido tiobarbitúrico → 1 aducto de tiobarbitúrico + 2 moléculas

de agua

5. ¿Cuáles son los sistemas antioxidantes con que cuenta nuestro organismo y cómo
funcionan?
Enzimas antioxidantes: Incluyen el superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y
el glutatión peroxidasa. Estas enzimas actúan catalizando reacciones que neutralizan los
ROS y los convierten en productos menos dañinos.
Glutatión (GSH): Es un antioxidante presente en nuestras células que ayuda a neutralizar
los radicales libres. El GSH interactúa con las enzimas antioxidantes y las regenera,
permitiéndoles continuar su función antioxidante.
Vitaminas antioxidantes: Las vitaminas C (ácido ascórbico) y E (tocoferol) son
antioxidantes importantes en nuestro organismo. La vitamina C actúa como un captador
de radicales libres y regenera la vitamina E oxidada, mientras que la vitamina E protege
los lípidos de las membranas celulares del daño oxidativo.
Polifenoles: Estos compuestos se encuentran en alimentos como frutas, verduras, té y
cacao. Los polifenoles tienen propiedades antioxidantes y pueden ayudar a reducir el
estrés oxidativo en el cuerpo.

6. ¿Cómo se generan las especies reactivas de oxígeno (ROS) en nuestro organismo?

Respiración celular: Durante la respiración aeróbica, el oxígeno se utiliza en la cadena
respiratoria de las mitocondrias para producir energía en forma de ATP. Sin embargo,
durante este proceso, una pequeña fracción de los electrones escapa de la cadena
respiratoria y reacciona con el oxígeno para formar ROS, especialmente superóxido y
peróxido de hidrógeno.
Reacciones enzimáticas: Algunas enzimas presentes en nuestras células pueden producir
ROS como parte de sus funciones normales. Por ejemplo, ciertas enzimas en el hígado
pueden generar ROS durante la desintoxicación de sustancias extrañas.
Estrés e inflamación: Situaciones de estrés, lesiones o inflamación pueden aumentar la
producción de ROS en nuestro organismo. Las células del sistema inmunológico, como
los neutrófilos y los macrófagos, pueden producir grandes cantidades de ROS para
combatir infecciones.
Radiación y contaminantes: La exposición a la radiación ionizante, como los rayos
ultravioletas o los rayos X, así como la presencia de ciertos contaminantes químicos,
puede desencadenar la producción de ROS en nuestro organismo.

7. ¿A qué se denomina antioxidante, y de que maneras podrían actuar?

Un antioxidante es una sustancia que tiene la capacidad de inhibir o retardar la oxidación

de otras moléculas. Los antioxidantes actúan neutralizando los radicales libres y
protegiendo así a las células y tejidos del daño oxidativo. Esto se debe a que los
antioxidantes tienen la capacidad de donar electrones o hidrógeno a los radicales libres,
estabilizándolos y evitando que causen daño a las estructuras celulares.

Con los datos obtenidos, construya la curva de calibración para el malondialdehido.

(Absorbancia (DO) vs Concentración de Malondialdehido (nmoles/ml).

REFERENCIAS:
1. Campo-Banguero, Laura Marcela; Ramírez-Navas, Juan Sebastián (11 de noviembre de 2021). «Capacidad
antioxidante en helados y derivados lácteos». Revista Colombiana de Investigaciones Agroindustriales 8 (1):
23-41. ISSN 2422-4456. doi:10.23850/24220582.3982. Consultado el 2 de julio de 2023
2. Ela Céspedes Miranda, José Castillo-Herrera (abr-jun 2008). La peroxidación lipídica en el
diagnostico del estrés oxidativo del paciente hipertenso. ¿Realidad o mito?
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-03002008000200003 Revista:
cubana de investigacion Biomedicas. Consultado el 3 de Julio del 2023.
3. Agustin Membrillo Ortega, Alejandro Córdova Izquierdo, Juan Jóse Hicks Gómez. (12 de
diciembre del 2003) PEROXIDACIÓN LIPÍDICA Y ANTIOXIDANTES EN LA
PRESERVACIÓN DE SEMEN. UNA REVISIÓN
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0378-18442003001200006 Revista:
cubana de investigacion Biomedicas. Consultado el 3 de Julio del 2023.
4. Marie Christine Pereira, Ramón iralles, Ester Sera (3 de febrero del 2015) Peroxidación lipídica
en la membrana de los linfocitos y oxidación proteica en el suero de personas ancianas,
¿marcadores potenciales de fragilidad y dependencia? Resultados preliminares
https://www.elsevier.es/es-revista-revista-espanola-geriatria-gerontologia-124-articulo-
peroxidacion-lipidica-membrana-linfocitos-oxidacion-S0211139X15000372 Revista: original
resección biológica Recuperado el: 2 de Julio del 2023