UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD XOCHIMILCO

“Determinación de ácido ascórbico en una muestra comercial utilizando el método

=CUPRAC=”

Evaluación Experimental de Fármacos

Escalona Gutierrez Viridiana.

Espinoza Rojas Braulio Alejandro.

Dr. Martín Gómez Hernández

México U.A.M. 04/08/09.

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN MUESTRA COMERCIAL UTILIZANDO
EL MÉTODO =CUPRAC=

INTRODUCCIÓN

ORAC, TRAP, FRAP, TEAC, CUPRAC, ABTS, DPPH… son siglas que representan a algunos de los tantos
ensayos antioxidantes mas utilizados. Sin embargo, estos en realidad no son alternativos, sino más
bien complementarios. La mayoría evalúan la capacidad inhibidora de la oxidación de sustancias
frente a distintos sustratos o sales o compuestos químicos y en todo caso la variación entre los
mismos esta dada por la reproducibilidad o confiabilidad de los resultados.

En la tabla se mencionan algunos de los métodos y su característica más importante.

Método Característica principal

FRAP Capacidad reductora del ión Fe+3 en plasma
TEAC Capacidad antioxidante equivalente del Trolox
DPPH 2,2’difenil-I-picrílhidracilo
ABTS 2’-azinobis- (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico)
CUPRA Capacidad reductora del Cu+2
C
TRAP Potencial Total antioxidante
FTC Tiocianato férrico
TBA Ácido tiobarbitúrico
ORAC Capacidad de absorción de radicales libres de oxígeno
NORAC Capacidad de absorción de radicales libres de
peroxinitrato
HORAC Capacidad de absorción de radicales libres de hidroxilo
PAOXI Índice antioxidante de fenol
FOX Oxidación ión ferroso en naranja de xilenol (OFC)

Todos los ensayos presentan ventajas y desventajas, pero todos evalúan capacidad antioxidante in
vitro. El ensayo conocido como ORAC es uno de los más populares en la industria pero hay
variantes del mismo. El mas conocido determina la capacidad captadora de radicales piróxilo tanto
en sustancias lipo como hidrosolubles. Sin embargo se han desarrollado dos otras variables, el
NORAC, que permite detectar capacidad captadora de radicales peroxinitrito y HORAC, radicales
hidroxilo.

El método CUPRAC es un sistema capaz de determinar la capacidad antioxidante de los fluidos

biológicos basados en la reacción donde hay transferencia de un solo electrón.
Este método se basa en la reducción de Cu (II) a Cu (I) para el fondo de la cuestión de la reducción
de sustancias de la muestra que es objeto de análisis, la detección de los iones Cu (I) se realiza
mediante la medición de la formación de los complejos dada por el Cu (I) y el quelante
batocuproina (2,9-dimetil-4, 7 -difenil-1 ,10-phenanthroline), este complejo tiene una absorción
del espectro con máximo a 480-490 nm.
La evaluación se realiza comparando los valores de absorbancia (λ = 490 nm), de análisis de la
muestra con la curva de calibración obtenida con una concentración de ácido úrico c onocido,
utilizado como agente reductor. El número resultante se multiplica por un coeficiente conversión
igual al 2189 y se obtiene un resultado expresado en mol / L, de la reducción de potencia de cobre.
El método CUPRAC además de ser muy simple, es rápido, en comparación con otros métodos
analizados, también posee una serie de ventajas:
- Es capaz de medir antioxidantes tiolica en la naturaleza, a diferencia del método FRAP

- Los reactivos son mucho más estables y de fácil acceso en comparación con el ABTS y el
TPTZ
La reacción de la reducción de Cu (II) a Cu (I) se produce a pH 7, a continuación, cerca de
condiciones fisiológicas, al contrario de lo que ocurre en el método FRAP, donde se trabaja en
medio ácido (pH 3,6).

La función que desempeña la vitamina C en el cuerpo es indispensable. Se precisa para que el

cuerpo elabore tejido conjuntivo o colágeno, que se encuentra en todo el organismo y contribuye
al mantenimiento de la estructura de los tejidos, en la piel, músculos, encías, vasos sanguíneos y
huesos. Este ácido puede prevenir el cáncer, promueve la inmunidad frente a los resfriados y otras
infecciones, combate las enfermedades cardiacas, acelera la cicatrización de heridas, ayuda a
rebajar el exceso de colesterol y contribuye a prevenir las ulceras. La ración dietética
recomendada de vitamina C es de 60 mg diarios.

OBJETIVOS GENERALES

 Evaluar la precisión y la reproducibilidad de datos en curvas de calibración.

 Cuantificar ácido ascórbico mediante curva de calibración en una muestra comercial,
utilizando el método CUPRAC.

OBJETIVOS PARTICULARES

 Seleccionar las condiciones instrumentales óptimas para la cuantificación de ácido

ascórbico en una muestra comercial.
 Aplicar los conocimientos teóricos adquiridos para efectuar adecuadamente el análisis de
resultados en una curva de calibración.
 Adquirir la habilidad de precisión y reproducibilidad al obtener y registrar datos
experimentales.

PROCEDIMIENTO
 1. Se prepararon las siguientes disoluciones CuCl2 1.2x10-2 M, Neucuproina 7.49x10-3 M en
etanol, buffer de acetato de amonio pH 7.01 1.2M y solución estándar de Trolox 2x10 -4 M
en etanol.
2. Se construyo por triplicado la curva de calibración siguiente:

DISOLUCIÓ BLANCO 1 2 3 4 5
N
Buffer (mL) 2 2 2 2 2 2
Neocuproin 2 2 2 2 2 2
a
CuCl2 (mL) 2 2 2 2 2 2
Trolox (mL) -- 0.5 1.5 2.0 3.0 4.0
Agua (mL) 4 3.5 2.5 2.0 1.0 0

RESULTADOS

Tabla 1. Datos para el espectro de absorción de Trolox en etanol

en un intervalo de 400 a 500 nm
λ (nm) A
400 0.875
410 1.020
420 1.150
430 1.260
440 1.330
445 1.320
450 1.260
460 1.260
470 1.035
480 0.674
490 0.484
500 0.270
1.4

1.2
λóptima
ABSORBANCIA

0.8

0.6

0.4

0.2
380 400 420 440 460 480 500
λ (nm)
Fig.1 Espectro de absorción de Trolox en medio EtOH, Absorbancia vs. longitud de onda, en una celda de 1 cm.

Tabla 2. Datos de la primera curva de calibración para Trolox en etanol a 440 nm.

SISTEMA A M
Fig.2. Primera curva de calibración para Trolox en medio EtOH, Absorbancia vs.
(mmol/mL) Molaridad, en una celda de 1 cm.
1 0.18 9.95x10-6
0
2 0.51 2.99x10-5 A=0.008093
0 B=16595.272 M-1
r2=0.9995 ABSORBANCIA = 0.008093 +
3 0.65 3.98x10-5
16595.272*M (mmol/mL).
4
4 0.99 5.97x10-5
0
5 1.34 7.96x10-5
0
Tabla 3. Datos de la segunda curva de calibración para Trolox en etanol a 440 nm.

SISTEM A M
A (mmol/mL)
1 0.183 9.95x10-6
2 0.496 2.99x10-5
3 0.676 3.98x10-5
4 1.000 5.97x10-5
5 1.340 7.96x10-5

1.4

1.2
ABSORBANCIA

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 0.00001 0.00002 0.00003 0.00004 0.00005 0.00006 0.00007 0.00008
M (mmol/mL)

Fig.3. Segunda curva de calibración para Trolox en medio EtOH, Absorbancia vs. Molaridad, en una celda de 1 cm.

A= 0.0098037
B= 16652.12 M-1
r2= 0.9996 ABSORBANCIA = 0.0098037 + 16652.12*M (mmol/mL).

Tabla 4. Datos de la tercera curva de calibración para Trolox en etanol a 440 nm.

SISTEM A M
A (mmol/mL)
Fig. 4. Tercera curva de calibración para Trolox en medio EtOH, Absorbancia vs.
1 0.181 9.95x10-6 Molaridad, en una celda de 1 cm.
2 0.503 2.99x10-5
3 0.665 3.98x10-5 A= 0.0019348
4 0.995 5.97x10-5 B= 16717.633 M -1
r2= 0.9998 ABSORBANCIA
5 1.399 7.96x10-5
= 0.0019348 + 16717.633*M (mmol/mL)

Muestra problema

Ácido ascórbico
MUESTRA ABSORBANCIA CONCENTRACIÓN
1 1.340 8.03x10-5 M
2 1.345 8.06x10-5 M
 3 1.339 8.02x10-5 M

Promedio = 8.04x10 -5 M

Factor de dilución

4.02x10 -3 M

ANÁLISIS DE RESULTADOS

En la Fig. 1 se trazo el espectro de absorsión para Trolox comparando la absorbancia de la

muestra a diferentes longitudes de onda para asi determinar la longitud de onda óptima y con ella
realizar la curva de calibración.

En las figuras 2, 3 y 4 se contruyeron curvas de calibración y se analizó la correlación de las mismas

con el sotfware JMP versión 8, dando resultados de variabilidad cercanos al 0.9999 aceptables
para dichos modelos. Se evaluó la reproducibilidad de los resultados aplicando una prueba
estadistica t student obteniendose una probabilidad P=0.3254, valor que indica que la variabilidad
en los datos no son significativos y se pueden considerar la homogeneidad de los mismos.

La absorbancia de la muestra problema se realizo por triplicado, se obtuvo la concentración de las

muestras y se calculo el promedio, a este resultado se le multiplico por el factor de dilusión de 50
empleado, para conocer la concentración dierecta de la muestra comercial.

CONCLUSIONES

La longitud de onda óptima para realizar la curva de calibración con el estándar Trolox es a
440 nm.
Se logro construir un modelo de curva de calibración de precisión y reproducibilidad óptimas para
un análisis cuantitativo de ácido ascórbico.
La concentración de ácido ascórbico en la FF cápsula fue de 4.02x10 -3 M.

BIBLIOGRAFÍA

 Ramette R., Equilibrio y Análisis Químico. Editorial Fondo educativo Interamericano., Pag.
72-74.
 Willard H., Métodos Instrumentales de Análisis. Editorial Grupo Editorial Iberoamérica.,
Pag. 115, 116, 167.
 Skoog/West, Química Analítica. Editorial McGraw Hill., Pag. 451-453.