Villarroel_Quintana_Alejandra _Camila_TécnicasGeneralesdeLaboratorio_Tema14_actividad1

DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh por PCR

Fig.1 Reacción en cadena de la polimerasa.

Objetivo: Realizar la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) para el estudio de la determinación del Rh.

Fundamento:
La PCR es un proceso simple, exacto y altamente reproducible que proporciona la ventaja de empezar con una pequeña cantidad de ADN y ser capaz de
amplificarlo de forma que se tenga suficiente para realizar experimentos o diagnosticar fundamentalmente.
En una reacción de PCR, el primer paso es la preparación de la muestra de ADN que es extraída de varias fuentes biológicas o tejidos. Posteriormente,
se juntan los reactivos, donde encontramos los Primers/Cebadores, quienes nos indicarán el punto donde se va amplificar, la Taq Polimerasa será la
enzima que va a replicar el ADN a partir de los cebadores, el Buffer que amortigua los niveles de pH, dNTPs son los nucleótidos que se van a incorporar
a la cadena, el ADN molde, H2O y Mg2+ .
Una vez colocado el en tubo de PCR, se realiza la reacción dentro del termociclador el cual regula la temperatura, donde nuestras muestras pasarán por
varios ciclos.
Primero se da la desnaturalización HOT START a 95ºC donde se activa la polimerasa unos 10 minutos, este paso se repite solo al inicio, en segundo lugar
se da la desnaturalización a 95ºC unos 30 segundos donde la hebra de ADN se separa, luego se da el apareamiento a 64ºC unos 30 segundos y es donde
el cebador se une al ADN molde, por último, la elongación a 72ºC por unos 45 segundos donde se posiciona la Taq Polimerasa y comienza a colocar
dNTPs a partir del cebador, formando una nueva hebra amplificada, y así se repite en varios ciclos hasta obtener nuestro ADN de interés. Para finalizar
se da la elongación final a 72ºC por 10 minutos y el final donde se produce la renaturalización a 4ºC.
Al finalizar el tiempo en el termociclador, se pasará a la electroforesis en gel de agarosa al 1%, para su posterior visualización en el transiluminador.
La base de esta práctica es la amplificación de un fragmento del gen D con la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
Se demostró que los anticuerpos producidos contra las células rojas de la sangre en los monos Rhesus, se dirigían a una molécula que se denominó
antígeno Rhesus (Rh), los individuos que poseían esta molécula fueron denominados Rh positivo y el 15 % restante Rh negativo.
La presencia o ausencia del gen D en el genoma determina la base genética del polimorfismo de los grupos sanguíneos Rh-positivo/Rh-negativo.
Por tanto, los individuos son clasificados como Rh+ si contienen el antígeno D en la membrana de sus eritrocitos, (la amplificación de este fragmento
gen D indicará que la persona es Rh+, al no haber está amplificación determinará que la persona es Rh-).
El locus Rh consiste en 2 genes estructurales: D y CcEe, los cuales codifican para la cadena del polipéptido D y las proteínas C/c y E/e respectivamente.

“El antígeno D es altamente inmunogénico e induce una respuesta inmune en

muchas personas Rh- cuando reciben una transfusión con sangre Rh+”.

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Material:
-Tubos de PCR
-Micropipeta y puntas
-Bata
-Guantes
-Papel de filtro

Equipos:
-Termociclador
-Electroforesis
-Transiluminador

Productos:
- Encontramos los siguientes reactivos en el Kit BioTed.
- Mix PCR:
→ Primers / Cebadores (Nos indican que punto se va a amplificar)
→ Buffer (Amortigua los niveles de pH)
→ Taq Polimerasa (Enzima que replica el ADN a partir de los cebadores)
→ dNTPs (Nucleótidos se van incorporando en la cadena)
→ ADN molde
→ H2O
→ Mg2+
- Control positivo Rh+

Método:
→ Preparación de tres tubos para realizar la PCR.
1º Tubo muestra: Se agrega 22,5µl del Mix y 2,5µl de ADN.
2º Tubo preparación del control positivo: Se agrega 22,5µl del Mix y 2,5µl de ADN positivo.
3º Tubo preparación del control negativo: Se agrega 22,5µl del Mix y 2,5µl Buffer de Hidratación o agua.

Fig.2 Tubos PCR.

→ Cada tubo contiene 25µl, tenemos tres muestras, control positivo y negativo las cuales se colocan en el termociclador para dar inicio a la
reacción.

Fig.3 Tubos en el termociclador. Fig.4 Iniciando Termociclador. Fig.5 Termociclador preparado.

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→ Para entender la reacción debemos comprender los siguientes pasos:

PCR
Pasos Temperatura Tiempo

Desnaturalización HOT START, activación de la 95ºC 10 minutos

polimerasa.

Desnaturalización 95ºC 30 segundos

Ciclos de PCR Apareamiento del 64ºC 30 segundos

cebador al ADN molde.

Elongación 72ºC 45 segundos

Elongación final 72ºC 10 minutos

Final Renaturalización 4ºC

Fig.6 Termociclador en el ciclo de activación de la polimerasa.

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Resultados/Conclusiones:
Al finalizar la reacción de los ciclos en el termociclador, procederemos a observar el producto de la reacción amplificada.
Para observar la PCR utilizaremos la electroforesis en gel de agarosa al 1% a 60V durante 30 minutos.

Fig.7 Electroforesis con los pocillos cargados.

Pasado este tiempo, pasaremos el gel al transiluminador donde observaremos las bandas y determinaremos el resultado.

Tenemos en cuenta la siguiente información:

Los individuos Rh+ producirán 2 fragmentos correspondientes al gen CcEe y D de diferentes tamaños (1200pb y 600 pb).
Los individuos Rh- una única banda correspondiente al fragmento del gen CcEe (1200 pb).

Fig.8 Bandas observadas en el Transiluminador.

Observamos que nuestra PCR ha dado como resultado Rh+ debido a que se han amplificado los dos fragmentos uno de ellos el CcEe con 1200pb y el
fragmento D con 600pb. También podemos decir que nuestra PCR es viable sin contaminación al amplificarse los fragmentos del control positivo y no
del control negativo.