PRACTICA Nº 1

FERMENTACION ALCOHOLICA DE LA GLUCOSA

RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Formación de Acetaldehído y Etanol a partir de glucosa en presencia de
Saccharomyces cerevisiae.
a) Identificación de acetaldehído
b) Cuantificación de etanol
2. Cuantificación del contenido alcohólico en diversas bebidas

INTRODUCCION.

Las fermentaciones son procesos anaeróbicos que liberan energía para la formación
de ATP en un proceso conocido como “fosforilación a nivel de sustrato”. La energía
producida en los procesos de fermentación y que las células aprovechan para las
reacciones endergónicas, se acumula en forma de ATP; parte de la cual se emplea en la
fosforilación de las hexosas.

La fermentación alcohólica es un proceso bioquímico que por acción de las

levaduras, 1 mol glucosa es convertida anaeróbicamente en 2 moles de etanol. Las
células de levadura son esenciales para producir las enzimas necesarias que participar en
el proceso fermentativo, pero una vez que éstas estén presentes ya no serán tan
indispensables para que la fermentación se produzca en forma normal.

En levaduras, la glucosa anaeróbicamente es convertida en etanol y dióxido de

carbono, y las etapas enzimáticas son idénticas a las de la fermentación láctica o
glicólisis, a excepción de la etapa terminal catalizada por la Deshidrogenasa láctica, la
cual es reemplazada por dos etapas enzimáticas adicionales, donde intervienen la
Piruvato Descarboxilasa y la Alcohol Deshidrogenasa.

La reacción de descarboxilación del Piruvato, en acetaldehído y dióxido de carbono,

es catalizada por la Piruvato Descarboxilasa, enzima que requiere de Pirofosfato de
Tiamina (PPT) como coenzima, además de iones Mg 2+. Como producto intermediario se
forma “ácido pirúvico activo” que por liberación del CO2 se convierte en “acetaldehído
activo” (PPT–Acetaldehido), intermediario que luego se descompone en PPT
acetaldehído, éste último se reducirá a etanol en la reacción siguiente; no obstante, una
parte del acetaldehído activo se condensa a acetaldehído libre para formar acetil-metil-
carbinol. (Acetoína).

GLUCOSA

ATP
HEXOQUINASA
ADP

Glucosa – 6 P

FOSFOGLUCO
ISOMERASA

Fructosa – 6 P

FOSFOFRUCTO ATP
QUINASA ADP

Fructosa 1, 6 Bis P
ALDOLASA

TRIOSA FOSFATO
ISOMERASA
Dihidroxiacetona fosfato Gliceraldehido 3-fosfato (2)

Pi NAD+
GLICERALDEHIDO 3 P
DESHIDROGENASA NADH2

Acido 1,3 difosfoglicérico (2)

(2) ETANOL
FOSFOGLICERO
ADP
KINASA ATP

ALCOHOL NAD +

DESHIDROGENASA Acido 3-fosfoglicérico (2)

NADH2
FOSFOGLICERO
MUTASA
(2) Acetaldehido
Acido 2-fosfoglicérico (2)
CO2
PIRUVATO
DESCARBOXILASA PPT ENOLASA H2O
ATP ADP

Ac. Pirúvico Ac. Fosfoenol pirúvico (2)

PIRUVATO
(2) KINASA

FIGURA Nº 3 .- Fermentación alcohólica de la glucosa

 La conversión de acetaldehído en etanol es llevada a cabo por la alcohol
deshidrogenasa, la cual es una enzima que requiere de NADH + H + y que cataliza la
reacción de izquierda a derecha cuando esta se lleva a cabo en un medio ligeramente
ácido ( pH de 5 a 6 ), por el contrario en medio ligeramente alcalino (pH 8) esta se
realiza de derecha a izquierda.

Como inductores de la fermentación alcohólica, no sólo actúan las levaduras de

Saccharomyces cerevisiae, sino también las bacterias: pseudomonas, xantomonas y
aeromonas.

En la fermentación alcohólica, además del etanol y dióxido de carbono se originan

productos secundarios como glicerina, ácido acético y ácido succínico.

EXPERIMENTO 1.

FERMENTACION DE LA GLUCOSA POR Saccharomyces cerevisiae HASTA

ACETALDEHIDO Y ETANOL
En 2 matraces ( M-1 y M-2 ) de 50 ml., agregar lo siguiente:

M-1 M–2

1.- Levadura de panificación fresca 1.0 g 1.0 g

2.- Solución de glucosa al 5 %, recién preparada y a pH 5.5 10.0 ml ------

3.- Solución de glucosa al 5 %, recién preparada y a pH 8.0 ------ 10.0 ml

4.- Mezclar bien y agregar el reactivo sulfito de calcio ------ 500 mg

5.- Mezclar y agregar rápidamente parafina líquida hasta que 5.0 ml 5.0 ml
cubra la superficie.
Incubar en baño de agua a 37 ºC durante 60 minutos

6.- Centrifugar a 3,000 rpm. 10 min. 10 min.

Obtener los sobrenadantes por separado para las determinaciones del acetaldehído y
etanol
Identificación del acetaldehído.
Fundamento:
En el sobrenadante de la muestra de incubación el sulfito de calcio atrapa al
acetaldehído, el cual puede observarse por el cambio de color que se produce al
reaccionar con el nitroprusiato de sodio y la piperidina.
Procedimiento.

En 3 tubos de ensayo ( T) debidamente rotulados, agregar lo siguiente:

T-1 T –2 T–3
1. Sobrenadante de M – 1 1.0 ml --- ---
2. Sobrenadante de M – 2 --- 1.0 ml ---
3. Agua destilada --- --- 1.0 ml
4. Solución de Nitroprusiato de Sodio 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Mezclar y colocar los tubos en baño de agua hirviente por 5 minutos.
5.Observar. Anotar el color y olor Se Se Se
característico observa observa observa
del acetaldehído un color un un color
naranja. cambio naranja.
de color
rojizo.

CUANTIFICACION DEL ETANOL (Método de Shefftel modificado).

Fundamento.

La mezcla oxidante Dicromato-ácido sulfúrico actúa sobre el alcohol etílico

transformándolo en ácido acético, a la vez que se forma sulfato cromoso con una
coloración que varía del amarillo al verde, en forma proporcional a la concentración de
etanol existente en la muestra, susceptible a ser medido por fotocolorimetría.

Reactivos:
a) Dicromato de potasio. 8.524 g.
Agua destilada 1000 ml.
 b) Acido sulfúrico Q.P. 1000 ml
c) Mezcla sulfocrómica: Verter lentamente el ácido sulfúrico a la solución de
bicromato (Reacción exotérmica).

Procedimiento:

1. Colocar 0.5 ml de la mezcla sulfocrómica en un frasco de 30 ml.

aproximadamente.
2. Colocar exactamente 0.2 ml. de la muestra a analizar en una tira doblada de
papel filtro adherida a un tapón de jebe con un alfiler.
3. Finalmente colocar herméticamente en el frasco que contiene la solución
sulfocrómica, cuidando que la tira de papel filtro no toque las paredes del
frasco ni el reactivo.
4. Colocar las tapas rosca y llevarlos a Baño María hirviente o a estufa a 100 ºC
por 10 minutos.
5. Retirar el tapón con la tira de papel que contiene a la muestra. Enfriar y
agregar 12.5 ml de agua destilada.
6. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 578 nm.
7. Preparar sistemas estándar del mismo modo que para las muestras problema,
sólo que en su lugar medir 0.2 ml del estándar respectivo ( 0.5 mg/ml, 1.0
mg/ml y 2 mg/ml ) en la tira de papel filtro. º
8. De igual modo preparar un blanco, procediendo exactamente de la misma
manera que para la muestra problema, sólo que en lugar de esta última medir
0.2 ml de agua destilada en la tira de papel filtro.
El tubo 1 es de color verde por el exceso de alcohol.
El tubo 2 es de color amarillo por el acetaldehido y evita que se transforme en etanol.

RESULTADOS.

Calcular los Factores de calibración respectivos en base a los datos indicados:

Absorbancia Factor de Fc
Calibración Promedi
Absorbancia neta o
.
( D.O )
Blanco 0.001 ------ ------ -----
Estandar 1 ( 0.5 0.005 0,004 125 122,5
mg/ml )
Estándar 2 ( 1.0 0.009 0,008 125
mg/ml )
Estándar 3 ( 2.0 0.018 0,017 117,7
mg/ml )

Anotar los resultados obtenidos del experimento 1 (fermentación alcohólica de la

glucosa), en el siguiente Cuadro:

T–1 T–2 T–3

Identificación de acetaldehído
Coloración obtenida
Cantidad de etanol (mg % )
INTERROGANTES Y COMENTARIOS.
1.- Comente o explique los resultados obtenidos en la identificación del acetaldehído.

El acetaldehído se encuentra en el sobrenadante, este va a ser atrapado por el sulfatode

calcio, tomando una coloración azul. Esta reaccion del cambio de color es por
lareaccion del nitroprusiato de sodio con la piperina.

2.- Comente o explique los resultados obtenidos en la cuantificación de etanol

El etanol fue en base al peso de los frascos. Cuando se realizó la fermentación
huboproducción de etanol y este al ser menos denso que el agua el peso va a disminuir
yeso nos indica la producción de etanol.En la práctica se propone usar solución
sulfocromica diluida para cuantificar lacantidad etanol presente, dando como
positivo el etanol, cuando esta toma unacoloración verde.

3.- Esquematice la secuencia de reacciones de la fermentación alcohólica de la fructosa

4.- Escriba las coenzimas y/o cofactores que necesita la piruvato descarboxilasa y la
alcohol deshidrogenasa.
La piruvato descarboxilasa necesita como cofactores a la tiamina pirofosfato (TPP) y
al Mg2+. Y la alcohol deshidrogenasa necesita como cofactor a un NADH+ H+.

5.- Indique para qué se utilizan los siguientes compuestos o sustancias, en la presente
práctica:
● Sulfito de calcio: Se utiliza para atrapar al acetaldehído producido, evitando que
reaccione con otras sustancias.
 ● Solución sulfocrómica diluida: Es para determinar la cantidad de etanol
presente. Da positivo, en presencia de alcohol, cuanto toma una coloración verde
y negativo cuando es naranja.

6.- Mencione las diferencias entre la fermentación láctica y la fermentación alcohólica.

En la fermentación láctica, las células degradan anaeróbicamente a la glucosa,
obteniendo dos moléculas de ácido láctico, 2 ATP y 2 moléculas de agua. Se realiza en
bacterias y en células eucariotas, como las células musculares y los eritrocitos.
La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras y
algunas clases de bacterias. Estos microorganismos transforman el azúcar en 2
moléculas de etanol , 2 moléculas de dióxido de carbono y 2 ATP. La fermentación
alcohólica, comienza después de que la glucosa entra en la celda. La glucosa se degrada
en un ácido pirúvico. Este ácido pirúvico se convierte luego en CO2 y etanol.

7.- ¿Qué otros compuestos se pueden formar durante la fermentación alcohólica?

Al descarboxilarse el piruvato obtenemos acetaldehído. También se obtiene NAD+,
por acción del alcohol deshidrogenasa, para utilizarlo en otras reacciones.