________________________________________________________________________________

PRACTICA Nº 8. PRODUCCIÓN DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACIÓN .

Jonathan Janna Merlano, Sebastian Ospina Hernandez.

Universidad de Córdoba.
Departamento de Ingeniería Ambiental.
________________________________ LB02-bioquimica.________________________________

PROCEDIMIENTO.

1. Marcamos dos tubos de ensayo, uno A y otro B, se agregan 2,5ml de sln de glucosa a cada
uno.
2. En el tubo A, agregamos 2,5ml de levadura en sln, de potasio monobásico (0,5M) y en el
tubo B, 2,5ml de levadura sln, potasio monobásico (0,5M).
3. Se llevan ambos tubos a 37°c en baño de maría durante una hora.
4. Se agrega a cada tubo 2ml de ácido tricloroacético y agitamos fuertemente.
5. Se ingresan ambos tubos a la centrifuga por 10 min a 2500 rpm.
6. Se transfieren 0,5ml del sobrenadado de cada tubo a otros tubos A y B, y se le agrega 2,4
dinitrofenilhídracina en HCL 2M a cada tubo. Luego agitamos fuertemente.
7. Tomamos 0,5ml de cada tubo y agregamos1ml hidróxido de sodio al 10% revelando una
tonalidad rojo ladrillo en ambos, con mayor intensidad en el tubo A.
ANALISIS DE RESULTADOS.

Tubo Sln, Glucosa Levadura en: Resultado Observación

A Si Fosfato de sodio Coloración Roja

dibásico + (mayor a la del
tubo B)
B Si Fosfato de Coloración Roja
potasio + (menor a la del
monobásico tubo A)

debido a que el fosfato de sodio bibásico es más alcalino por sus dos sodios (en comparación con el
fosfato de potasio monobásico), este genera que la enzima piruvato descarboxilasa sea inhibida en
mayor proporción que con el fosfato de potasio monobásico, por lo tanto, se presentó una mayor
acumulación de piruvato cuya presencia se demostró haciendo uso de la 2,4-dinitrofenilhidrazinasa.

Como el fosfato del tubo B genero un menor bloqueo de la enzima piruvato descarboxilasa se dio
una menor concentración de piruvato y seguido a esto una menor coloración roja con la 2,4-
dinitrofenilhidrazinasa.

Fosfato de sodio bibásico Fosfato de potasio monobásico

CUESTIONARIO.

1. ¿Cuál es la función del ácido tricloroacético?

ES anchamente usado en bioquímica para la precipitación de macromoléculas tal como

proteínas, ADN y ARN. Por tanto, está presente como precipitante en la formación del piruvato.

2. ¿Qué conclusiones se podrían sacar de los resultados de las muestras A y B?

  Vemos como la acción de la piruvato descarboxilasa se ve afectada por los niveles básicos
de Ph.
 Por medio de los procedimientos realizados a los tubos A y B se pudo obtener piruvato en
baja cantidad al observa una coloración roja.
 Utilizando los reactivos adecuados y una cantidad de levadura apropiada se puede llegar a
una perfecta obtención de piruvato.
 La mayor coloración roja en el tubo A se debe a que el fosfato de sodio bibásico es más
alcalino que el fosfato de potasio monobásico.

3. ¿Cuál es la reacción de la 2,4-dinitrofenilhidracina con el piruvato?

Los metabolitos de piruvato y acetaldehído se encuentran presentes normalmente en muy bajas

concentraciones, por tanto, para demostrar su existencia como intermediario en el camino
metabólico, es necesario impedir que sean transformados en otros compuestos. Este proceso se usa
mucho cuando se investigan caminos metabólicos y se hace bloqueando la enzima que catalizas la
conversión del compuesto, que se está investigando mediante inhibidores. La pirúvico-
descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se
acumula y su presencia puede demostrarse por la reacción con nitroprusiato de sodio o 2,4
dinitrofenilhidrocina.

Los cristales de las distintas hidrazonas tienen puntos de fusión y ebullición característicos. Gracias
a ello la 2,3-DNFH puede usarse para distinguir entre diversos compuestos con grupos carbonilos.
Este método es particularmente importante porque las determinaciones de punto de fusión requieren
tan sólo instrumental de bajo costo. Esta aplicación en química analítica fue desarrollada por Brady
y Elsmie. Además, no reacciona con otros grupos funcionales que contengan carbonilos, como los
ácidos carboxílicos, amidas y ésteres.

4. ,Qué función cumple el NAD+ en la producción del piruvato?

La enzima Glicerol-3-fosfato deshidrogenase (NAD+) cataliza la reacción de oxidación del glicerol-

3-fosfato a dihidroxiacetona fosfato utilizando NAD+ como aceptor de electrones.
Glicerol -3 fosfato + NAD dihidroxiacetona fosfato + NADH

Esta enzima también cataliza las reacciones de oxidación y reducción del propano-1,2-diol y del
sulfato de glicerina respectivamente, pero con mucha menos afinidad.

Durante la glicólisis se genera NADH en el citosol en la oxidación del gliceraldehído-3-fosfato y se

debe regenerar más NAD+ para que la glicólisis continúe. El NADH no puede pasar a la
mitocondria para ser oxidado por la cadena respiratoria ya que la membrana interior mitocondrial es
impermeable al NADH y NAD+. La solución es que los electrones del NADH, en vez del propio
NADH, sean transportados a través de esta membrana.

Una de las maneras de introducir electrones del NADH en la cadena respiratoria es la lanzadera del
glicerol-3-fosfato. El primer paso es transferir un par de electrones desde el NADH a la
dihidroxiacetona fosfato, un intermedio glicolítico, para formar glicerol-3-fosfato. Esta reacción es
catalizada por la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa en el citosol. El glicerol-3-fosfato es reoxidizado
a dihidroxiacetona fosfato en la superficie exterior de la membrana interior mitocondrial por una
isoenzima de la glicerol-3- fosfatodehidrogenasa unida a la membrana. Un par de electrones se
transfiere desde el glicerol-3-fosfato al grupo prostético FAD de la enzima para producir FADH2.
Esta reacción regenera la dihidroxiacetona fosfato.

5. Consulte la vía de la glucólisis y determine los pasos Irreversibles de esta vía

Paso # Reacción Reversible?

Fase 1
1 hexoquinasa no
2 glucosa-6-P isomerasa si
3 fosfofructoquinasa no
4 aldolasa si
5 triosa fosfato isomerasa si
Fase 2
6 gliceraldehído-3-fosfato si
deshidrogenasa
7 fosfoglicerato quinasa si
8 fosfoglicerato mutasa si
9 enolasa si
10 piruvato quinasa si