Universidad Católica Santiago de Guayaquil

Bioquímica P
Docente: Dr. José Luis Jouvín Martillo
Carrera de Medicina – Semestre B-2020

Fecha: lunes, 11 de enero de 2021.

La CINÉTICA ENZIMÁTICA es un área de la bioquímica que determina la velocidad de las
reacciones enzimáticas, que son catalizadas por enzimas y los factores que la afectan.
PRINCIPALES FACTORES QUE PUEDEN ALTERAR AFINIDAD ENZIMA-SUSTRATO.
• Temperatura
• pH
• Concentración de enzimas y sustratos
• Tiempo de incubación
La REACCIÓN GENÉRICA de una actividad enzimática:

E + S → ES → E + P

E = enzima S = sustrato ES = complejo enzima-sustrato P = producto

La enzima se une al sustrato y esta es una UNIÓN ALTAMENTE ESPECÍFICA forma el COMPLEJO
ENZIMA-SUSTRATO llevándose a cabo la acción catalítica o enzimática y la enzima libera un
PRODUCTO, aquí la reacción es IRREVERSIBLE. La enzima no cambia, no se consume y no
participa de manera directa en la reacción química. La función de la ENZIMA a es ACELERAR LA
VELOCIDAD DE LA REACCIÓN QUÍMICA, las enzimas desde del punto de vista químico son
proteínas biocatalizadoras.

Si no existiera la enzima ¿La reacción se llevaría a cabo? Si, de todos modos, se lleva a cabo.

La LÍNEA AZUL representa la energía que se

necesita para la reacción química, pero cuando
esta la ENZIMA presente la ENERGÍA DE
ACTIVACIÓN disminuye (la enzima hace más
afines a los reactantes) el tiempo que se necesita
para la reacción también disminuye, acelerando la
velocidad.

enzima = + velocidad = - energía de activación

 Podemos medir la actividad enzimática de dos maneras:
• Calcular de manera DIRECTA O INDIRECTA la CANTIDAD DE PRODUCTO que se genera,
si se genera más la actividad, significa que hay mayor afinidad entre la enzima y sustrato.
• Calcular la CANTIDAD DE SUSTRATO que se está HIDROLIZANDO O CATALIZANDO, entre
más sustrato disminuya, habrá una mayor reacción.

KOSHLAND Y FISHER
Este grafico explica la afinidad que
existe entre la enzima y sustrato,
existen dos modelos: KOSHLAND y
FISHER.
La PROTEÍNA tiene un SITIO
ACTIVO/centro activo/centro
catalítico que es lugar donde el
sustrato se va acoplar y este
acoplamiento es específico. Las
enzimas catalizan reacciones
específicas, ejemplo: ANHIDRASA
CARBÓNICA que cataliza la
hidratación del CO2.
MODELO LLAVE Y CERRADURA (FISHER): El modelo llave (sustrato) y cerradura (enzima)
MODELO DE AJUSTE INDUCIDO (KOSHLAND): modelo de ajuste inducido/mano guante y aquí
parecería que la enzima no tiene esa especificidad, pero cuando el sustrato entra en contacto con la
enzima y se acopla al sustrato, esto se da porque ya existía una estructura específica.

El SITIO CATALÍTICO de la enzima puede verse ALTERADO por AGENTES

DESNATURALIZANTES (calor o pH) que alteran la estructura de la proteína provocando que la llave
entre con dificultad en la cerradura (pierda afinidad), esta DISPOSICIÓN TRIDIMENSIONAL es parte
de la ESTRUCTURA TERCIARIA unida por enlaces hidrófobos, puentes de hidrógenos o interacción
iónica. Si el calor o pH es excesivo puede alterar tanto el SITIO ACTIVO, QUE SE INACTIVA (la
afinidad enzima-sustrato es nula).
La utilización de INHIBIDORES ENZIMÁTICOS similares a los sustratos, que ocupan el sitio activo
impidiendo que se una el sustrato.
Clasificación de las enzimas
Todas se pueden clasificar en 6 grupos:
1. Oxidorreductasas: Son enzimas que paricipan en la oxido reducción de la reacción química
(ganancia y pérdida de electrones), la reacción genérica nos indica que el compuesto A esta
reducido y el compuesto B esta oxidado, la enzima cataliza la transferencia de los circulos blancos
donde el compuesto B gana los electrones y se esta REDUCIENDO y el A que pierde los electrones
se esta OXIDANDO.
Ganancia de electrones = REDUCCIÓN (agente oxidante)
Pérdida de electrones = OXIDACIÓN (agente reductor)

2. Transferrasas: Catalizan el paso de productos químicos (no solo electrones), donde el compuesto
A posee un compuesto B (grupo aldehído, grupo cetona, etc) y cataliza la transferencia donde
luego el compuesto C posee el compuesto B.

3. Hidrolasas: Catalizan las reacciones químicas mediante la adicion de H2O que rompe el enlace
químico, la molécula de agua también se divide, donde el hidrógeno queda con una parte de la
molécula inicial y el grupo oxidrilo queda con la otra parte. Pero no solo las proteínas sufren
partición de sus enlaces al añadir agua.

4. Liasas (sintasas): Catalizan la condensación de dos partícula SIN consumo ATP, el compuesto
A y B se condensan formando el compuesto A-B, muy parecidas a las ligasas

5. Isomerasas: Catalizan las reacciones de isomerización, pues los ISÓMEROS son compuestos
químicos que tiene los mismos componentes pero con distinta posición tridimensional, puede que
sea el cambio de un grupo -OH y este cambio es catalizado por las isomerasas. Las ISOENZIMAS
son enzimas que catalizan la misma reacción química pero estas si son estructuralmente
diferentes. Enzima con izoenzimas = LDH
6. Ligasas (sintetasas): Catalizan la condensación de dos partículas CON consumo de ATP que
tiene tres fósforos (sin embargo no siempre se usa ATP) que al participar en el proceso se convierte
en ADP (libero un fósforo inórganico).

CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS

Tipo Reacción Enzimas

Oxidorreductasas Ared + Box → Aox + Bred Peroxidasas y deshidrogenasas

Hexoquinasas (fésforo se
transfiere) y transaminasas
Transferrasas A-B + C → A + B-C (grupo amino se transfiere)

Hidrolasas A-B + H2O → A-H + B-OH Fosaftasa alcalina y tripsina

Liasas (sintasas) X-A-B-Y → A = B + XY Fumarasa y deshidratasa

Triosa fosfata isomerasa y
Isomerasas A isoA fosfoglucomotasa
Piruvato carboxilasas y ADN
Ligasas (sintetasas) A + B + ATP → A-B + ADP + Pi ligasas

HIDRÓLISIS DE UREA
La enzima que cataliza la urea es la UREASA (enzima hidrolítica) donde los productos finales de la
urea son AMONIACO y ANHÍDRIDO CARBÓNICO (CO2). Podemos calcular de manera directa o
indirecta los productos que se forman. Las enzimas las identificamos con el sustrato = compuesto
químico sobre cual actúa y con la terminación -asa.
El gráfico representa como la energía de
activación alcanza un valor específico alto
cuando no hay enzima pero esa misma energía
de activación disminuye cuando hay enzima
La UNIDAD DE MEDIDA DE LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA:
SIM: KATAL (mol/segundo)
LC: Unidades Internacionales (umol/min)
KATAL: Cantidad de moles de sustrato que se
hidrolizan en un segundo.

Medimos la actividad enzimática en enzimología

clínica que lo realizan los LABORATORIOS
CLÍNICOS (en la práctica médica – enzimología clínica) que en este caso la magnitud de medida que
se utilizan las UNIDADES INTERNACIONALES que se define como la cantidad de micromolas
(umol/min) de sustrato que se hidrolizan en un minuto.
- Potencial de hidrógeno (pH)
- Temperatura
- Concentración de enzima
- Concentración de sustrato
- Tiempo de incubación

1. Temperatura y pH = agentes desnaturalizantes

2. Concentración de enzima, concentración de sustrato y tiempo de incubación

MARCHA EXPERIMENTAL
El SUSTRATO ES LA UREA y poco a poco vamos agregando mayores cantidades de urea y se
modifica la concentración de la ENZIMA UREASA. Se modifica la CONCENTRACIÓN DE ENZIMA
(UREASA), PH, TEMPERATURA Y TIEMPO DE INBUCACIÓN.

Toda reacción tiene una temperatura (50°C) y pH (7,2) óptimo, INACTIVAMOS a la enzima ureasa
con un INHIBIDOR ENZIMÁTICO Cl2Hg (BICLORO DE MERCURIO), incubamos alrededor de 35
min. Los productos finales de la reacción química catalizada por la urea son ANHÍDRIDO
CARBÓNICO y AMONIACO, sin embargo cuando calculamos la VELOCIDAD ENZIMÁTICA
esperamos que las reacciones espontáneas se produzcan (hidratación del CO2 y formación del
carbonato de amonio). En los experimentos se dan reacciones quimicas:
- Hidrólisis de la urea (sin enzima) = Urea + H2O → CO2 + 2 NH3
- Hidratación del CO2 (reacción espontánea) = CO2 + H2O → H2CO3
- Formación del carbonato de amonio (reacción espontánea) = H2CO3 + 2 NH3 → Carbonato de
amonio
- Titulación (HCl) del carbonato de amonio (titulación indirecta) = Carbonato de amonio + HCl →
2 NH4Cl + H2CO3
La HIDRÓLISIS DE LA UREA no necesita ninguna enzima, el CO2 que se produce como producto
de la hidrólisis de la urea se hidrata de manera espontánea (HIDRATACIÓN DEL CO2) y forma el
ÁCIDO CARBÓNICO, que se une con el amoniaco del medio, formando CARBONATO DE
AMONIO y al final se titula el carbonato de amonio con el ácido clorhídrico. Cuanto más urea se
hidrolice se formará más carbonato de amonio, GASTANDO MÁS ÁCIDO CLORHÍDRICO (relación
directa).
TITULACIÓN INDIRECTA: Se titula el carbonato de amonio en relación al amoniaco (producto de la
reacción catalizada por la ureasa).
Podemos representarlo en curvas donde relacionamos LA CANTIDAD EN MILILITROS (ml) DE
ÁCIDO CLORHÍDRICO (HCl) QUE SE GASTA o podemos MULTIPLICAR LOS MILILITROS (ml)
DE ÁCIDO CLORHÍDRICO (HCl) POR X50 y con eso podemos tener la cantidad de micromolas
(umol) de urea que se han hidrolizado. Las gráficas dependen con lo que este trabajando y lo que se
este analizando.
1. Gráfico mililitros (ml) de ácido clorhídrico
2. Gráfico micromolas (umol) de urea

AGENTES DESNATURALIZANTES
GRÁFICO DE CAMPANA: TEMPERATURA O PH

El GRÁFICO EN CAMPANA nos indica que existe una TEMPERATURA Y PH óptimo y a medida
que me alejo de estos valores la afinidad enzima-sustrato disminuye.

TEMPERATURA (CALOR): En los 0° la afinidad es casi nula, pero mientras aumento la temperatura
aumenta la energía cinética y las partículas se mueven más rápido, disminuyendo la energía de
activación. El aumento de temperatura mejora la velocidad de las reacciones químicas. Hasta que
llegamos a la temperatura óptima de la reacción química en donde el sitio activo de la proteína se
mantiene en su normalidad, si seguimos aumentando la temperatura se presentará el efecto
DESNATURALIZANTE DEL CALOR y entonces la especificidad de la cerradura se afecta por lo que
la afinidad enzima-sustrato disminuye con el gasto, hasta podría inactivarse la enzima (100°C).
Temperatura óptima: 50 °C

PH: Si me alejo del valor óptimo de 7,2 ya sea hacia el lado ácido o alcalino el cambio del pH afecta
de manera inmediata la carga eléctrica de los aminoácidos afectando a los enlaces de las estructuras
terciarias y por ende el sitio activo. La afinidad enzima-sustrato disminuye por DESNATURALIZACIÓN
pH óptimo: 7,2
 FACTORES LIMITANTES DE LA REACCIÓN
GRÁFICO DE HIPÉRBOLE RECTANGULAR: CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO,
CONCENTRACIÓN DE ENZIMA Y TIEMPO DE INCUBACIÓN.

Constante de Michaelis

Reacción de primer orden

Si yo aumento la concentración
de sustrato, concentración de
enzima o tiempo de incubación,
la velocidad de la reacción se
afecta de manera logarítmica o
proporcional. Al inicio de la
gráfica se aprecia una
REACCIÓN DE PRIMER
ORDEN al aumentar el sustrato,
aumento la velocidad de reacción
que se lo mide mediante la
TITULACIÓN CON ÁCIDO
CLORHÍDRICO.
Poco a poco la curva llega a una MESETA, y esta situación de la meseta se muestra como una
REACCIÓN DE ORDEN CERO, que se da porque existen factores limitantes en la reacción.
Si cada vez AUMENTO SUSTRATO, pero no aumento de manera proporcional entonces el factor
limitante será la CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA por que existirá un momento donde todos los
lugares activos de la enzima estén ocupados alcanzando la MESETA.
Si cada vez AUMENTO ENZIMA, pero no aumento de manera proporcional el sustrato entonces un
momento donde todo el sustrato se ha HIDROLIZADO (meseta). Entonces el factor limitante será la
CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO.
Si aumento el TIEMPO DE INCUBACIÓN llegará un momento donde todo el sustrato se ha
HIDROLIZADO (meseta), entonces el factor limitante será la CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO.

LIMITANTES:
AUMENTO SUSTRATO = limitante CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA
AUMENTO DE ENZIMA = limitante CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO
AUMENTO TIEMPO DE INCUBACIÓN = limitante CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO
 Constante de michaelis-menten (km)
Km = constante de Michaelis Menten, es la CANTIDAD DE SUSTRATO que se necesita para
alcanzar la mitad (1/2) de la velocidad máxima. Es una medida que nos indica la afinidad entre la
enzima y sustrato.
Supongamos que la Km es ALTA que demora mucho para alcanzar la mitad de la velocidad máxima
(necesito MUCHO SUSTRATO para alcanzar la velocidad máxima), significa que la AFINIDAD
ENZIMA-SUSTRATO SERÁ BAJA.
Si la Km es BAJA que demora mucho para alcanzar la mitad de la velocidad máxima (necesito
POCO SUSTRATO para alcanzar la velocidad máxima), significa que la AFINIDAD ENZIMA-
SUSTRATO SERÁ ALTA.

Es inversamente proporcional:
Km BAJA = AFINIDAD ALTA = POCO SUSTRATO
Km ALTA = AFINIDAD BAJA = MUCHO SUSTRATO

¿Por qué trabajamos con la mitad de la velocidad máxima? Porque trabajar con la velocidad
máxima no es buena idea, por que sabemos cuando comienza la velocidad máxima pero no
sabemos cuándo termina. Necesitaríamos una reacción de primer orden para hacer los cálculos.

PROTEÍNAS TOTALES
- Blanco (B) = 0,078
- Estándar (S) = 0,684
- Desconocido (D) = 0,707
Concentración del estándar
(CONC S) = 6 g/dl
ALBUMINA (ALB)
- Blanco (B) = 0,035
- Estándar (S) = 0,431
- Desconocido (D) = 0,455
Concentración del estándar
(CONC S) = 4,5 g/dl

• Indicar cuanto tiene de: Proteína totales, albumina y globulina. Concluir si los valores
están bien o alterados
Se resta el estándar y el desconocido al valor del blanco obteniendo la ABSORBANCIA DEL
ESTÁNDAR, luego obtenemos el FACTOR dividiendo la concentración del estándar para la
absorbancia del estándar. Por último, multiplicamos el factor por la DENSIDAD ÓPTICA DEL
DESCONOCIDO (corregido). Para la globulina solo restamos las proteínas totales y la albumina.
Calculamos el ÍNDICE HOFFMAN dividiendo el valor de la albumina sobre el valor de la globulina.