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DE LOS MOCHIS
MICROBIOLOGIA
INGENIEIRIA BIOQUIMICA
T2P
REPORTE 5:
PRUEBAS BIOQUIMICAS
EQUIPO # 8
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Índice
Objetivos ................................................................................................................................ 3
Introducción
7. Conclusiones .............................................................................................................. 22
Referencias .......................................................................................................................... 23
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OBJETIVOS
• Realizar el procedimiento adecuadamente con el kit de pruebas bioquímicas y poder
identificar microorganismos.
• Entender los principios bioquímicos de las pruebas para la identificación de un
microorganismo.
• Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por las pruebas
Bioquímicas y determinar que microrganismo es.
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1. PRUEBAS BIOQUIMICAS
INTRODUCCION
Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias
de objeto de identificación. Algunas son rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima
preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas (Quistián García ,
2014).
Es muy común, por ejemplo, cuando se analizan ciertos tipos de muestras biológicas en busca
de microorganismos, que luego del proceso de aislamiento se realicen distintas pruebas
bioquímicas para identificar a los organismos allí presentes con cierto grado de confiabilidad
y hasta determinado nivel taxonómico, dependiendo del tipo de prueba (Puig , 2021).
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Generalmente, el fundamento de las pruebas bioquímicas aplicadas a la experimentación o
identificación microbiológica consiste en la determinación de las características metabólicas
de los microbios que se encuentran en una muestra (de un paciente o de un ambiente
determinado). Estas pruebas permiten obtener información valiosa respecto al tipo de
ambiente al que los microbios en cuestión están adaptados, lo que indirectamente contribuye
a la descripción del ambiente de donde son obtenidas las muestras. Muchas de las pruebas
bioquímicas que se aplican en la microbiología consisten en la determinación de ciertas
actividades enzimáticas o, más gruesamente, del metabolismo de distintos compuestos:
carbohidratos, aminoácidos específicos, lípidos, gases y otros compuestos orgánicos
(Willey, 2011).
2.1.1 Fundamento
El agar TSI contiene tres azúcares: glucosa, lactosa y sacarosa; rojo de fenol para detectar la
fermentación de estos carbohidratos, y sulfato ferroso para detectar la producción de ácido
sulfhídrico. La degradación o fermentación del azúcar con formación de ácido se manifiesta
por un cambio de color del indicador Rojo de fenol que vira de anaranjado-rojizo a amarillo,
o por un viraje a rojo intenso en caso de alcalinización. El tiosulfato es reducido por algunos
gérmenes a ácido sulfhídrico, el cual reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de
hierro de color negro (Koneman,1992).
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2.2 Principio del método agar citrato Simmons
2.2.1 Fundamento
Microorganismos capaces de utilizar fosfato de amonio y citrato de sodio como única fuente
de nitrógeno y carbono respectivamente crecen en este medio produciendo una reacción
alcalina y evidenciando un cambio de color por la presencia de un indicador azul de
bromotimol cambiando el medio de verde a azul (Koneman,1992).
Se utiliza para diferenciar los macroorganismos entéricos sobre la base de su capacidad para
descarboxilar o desaminar lisina y formar H2S. Para la demostración simultanea de
lisinadecarboxilasa (LD) y de la formación de ácido sulfúrico (H2S) para la identificación de
Enterobacterias, sobre todo de Salmonella, incluidas aquellas fermentadoras de lactosa, S.
arizona (Koneman,1992).
2.3.1Fundamento
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• Positivo: Las bacterias que descarboxilan la lisina producen reacción alcalina (violeta).
• Negativo: Las que desaminan producen pico violeta/fondo amarillo.
• Quienes generan H2S ennegrecen el medio principalmente en el centro y en la
profundidad.
2.4 Principio del método agar SIM
Este es un medio usado para la diferenciación de bacilos entéricos con base a la producción
de ácido sulfhídrico, indol y la movilidad (Koneman,1992).
2.4.1 Fundamento
Las bacterias reductoras de sulfato producen sulfhídrico el cual reacciona con el amonio
ferroso y se produce un sulfato ferroso (H2S) que se forma como un precipitado oscuro a lo
largo de la línea de inoculación. El medio contiene caseína rica en triptona la cual es usada
por ciertos microorganismos quienes finalmente producen indol, el cual es revelado por
reactivos como el de KovacS. La movilidad es visible ya que es un medio semisólido y siendo
positivo el crecimiento se ve por fuera de la línea de siembra, en forma de turbidez alrededor
del canal de siembra. La no movilidad se caracteriza por el crecimiento exclusivamente a lo
largo de dicho canal. La demostración de indol se efectúa mediante el reactivo según Kovacs.
La formación de indol da lugar a una coloración rojo-púrpura de la capa de reactivo
(Koneman,1992).
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actividad ureásica de Proteus spp. El medio se puede utilizar para la detección de la hidrólisis
de la urea por otras enterobacterias menos fuertes formadores de ureasa como por ejemplo
Klebsiella, Enterobacter, ciertos micrococos entre otros, aunque el periodo de incubación
debería ser más largo (Koneman,1992).
2.6.1 Fundamento
La urea es hidrolizada por la enzima ureasa, formando dióxido de carbono y amoníaco. Este
último proporciona reacción alcalina al medio, que puede comprobarse por el viraje del
amarillo al rojo púrpura del indicador de pH rojo fenol contenido en el medio
(Koneman,1992).
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3. MATERIALES Y METODOS
3.1 Material
• Mechero.
• Muestra representativa.
• Reactivos.
• Haza bacteriológica.
• Gradilla.
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2. Introducimos nuestra haza y procedimos a sembrar por la técnica de picadura y estría,
teniendo cuidado de no estriar en el aire, no tocar el cristal de nuestro tubo de ensayo
y de no romper el agar Ilustración 4.
3. Flameamos nuevamente la boquilla de nuestro tubo, cerramos y posicionamos en la
gradilla.
6.3 Agar Lisina
1. Tomamos nuestro tubo de ensayo de ensayo que contenía nuestro LIA, lo destapamos
y flameamos la boquilla al mechero.
2. Introducimos nuestra haza y procedimos a sembrar por la técnica de picadura y estría,
teniendo cuidado de no estriar en el aire, no tocar el cristal de nuestro tubo de ensayo
y de no romper el agar Ilustración 5.
3. Flameamos nuevamente la boquilla de nuestro tubo, cerramos y posicionamos en la
gradilla.
6.4 Agar SIM
1. Tomamos nuestro tubo de ensayo de ensayo que contenía nuestro SIM, lo destapamos
y flameamos la boquilla al mechero.
2. Introducimos nuestra haza y procedimos a sembrar por la técnica de picadura,
teniendo cuidado de no picar en el aire, no tocar el cristal de nuestro tubo de ensayo
y de no romper el agar Ilustración 6.
3. Flameamos nuevamente la boquilla de nuestro tubo, cerramos y posicionamos en la
gradilla.
6.5 Voges Proskauer
1. Tomamos nuestro tubo de ensayo de ensayo que contenía nuestro Voges Proskauer,
lo destapamos y flameamos la boquilla al mechero.
2. Introducimos nuestra haza y procedimos a sembrar por la técnica de esporulación
Ilustración 7.
3. Flameamos nuevamente la boquilla de nuestro tubo, cerramos y posicionamos en la
gradilla.
4. Repetimos el procedimiento en ambos tubos que contenían este medio de cultivo.
6.6 Urea
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1. Tomamos nuestro tubo de ensayo de ensayo que contenía nuestra Urea, lo destapamos
y flameamos la boquilla al mechero.
2. Introducimos nuestra haza y procedimos a sembrar por la técnica de esporulación
Ilustración 8.
3. Flameamos nuevamente la boquilla de nuestro tubo, cerramos y posicionamos en la
gradilla.
7. Terminado el proceso de siembra en nuestras pruebas bioquímicas, producimos a
esterilizar el haza bacteriológica tres veces al mechero.
8. Llevamos nuestras muestras a la incubadora a 37 °C por 24 hrs (es lo que nos indicaba
la técnica, pero nuestras muestras se incubaron 36 hrs aproximadamente).
9. Se esterilizo el área de trabajo nuevamente.
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4. PROCESO DE SIEMBRA ILUSTRADO
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5. RESULTADOS
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LIA (Desaminación y Desaminación de Desaminación de
descarboxilación de aminoácidos: aminoácidos:
aminoácidos) Positiva: la superficie del Negativo
tubo es de color rojo vino.
Negativo: la superficie no Descarboxilación de
tiene cambios. aminoácidos:
Descarboxilación de Positiva
aminoácidos
Positiva: el fondo del tubo
es color púrpura.
Negativo: el fondo del tubo
es de color amarillo.
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Prueba de rojo de metilo Se agregaron 5 gotas de Positivo
rojo de metilo
Positivo: color rojo en la
superficie del medio de
cultivo (producción de
acetil-metil-carbonilo)
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Hidrólisis de urea Producción de ureasa Negativo.
Positiva: color rosa fucsia
en el medio.
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Pruebas bioquímicas antes de la realización y antes de cumplir las 24 Horas de
incubación indicadas.
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6. CUESTIONARIO
1. NOMBRE DE LA BACTERIA: SALMONELLAIII ARIZONA
2. ¿Quépasaría si laspruebasbioquímicas se dejaran más de 24 horas?
En el caso del TSI si su lectura se afecta después de las 24 horas se pueden obtener falsos negativos por
consumo de peptona durante el crecimiento de los microorganismos con la consecuente alcalinidad del
medio de cultivo.
3. ¿Por qué siempre que se identifica una bacteria se poneuna serie de pruebas bioquímicas sin
inocular?
Para no contaminar los tubos con otra bacteria que no queramos identificar, para que sea mas certero
nuestro resultado ypoder determinar la bacteria.
Los microorganismos con mayores halos de hidrólisis de almidón coinciden con algunos de los
identificados como Bacillus amyloliquefaciens (FD1, AD4), Bacillus vallismortis (AD2, FD3, FC5) y
Leuconostoc mesenteroides (FC8) son bacterias prometedoras para procesos industriales como la
producción de amilasas.
7. ¿Qué otros azucares se pueden utilizar para la fermentación de azucares en tubos con
campana de Durham?
Maltosa ymanitol
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8. ¿Quésignifica TSI yque es lo que podemos observar en estaprueba?
TSIsignifica Hierro de Triple Azúcar Estemedio fermentatres azucares glucosa, lactosa yfructosa.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro
yamonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinancon el ácidosulfhídrico yproducensulfuro
de hierro, de colornegro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodiomantiene el balance
osmótico. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se
detectan pormediodelindicador rojo de fenol, el cualvira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato
de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el
típico sulfuro de hierro de color negro.
La utilización del citrato por la bacteria que se va a probar se detecta en el medio de citrato por la
producción de subproductos alcalinos. La utilización del citrato por la bacteria que se va a probar se
detecta en el medio de citrato por la producción de subproductos alcalinos. La prueba positiva está
representada por la producción de color azul oscuro en el término de 24 a 48 horas, que indica que el
microorganismo en prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con formación de
productos alcalinos (incrementa pH del medio) lo que representa pH de 6 o 7 si el pH fuera menor
quedaría de colorverde.
La urea es hidrolizada por la enzima ureasa, formando dióxido de carbono y amoníaco. Este último
proporciona reacción alcalina al medio, que puedecomprobarse por el viraje del amarillo al rojo púrpura
del indicador de pH rojo fenol contenido en el medio.
Medio de cultivo en el cual la tripteína y la peptona aportan nutrientes para el desarrollo microbiano. El
triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas yparticularmente de la tripteína ypuede
ser metabolizado por algunasbacterias para formar indol.
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12. ¿Quésignifica MIOy cual es el fundamento de estaprueba?
MIO significa Medio de movilidad indol ornitina, su fundamento es altamente nutritivo por la presencia
de extracto de levadura, peptona ytripteína. La tripteína aporta gran cantidad de triptofano, sustrato de la
enzima triptofanasa a partir del cual se forma indol que puede ser revelado con el reactivo de Ehrlich
(Indol Reactivo REF B1550361) o de Kovac´s por la formación de un compuesto de color rojo. La
glucosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima
ornitinadecarboxilasa, el púrpura debromocresol es el indicador depH, que en medioalcalino es de color
púrpura y en medio ácido es amarillo.
Fermentación de hidratos de carbono. El medio TSI contiene 3 hidratos de carbono: glucosa con
concentración del 0,1% y lactosa y sacarosa al 1%. Los microorganismos pueden: a) fermentar sólo la
glucosa, b) fermentarlostreshidratos de carbonoyc) no fermentar ni la glucosa ni la lactosa y/o sacarosa.
La fermentación puede efectuarse con produccióno no de gases (CO2 + H2)
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nuevamentearojo) por liberación de NH3. Estosmicroorganismossonincapaces de fermentar la lactosa
y/o sacarosa.
Cianuro de potasio (KCN) se utiliza sobre todo para diferenciar entre organismos de las
Enterobacteriaceae: Citrobacter freundii (resistente a la inhibición del KCN) de los grupos Salmonella-
Arizona (sin crecimiento, sensibles).
El fundamento de esta prueba es determinar la capacidad de un organismo de vivir yreproducirse en un
medio que contenga cianuro de potasio. Muchas de las enzimas que se encuentran en una célula
bacteriana requieren para su actividad un iónmetálico.
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7. Conclusiones
Las pruebas bioquímicas sirven para identificar microorganismos en su forma metabólica, por eso es que
reaccionan con ciertas sustancias, es de sumaimportancia conocer como se comportan.
En forma persona fue algo difícil saber identificar cada medio y mediante la tabla de identificación de
enterobacterias. Las pruebas bioquímicas son una serie de análisis clínicos que sirven a la medicina como
apoyo a la hora de diagnosticar infecciones por bacterias, por eso mismo es de suma importancia tener
muchísima precaución al momento de tomar las pruebas y analizarlas, no abrir ya que podríamos
contaminarnos yprovocarnos una enfermedadgrave.
Según nuestras deducciones la muestra de bacteria contenía una Salmonella II Arizona en el aislamiento de
Salmonella arizonae, agente poco habitual en carnes para consumo humano, pero frecuente en intestino de
reptiles y quelonios. Pese a que S. arizonae fue detectada en períodos de tiempo distantes, llamó la atención
que ambas muestras procedieran de la misma carnicería y aparentemente del mismo establecimiento
frigorífico, lo que podría indicar una fuente permanente de infección y una situación de evidente riesgo
sanitario.
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Bibliografía
KONEMAN, A. D. (24 de Agosto de 1992). SERIES DE IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA. En
Diagnostico Microbiano (3 ed., págs. 46-60). Buenos Aires, Argentina.: Médica Panamericana.
Obtenido de https://mdmcientifica.com/wp-content/uploads/2021/03/IS-24-SERIES-DE-
IDENTIFICACION-BIOQUIMICA.pdf
Willey, J. M. (2011). Prescott’s microbiology (Vol. 7). New York. Recuperado el 2023 de Marzo de 25
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