Taller 1

Genética.2023. 1° Unidad
Académica de Histología
FMED, UBA.

TALLER 1 DE GENÉTICA

MUTACIONES Y
TÉCNICASDE BIOLOGÍA
MOLECULAR APLICADAS A
LA DETECCIÓN DE
MUTACIONES

2023

1
 Taller 1:
El taller 1 será trabajado con sus docentes y estudiantes de su misma comisión durante 2
semanas en forma presencial (semanas que comienzan los días 7/8 y 14/8)

Los objetivos de este taller son:

 conceptualizar el término gen, alelo, mutación, variantes de secuencia, polimorfismos
 caracterizar tipos de secuencias del genoma humano,
 aplicar distintas técnicas de biología moleculares según su alcance e interpretar la
información que surge de ellas.
La resolución de los siguientes ejercicios se basa en contenidos de las Síntesis conceptuales
(SC): SC 1 (Organización del genoma y secuenciación); SC2 (Mutaciones); y SC3 (Técnicas
de diagnóstico Molecular)
Se recomienda para una mayor optimización del tiempo y profundización de temas, que antes de
participar del taller, usted:
 vea las SC1-3;
 vea el material audiovisual: Video Conceptos básicos y Video Variabilidad genética y su
aplicación en estudios de filiación y medicina forense (están en el aula-campus Fmed
Genetica)
 estudie de los libros de textos recomendados oficialmente (ver Bibliografía en el aula):
las características del genoma humano y los fundamentos de las técnicas de
Secuenciación (Enzimática de Sanger; Sanger Automatizada; Masiva-de alto
rendimiento, extracción de ADN, electroforesis de ADN, PCR punto final o
convencional, PCR alelo específica

Capítulos de libros asociados (a los contenidos del Taller 1) Hay varios libros recomendados
oficialmente por ello es difícil explicitar el número o título del capítulo correspondiente, pero
explicitaremos en este caso el nombre de los capítulos en el Texto de "Emery-Elementos de
Genética Médica" a modo de ejemplo y orientación: Capítulo 2 Bases celulares y moleculares de
la herencia; Capítulo 4 Tecnología y aplicaciones del ADN

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Introducción:
Existen múltiples técnicas moleculares para determinar de manera directa la secuencia de
nucleótidos presentes en un fragmento de ADN, que pueden utilizarse para detectar variaciones
respecto de una secuencia tomada como patrón (secuencia wild type). Esas variaciones son
consideradas mutaciones: cambios permanentes en la secuencia del ADN.
En esta Unidad analizaremos dos aplicaciones de las técnicas directas de detección de
mutaciones: el diagnóstico molecular en el contexto de enfermedades producidas por
mutaciones en genes únicos (el presente caso clínico que se trabajará en las videollamadas de
taller); y el uso en filiación y medicina forense (cuya ejercitación está en un cuestionario en el
aula virtual de Genética: “Ejercitación asincrónica sobre análisis de las variantes en filiación”).
Volviendo exclusivamente al presente taller, las técnicas analizadas son: PCR convencional o de
punto final, PCR alelo específica y secuenciación de Sanger. Para interpretar correctamente los
resultados de las técnicas moleculares deben comprenderse sus fundamentos bioquímicos y
tener en cuenta las características de las secuencias presentes en el genoma humano.
 Caso clínico: Fibrosis quística.
Aplicación de técnicas directas para la detección de mutaciones en el diagnóstico
molecular. PCR, PCR alelo específica y secuenciación de Sanger.
La Fibrosis quística constituye una patología multisistémica producto de la alteración en el
transporte de iones en las células epiteliales. Afecta principalmente, a la secreción de las
glándulas exocrinas y a los epitelios de los aparatos respiratorio, digestivo y reproductor. Desde
un enfoque genético clásico, se la define como una entidad monogénica mendeliana de herencia
autosómica recesiva. Esto significa que padecen la enfermedad quienes poseen en su genoma
dos variantes alélicas patogénicas del gen involucrado, heredadas por vía materna y paterna
respectivamente.
En el año 1989 puedo determinarse que el gen involucrado en esta patología codifica un canal
iónico que fue denominado CFTR1 (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator:
Regulador transmembrana de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística).
Variante alélica wild type: El locus del gen CFTR está ubicado en 7q31.2; presenta una
longitud de 230 kb, contiene 27 exones. Su producto es un ARNm de 6.5 kb, que es traducido en
la proteína canal cftr. Esta proteína es transportada a la membrana plasmática y está involucrada
en el transporte de iones Cl- y HCO3- , y en la regulación de múltiples canales iónicos (entre
ellos Canal epitelial de sodio: ENac); en consecuencia, participa en diferentes procesos celulares
(Ej.: respuestas celulares a AMPc; transporte de cloruros; modificación del pH intracelular;
hiperpolarización de membrana, exocitosis, entre otros)
Variantes alélicas patogénicas: Desde su identificación, se han descripto alrededor de 1.900
variantes de secuencia (mutaciones) del gen CFTR. Los tipos de mutaciones que se relacionan
con fenotipos clínicos enfermos son mayormente: mutaciones sin sentido (corren el marco de
lectura produciendo codones de terminación prematuros), mutaciones en sitios que regulan
procesos de splicing (ARNm más cortos o con estructura inestable, conlleva a una alta velocidad
de degradación sin traducción); o mutaciones con cambio de sentido (cambian la secuencia
aminoacídica alterando la estructura/función proteica). Estos tipos de mutaciones generan desde
un punto de vista funcional celular pérdida de función (alelos nulos o alelos hipofuncionantes).
La mutación más prevalente en afectados es c.1521-1523delCTT// p.Phe508del (mutación que a
nivel del ADN representa la pérdida de 3pb entre los nucleótidos 1521-1523 del exón 10 y a
nivel proteico se expresa como la ausencia del aminoácido fenilalanina en la posición 508,
generando un defecto en el plegado proteico que altera su transporte a su localización definitiva
en la membrana plasmática, comportándose como un alelo nulo. Esta mutación presenta una
prevalencia del 70% en población de Europa del norte. En Argentina también es la mutación
más frecuente con una prevalencia del 59% en los afectados
Presentación del caso:
Una niña de 8 años presenta signos compatibles con fibrosis quística, pero el diagnóstico es
controversial. Se decide realizar una prueba de diagnóstico molecular para determinar la
presencia de la mutación p.Phe508del. La prueba consiste en amplificar mediante PCR una
región del gen que contiene el triplete CTT del exón 10. Los productos de amplificación se
resuelven luego en un gel de poliacrilamida.
A continuación, se muestra el resultado de la prueba molecular de los miembros de la familia y
de la niña con diagnóstico presuntivo de fibrosis quística (probando):
1.1 Interprete el patrón de bandas para cada individuo de la familia. ¿Pude explicarse el
diagnóstico clínico del probando con esta prueba?

Basándose en los resultados obtenidos, se decidió buscar la presencia de la segunda mutación

más frecuente, llamada G551D, que provoca un cambio de un aminoácido de glicina (G) por un
ácido aspártico (D) en la posición 551 de la cadena polipeptídica. Para realizar la búsqueda de la
mutación G551D se utilizó PCR alelo específica.

1.2 Explique el fundamento de la PCR alelo específica. ¿Qué resultados esperaría ver si
la mutación G551D estuviera ausente en la muestra analizada? ¿Y si estuviera
presente? ¿Cómo distinguiría la presencia de la mutación en homocigosis y
heterocigosis?

El siguiente es el resultado de la PCR alelo específica para la mutación G551D

1.3 ¿Qué conclusiones puede sacar de esta prueba para la familia analizada?

1.4 ¿Considera completa la realización de la PCR alelo específica según lo visto en el

video introductorio? Justifique
Se realizaron pruebas con otras 10 mutaciones frecuentes, que en conjunto permiten explicar el
84% de los casos. No se pudo encontrar una de estas mutaciones en la familia estudiada.
Por esa razón, se decidió secuenciar el gen CFTR en los miembros de la familia utilizando el
método de secuenciación de Sanger. Se detectó una variación respecto de la secuencia wild type,
en la posición 113 del exón 3. Esta mutación fue hallada en muestras de la madre y del
probando, pero no en muestras del padre y del hermano del probando.

A continuación, se muestra el fragmento de la secuenciación que compara la secuencia wild type

(izquierda) y la mutada (derecha).

1.5 Observe los fragmentos del electroferograma de la secuenciación. ¿Qué

significaque haya un ‘doble pico’ en la posición en dónde se observa la mutación?

1.6 ¿Explica la mutación hallada el diagnóstico clínico de fibrosis quística en la niña?

Justifique.