Introducción de la técnica PCR-RFLP para el

diagnóstico de dos mutaciones en el gen VHL

Para recordar:
1. Preguntar cualquier duda.
2. Mandar el video a tiempo. Esto afecta la nota de todos.
3. No todo lo que esta escrito acá es para nombrar, algunos datos son para
orientarse. Exponder de acuerdo al orden de las diapositivas
4. El video dura 10 min. Ni un minuto más ni uno menos.
5. Entender las técnicas es primordial.

INTRODUCCIÓN

El gen es VHL cuyas mutaciones de origen

germinal dan origen a una enfermedad de
herencia autosómica dorminante llamada la
enfermedad de Von Hippel Lindau (VHL.
La patología se caracteriza por la aparición de
quistes y masas vicerales, malignas y benignas
en varias partes del cuerpo.

Los pacientes con esta patología pueden desarrollar:

- hemanglioblastomas del sistema nervioso central y la retina
- Múltiples quistes de páncreas y riñones
- Carcinoma renal
- Feocromocitomas (un tipo de cancer poco frequente que se da en las glándulas
suprarrenales

Este gen ayuda a controlar la forma en que las células crecen, se dividen y mueren.

- La expresividad de la patología es muy variable, y las edades de las primeras

manifestaciones igual lo son.
- Este es un gen supresor tumoral.
- El diagnóstico genético molecular de mutaciones puntuales en el gen VHL requiere
la combinación de estrategias de
cribado y secuenciación de su región
codificante, que se extiende a lo largo
de tres exones.
Gen: VHL
Ubicado: Brazo corto cromosoma 3 (3p25-26)
Codifica para: proteína ubiquitina ligasa,
involucrada en la respuesta celular por
hipoxia.
Tipo de mutación: mutaciones germinales
Patrón de herencia: autonómico domínate
Frecuencia: 1 en 36.000 nacimientos
Proteína ubiquitina ligasa: Proteína involucrada en la respuesta celular por hipoxia.
También llamada E3 ubiquitina ligasa, es una proteína que recluta un complejo

¿qué es la hipoxia?: es un estado de deficiencia de oxígeno en la sangre, células y tejidos

del organismo, con compromiso de la función de los mismos.

Vía afectada: En la imagen podemos ver el proceso de transcripción de genes

relacionados con la hipoxia en condiciones de normoxia (cuando los niveles de oxigeno
son normales para llevar a cabo procesos celulares) pero con deficiencia en la función del
complejo proteíco supresor tumoral del VHL, como tiene lugar en los casos de la
enfermedad de Von Hippen Lindau gracias a las mutaciones.

HIF: Los factores inducibles por hipoxia son factores de transcripción que responden a la
disminución del oxígeno disponible en el entorno celular, o hipoxia.

Materiales y métodos:
- El estudio se llevó a cabo en el laboratorio de biología molecular del CNGM, entre
los meses de enero y diciembre del año 2011.
- Se estudiaron pacientes con
diagnósticos clínicos de la PCR – RFLP:
enfermedad y familiares en riesgo Es una técnica que combina PCR y RFLP, y que
atendidos en la consulta de genética nos permite:
clínica del Hospital Hermanos 1. Amplificar fragmentos de ADN
Ameijerias. 2. Obtención de trozos más pequeños a
Cabe aclarar que todo el proceso que partir de estos fragmentos
vamos a llevar a cabo se llama PCR- 3. análisis de patrones de bandas por
RFLP. medio de electroforesis.

El paso a paso de todo lo que se hizo fue:

1. Para determinar la existencia de endonucleasas cuyos sitios de restricción
resultaran afectados por la presencia de las mutaciones c.362A>G y c.481C>T, se
empleó el programa informático CLC Sequence Viewer. El análisis se realizó a partir
de la secuencia de ADN de referencia para el gen VHL (GeneBank: NG_008212.3).
2. Para la optimización y validación de la digestión enzimática se emplearon muestras
de ADN pertenecientes a 24 individuos previamente caracterizados mediante
secuenciación de ADN. (extracción)
3. EL ADN se aisló mediante el método de precipitación salina,7 a partir de muestras
de sangre periférica.
4. Posteriormente se cuantificaron las muestras de ADN mediante
espectrofotometria.

5. PCR
Para la amplificación del ADN se emplearon los cebadores dNTPs:
- 5’-AGCCACCGGTGTGGCTCTTTA-3’ y 5’-ACATCAGGCAAAAATTGAGAACTGG-3’ para
el exón 2
- Y 5’-CCTTGTACTGAGACCCTAGTCTGTCACT-3’ y 5’-
CAAGACTCATCAGTACCATCAAAAGCTG-3’ para el exón 3 del gen VHL.
Las reacciones se llevaron a cabo en volúmenes de 25 μL que contenían 0,4 μM de
cada cebador; 0,1 mM de dNTPs; 2,5 U de Taq ADN Polimerasa; 1x de solución
tampón de la polimerasa; 1,5 mM de MgCl2 y de 50 a 100 ng de ADN genómico

Este proceso consta de los tres pasos subrayados:

A) una desnaturalización inicial a 95°C por 5 minutos, seguida de 30 ciclos de
desnaturalización a 95°C por 40 segundos. Aquí gracias a las altas temperaturas
se romperan los puentes de hidrogeno separando las cadenas
B) alineamiento a 57°C (para el exón 2) o 54°C (para el exón 3) durante 40
segundos. Aquí se unirán los primers nombrados anteriormente. Y como
pueden ver la temperatura baja, esto es para que los cebadores se puedan
unir.
C) polimerización a 72°C por 40 segundos, seguida de una extensión final a 72°C
por 5 minutos. Gracias a la Taq polimerasa se llevará a cabo la amplificación. La
Taq polimerasa es una enzima resistente a las altas temperaturas, por eso se
utiliza. La temp que usamos en este paso es ideal para la enzima.
El producto de este técnica se llama amplicón.

6. La digestión enzimática para la

detección de la mutación. Sirve
para fragmentar el ADN.
a) c.362A>G se realizó en un volumen
de 30 μL, que contenía: 2 U de la
enzima SfaN I, 1x de solución
tampón de la endonucleasa y 10 μL
del producto del PCR.
b) c.481C>T la digestión enzimática se
realizó en un volumen de 30 μL,
que contenía: 2,5 U de la enzima
BtgZ I, 1x de la solución tampón de
la enzima, 3 μg de BSA y 15 μL del
producto de PCR.
Mutaciones:
Son de tipo germinal
1. 362A>G: El 362 es la posición donde
se dio la mutación en el exón (en
este caso el 2). A>G representa la
transición (cambio purina por otra
purina en este caso) de A por G.
2. 481C>T: El 481 es la posición donde
se dio la mutación en el exón (en
este caso el 3). C>T representa la
transición (cambio de una pirimidina
por otra pirimidina en este caso) de C
a T.

7. El producto de la digestión fue analizado mediante electroforesis de ADN en un

gel de agarosa al 2 %, teñido con bromuro de etidio y fotografiado sobre un
transiluminador de luz ultravioleta.
Para explicar esto debemos partir del punto anterior: Estas enzimas cortan
secuencias específicas separandolas, los fragmentos de diferentes tamaños se
someten a la electroforesis y emigran en el gel de agarosa en función de su tamaño
 Los fragmentos más pesados (o más largos, con más pb) van arriba, y los más
cortos/livianos abajo. Si hay una mutación (como veremos en los resultados) no se
encontrarán cortes porque las enzimas no tendrán secuencia a reconocer.
8. Se compararon los genotipos obtenidos mediante secuenciación y por PCR-RFLP
atendiendo a las variables: presencia de la mutación c.362a>g y presencia de la
mutación c.481c>t, ambas cualitativas dicotómicas.

Resultados: es una parte bastante

importante, tratar de explicar con sus propias
palabras, igualmente en la guía específica que se
debe hablar del tamaño de las bandas, es decir lo
que pueden ver subrayado en gris, ej: el paciente
2 tiene dos bandas, una con un tamaño de 212pb
y otra de 54pb.
1. 362A>G: Esta mutación elimina el sitio
de restricción de la enzima SfaN I, en
el segundo exón del gen.
11 pacientes con la enfermedad tenían
esta mutación
En la mutación c.362A>G se da que en
las bandas en electroforesis para los
pacientes son:
2: 212pb + 54pb ---- sano.
3: 266pb (mutación)
4: 266pb (mutación)
5: 266pb (mutación)
6: 212pb + 54pb --- sano
7: 212pb+54pb ---- sano

2. 481C>T: Esta mutación elimina el

sitio de restricción de la enzima
BtgZ I en el tercer exón del gen
VHL.
10 pacientes con la enfermedad
tenían el gen
En la mutación c.481C>T se da
que en las bandas en
electroforesis para los pacientes
son:
2: 208pb + 84pb ------ sano
3: 292pb (mutación)
4: 292pb (mutación)
5: 292pb (mutación)
6: 208pb + 84pb ------ sano
7: 208pb+ 84pb ------- sano

Conclusión y discusiones:
La investigación da la introducción a una nueva forma para el diagnóstico
molecular de las mutaciones  c.481C>T (p.Arg161ter) -más frecuentes en familias
Von Hippel-Lindau en todo el mundo-, c.362A>G (p.Asp121Gly) -frecuente en
familias con ascendencia europea y asiático- las cuales son germinales del gen
VHL en el laboratorio de biología molecular del CNGM. La investigación se basa
de una técnica como la amplificación por PCR y la digestión de enzimas de
restricción (PCR-RFLP).

Se destaca el uso de un programa bioinformático (CLC Sequence Viewer, versión

6.5.1) para el análisis de la secuencia del gen y la identificación de sus enzimas.
Mediante esto se lograron los resultados obtenidos por SSCP-secuenciación en la
totalidad de los casos estudiados. No se hallaron discrepancias pero se haya
claridad de que la técnica PCR-RFLP es más sencilla, económica y rápido puesto
que solo dura dos días, en comparación de los siete para la secuenciación.

Este resultado es positivo al tratarse de la búsqueda de mutaciones con

descendencia familiar y reconocida en otros miembros de la familia dando un gran
avance al diagnosticar prontamente las posibles enfermedades. En este
laboratorio la técnica PCR-RFLP es empleada con eficacia, con resultados
satisfactorios en el estudio de varias enfermedades genéticas frecuentes en Cuba.
El estudio muestra que el diagnóstico de mutaciones puntuales del gen VHL
también puede ser realizado mediante su aplicación.

Conclusión.

La investigación estandarizó la técnica PCR-RFLP porque tiene ventajas sobre la

estrategia SSCP-secuenciación para establecer de forma rápida, económica y
confiable para el diagnóstico de la enfermedad VHL en casos donde haya
prevalencia en la familia y es aplicable al diagnóstico confirmatorio, presintomático
y prenatal de la enfermedad de Von Hippel Lindau. 

Se le realiza un agradecimiento a todo el personal que hizo parte de la

investigación del laboratorio de biología molecular del CNGM que han participado
en la estandarización de las técnicas necesarias para el diagnóstico molecular de
esta condición.
Videos que les recomiendo ver:
- Sobre PCR-RFLP: https://www.youtube.com/watch?v=wYMtr9bSBUY
- Sobre la patología: https://www.youtube.com/watch?v=v6cJB43iwyE&t=175s