Taller 1 de

genetica
Docentes
 David Rios
 Roman Bonani
 Lorena Lopez
 Belen Viana
Objetivos
 Conceptos generales de tipos de
secuencias y mutaciones.

 Fundamentos y aplicación clinica de

PCR, PCR alelo espacifico y
secuenciacion.
Parte 1
Mutaciones:
 Sinsentido
 En sitios de splicing
 Cambio de sentido
Problema:
 Una niña de 8 años presenta signos compatibles con fibrosis
quística, pero el diagnóstico es controversial. Se decide realizar una
prueba de diagnóstico molecular para determinar la presencia de
la mutación p.Phe508del. La prueba consiste en amplificar
mediante PCR una región del gen que contiene el triplete CTT del
exón 10.

1.1 Interprete el patrón de bandas para cada individuo de la

familia. ¿Pude explicarse el diagnóstico clínico del probando con
esta prueba?
 1.2 Explique el fundamento de la PCR alelo específica. ¿Qué
resultados esperaría ver si la mutación G551D estuviera ausente en
la muestra analizada? ¿Y si estuviera presente? ¿Cómo distinguiría
la presencia de la mutación en homocigosis y heterocigosis?
 El siguiente es el resultado de la PCR alelo específica para la
mutación G551D
 1.3 ¿Qué conclusiones puede sacar de esta prueba para la
familia analizada?
 Se realizaron pruebas con otras 10 mutaciones frecuentes, que
en conjunto permiten explicar el 84% de los casos, dando todas
negativas.
 Por esa razón, se decidió secuenciar el gen CFTR en los miembros
de la familia utilizando el método de secuenciación de Sanger.
Se detectó una variación respecto de la secuencia wild type, en
la posición 113 del exón 3. Esta mutación fue hallada en muestras
de la madre y del probando, pero no en muestras del padre y
del hermano del probando.
 Explique el fundamento de la técnica de
secuenciación de Sanger.
 ATTGC A

Capilar
Pol.
….. líquid
o
Laser
Placa caliente -
Pris
ma Reacció
Ventana
Detectores
+ n
Secuenci
a
 1.5 Observe los fragmentos de la secuenciación. ¿Por qué
hay un ‘doble pico’ en la posición en dónde se observa la
mutación?
 1.6 ¿Explica la mutación hallada el diagnóstico clínico de
fibrosis quística? Justifique.
Parte 2
 2.1 ¿Por qué no se utiliza el análisis de ADN de
regiones codificantes con fines forenses?

 2.2 ¿Por qué al analizar un microsatélite particular

algunos individuos presentan una única banda
(ejemplo: individuo 5, para el microsatélite
D7S820), mientras que hay otros que presentan
dos bandas (ejemplo: individuo 7, para el mismo
microsatélite)?
 2.3¿Cuáles son los mecanismos
biológicos que permiten explicar el alto
polimorfismo poblacional de los
microsatélites?

Estos polimorfismos se generan por errores durante la replicación

 2.4 Observe la siguiente tabla perteneciente a un caso en que se quiere
establecer una relación de paternidad entre un niño y un presunto padre
A (p-padre A), versus presunto padre B (p-padre B). Los valores
representan el número de repeticiones observadas en los alelos de los
microsatélites estudiados, que han sido determinados mediante la
técnica de PCR con posterior electroforesis en gel. ¿Qué conclusiones
obtiene? ¿Alguno de los dos es el padre biológico del niño? Justifique.
Guia Complementaria
Ejercicio 1
 Estudio de infertilidad masculina tiene como
objetivo: asociar mutaciones del exón 3 del gen
CFTR, con la presencia de azoospermia.
 Se recolectan muestras de sangre de distintos
individuos (un grupo con azoospermia: grupo
casos; y otro grupo con espermogramas
normales: grupo controles) y se realiza
extracciones de ADN a partir de esas muestras.
 Se encuentra que la enzima de restricción HinfI
corta en la secuencia wild type. Los productos de
digestión esperados corresponden a bandas de
172, 105 y 32 pb en individuos con la variante wild
type.
 1.1Observe los resultados obtenidos de distintas
muestras (calles 3, 4 y 5) e interprete los
genotipos posibles indicando si corresponden a
homocigotas para la variante wild type;
heterocigotas; homocigota para una variante
distinta a la wild type.
 1.2 Este grupo de investigación observó que el perfil de
bandas de la calle 4 se presentó en el 80% de los individuos
del grupo de casos y sólo en el 1% de los individuos del
grupo control. Por lo cual en una segunda etapa se
propusieron conocer la secuencia del exón 3 de los
individuos del grupo de casos con el perfil de bandas de la
calle 4.
 Hubo una discusión dentro del grupo de investigadores
sobre si comenzar con una estrategia de secuenciación de
alto rendimiento, versus una secuenciación de Sanger
automatizada. ¿Qué estrategia elegiría usted?
Fundamente. ¿Qué estrategia utilizaría para el 20% restante
del grupo de casos? Fundamente.
 1.3 Del resultado de la segunda etapa obtuvieron que los
casos, que correspondían al 80%, tenían una sustitución
(cambio en un nucleótido A por G en la misma posición
del exón 3) respecto a la secuencia wild type que anulaba
un sitio de restricción de la enzima HinfI. Y por la frecuencia
obtenida de esta variante en homocigosis en los casos
enviaron a publicar un artículo asociando esta variante a
la producción de azoospermia. Uno de los revisores del
artículo le solicitó la frecuencia alélica en población
general masculina de esta variante antes de autorizar la
publicación del estudio. ¿Qué importancia tiene esta
observación realizada?
 1.4 Como los investigadores no tenían datos de frecuencia alélica en
población general, se les ocurrió utilizar 100 muestras de donantes
masculinos de sangre de distintos hospitales, y realizar con cada una
de las muestras una estrategia de PCR alelo específica.
 El ensayo que diseñaron fue: cada muestra era dividida en dos tubos
que diferían en el primer forward; en el primer tubo se colocaba el
primer forward que aparea con la secuencia wild type y en el
segundo tubo el primer forward que aparea con la variante de la
sustitución.
 Se observaron 3 grandes patrones de productos de amplificación
(patrón de bandas en el gel), graficados a continuación. ¿Qué
patrón podría corresponder a los individuos homocigotas para la
variante wild type, heterocigotas y homocigotas para la variante
posiblemente patogénica?
 1.5 De las 100 muestras analizadas sólo 4 individuos era heterocigotas,
94 fueron interpretados como homocigotas para la variante wild type
y 2 individuos fueron interpretados como homocigotas para la
variante posiblemente patogénica. Contentos con esta frecuencia
baja del alelo posiblemente patogénico en la muestra, volvieron a
enviar el artículo para publicar.
Esta vez otro revisor le solicitó que:
a) En los individuos interpretados como homocigotas, confirmaran el
genotipo por secuenciación
b) Describieran el efecto podría tener esta sustitución en la transcripción
del gen, en la traducción del polipéptido y a nivel del epitelio de los
conductillos eferentes.
c) Y explicitaran si hay algún gen ortólogo del CFTR en ratón y/o modelo
animal sobre esta patología
 ¿Qué importancia tienen estas observaciones realizadas?
Efecto de las mutaciones en la función celular
Alelo nulo (amórfico)
Pérdida de Función
Alelo hipofuncionante (hipomórfico)

Alelo antagonista (antimórfico)

Alelo hiperfuncionante (hipermórfico)

Ganancia de Función
Alelo neofuncionante (neomórfico)

Este tema se retomará y aplicará en entidades monogénicas