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El  diario  de  plantas  (1994)  6  (2),  271­282

AVANCE  TÉCNICO

Transformación  eficiente  de  arroz  (Oryza  sativa  
L.)  mediada  por  Agrobacterium  y  análisis  de  
secuencia  de  los  límites  del  T­DNA
Yukoh  Hiei*,  Shozo  Ohta,  Toshihiko  Komari  and  Takashi   (GUS)  y  sugirieron  que  el  T­DNA  se  había  transferido,  integrado  y  
Kumashiro  Plant  Breeding   expresado  en  células  de  arroz.  Gould  et  al.  (1991)  describieron  la  
and  Genetics  Research  Laboratory,  Japan  Tobacco  Inc.,  700   transferencia  de  genes  para  NPT  y  GUS  en  ápices  de  brotes  de  maíz,  la  
Higashibara,  Iwata,  Shizuoka  438,  Japón subsiguiente  regeneración  de  plantas  y  la  detección  de  los  genes  
transferidos  en  la  progenie  F1  por  hibridación  Southern.

Sin  embargo,  estos  primeros  estudios  de  transformación  de  
Resumen
monocotiledóneas  mediada  por  Agrobacterium  han  sido  
Se  obtuvo  un  gran  número  de  plantas  de  arroz  trangénicas,   controvertidos.  Por  ejemplo,  Potrykus  (1990)  presentó  una  revisión  
fértiles  y  morfológicamente  normales  mediante  el  cocultivo   crítica  de  los  informes  citados  y  sugirió  que  los  diversos  autores  
de  tejidos  de  arroz  con  Agrobacterium  tumefaclens. podrían  haber  pasado  por  alto  la  posibilidad  de  la  expresión  génica  
La  eficiencia  de  transformación  fue  similar  a  la  obtenida  por   de  Agrobacterium  adherida  a  tejidos  inoculados  y  a  las  plántulas  
los  métodos  utilizados  habitualmente  para  la  transformación   regeneradas  a  partir  de  ellos,  así  como  la  transformación  de  
de  dicotiledóneas  con  la  bacteria.  La  integración  estable,  la   microorganismos.  que  estaban  infectando  silenciosamente  los  tejidos  
expresión  y  la  herencia  de  los  genes  trans  se  demostraron   de  la  planta  huésped.  Potrykus  concluyó  que  no  había  evidencia  
mediante  análisis  moleculares  y  genéticos  de  los  formantes   inequívoca  de  transformación  estable  de  monocotiledóneas  con  
de  tren  en  las  generaciones  Ro,  R1  y  R2.  El  análisis  de   Agrobacterium.
secuencia  reveló  que  los  límites  del  T­DNA  en  las  plantas   Una  prueba  adecuada  de  tal  transformación  sería  una  demostración  de  
de  arroz  transgénicas  eran  esencialmente  idénticos  a  los  de   integración  aleatoria  de  transgenes  en  cromosomas  en  una  serie  de  
las  dicotiledóneas  transgénicas.  Los  callos  inducidos  a  partir   transformantes  independientes,  con  segregación  mendeliana  de  transgenes  
de  scutella  fueron  muy  buenos  materiales  de  partida.  Una   en  la  progenie.
cepa  de  A.  tumefaclens  que  portaba  un  vector  llamado   Recientemente,  Chan  et  al.  (1993)  obtuvieron  algunas  plantas  de  arroz  
'superbinario'  dio  frecuencias  especialmente  altas  de   transgénicas  mediante  la  inoculación  de  embriones  inmaduros  con  una  
transformación  de  varios  cultivares  de  arroz  japonica  que   cepa  de  A.  tumefaciens.  Probaron  la  herencia  del  ADN  transferido  a  la  
incluían  a  Koshihikari,  que  normalmente  muestra  respuestas   progenie  por  hibridación  Southern,  aunque  se  analizó  la  progenie  de  una  
deficientes  en  cultivo  de  tejidos. sola  planta.

Presentamos  ahora  más  pruebas  en  un  intento  de  resolver  la  

Introducción controversia.  Nuestra  evidencia  se  basa  en  estudios  moleculares  y  
genéticos  de  un  gran  número  de  plantas  de  arroz  transgénicas  y  el  análisis  
Los  métodos  para  la  transformación  de  plantas  superiores  empleando   de  uniones  T­DNA  en  arroz.  También  mostramos  que  el  cocultivo  de  callos,  
Agrobacterium  han  sido  bien  establecidos  para  especies  dicotiledóneas   derivados  de  scutella,  con  A.  tumefaciens  puede  producir  transformantes  
pero  no  para  especies  monocotiledóneas,  excepto  en  unos  pocos  casos   de  arroz  con  una  eficiencia  similar  a  la  de  la  transformación  en  dicotiledóneas.
(Bytebier  et  al.,  1987).  En  varios  laboratorios  se  ha  intentado  la  
transformación  de  plantas  en  Gramineae  con  Agrobacterium,  incluida  la  
infección  de  plantas  con  genomas  virales  mediada  por  Agrobacterium  
(Chan  et  al.,  1992,  1993;  Gould  et  al.,  1991;  Grimsley  et  al.,  1988;  Mooney  
RESULTADOS
et  al.,  1991;  Raineri  et  al.,  1990;  Schl~ppi  y  Hohn  1992;  Shen  et  al.,  1993).  
Rained  et  al.  (1990)  obtuvieron  células  de  arroz  transformadas  que  
Producción  de  plantas  que  expresan  GUS  resistentes  a  la  
expresaban  neomicina­fosfotransferasa  (NPT)  y  13­glucuronidasa
higromicina  a  partir  de  tejidos  de  arroz  inoculados  con  A.  tumefaciens

Varios  tejidos  de  arroz,  a  saber,  ápices  de  brotes  y  segmentos  de  raíces  
de  plántulas  jóvenes,  escutelos,  embriones  inmaduros,  callos  inducidos  a  

Recibido  el  4  de  enero  de  1994;  revisado  el  25  de  abril  de  1994;  aceptado  el  29  de  abril  de  1994. partir  de  raíces  jóvenes  y  escutelos,  y  células  en  cultivos  en  suspensión  
*Para  correspondencia  (fax  +81  538  32  8700). inducidos  a  partir  de  escutelos,  fueron

271
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11 272  Yukoh  Hiei  et  al.

Segmento  raíz
escutelo
embrión  inmaduro
Callo  de  raíz
(a)

(b)

Un  callo  de  la  concha
Células  de  suspensión  a
B

A  NOSOTROS
H  XB8

Figura  1.  Regiones  de  T­DNA  de  plG121Hm  (a)  y  pTOK233  (b).

3  

3  

3  

3  

3  

3
80  8  EB

0  
8  
66  
mentir

,
Enfermo  S  ~

TNOS

24  497  61

Se  contó  un  racimo  de  1­2  mm  de  diámetro  como  una  pieza  de  tejido.

cocultivado  con  A.  tumefaciens  EHA101(plG121Hm)
(Figura  1)  y  la  expresión  de  GUS  se  examinó  inmediatamente  (Figura  2a,  Tabla  
1).  Se  detectó  expresión  de  GUS  en  todos  los  tejidos  examinados  excepto  en  los  
segmentos  de  raíz.  Los  callos  derivados  de  scutella  dieron  la  proporción  más  alta  
de  tejido  que  expresaba  GUS  a  tejido  inoculado,  y  la  expresión  de  GUS  en  
embriones  inmaduros  se  observó  principalmente  en  scutella.
100  
89  
198  
115  
533  
247
S  BX~i

intrón
metro.

Nido

T
T358

(0)  
(9)  
(33)  
(21)  
(93)  
(25)
,~,Jo~
1Kb  _

0  
3

169  
22
cuerpo  eL
EA•

Abreviaturas:  BR,  borde  derecho;  BL,  borde  izquierdo;  NPTII,  neomicina  fosfotransferasa;  GUS,  ~­glucuronidasa;  HPT,  higromicina  fosfotransferasa;  NOS,  promotor  de  la  
nopalina  sintasa;  35S,  promotor  35S;  TNOS,  señal  3'  de  nopalina  sintasa;  T35S,  señal  3'  de  ARN  35S;  ORI,  origen  de  replicación  de  ColE1;  AmpR,  gen  de  resistencia  a  la  
ampicilina  activo  en  E.  coli;  B,  BamHI;  E,  EcoRI;  H,  Hindll;  S,  Vela;  Sc,  Sacl;  X,  Xbal.

Tabla  1.  Expresión  de  GUS  en  tejidos  de  arroz  (cv.  Tsukinohikari)  inmediatamente  después  del  cocultivo  con  A.  tumefaciens  EHA101  (piG121  Hm)  y  la  
recuperación  de  células  que  expresan  GUS  (GUS+),  resistentes  a  la  higromicina  (HygR)

Tejido

disparar  ápice
disparar  ápice
Duración  del  
cocultivo  (días)

2  

5  
Inmediatamente  
después  del  cocultivo

GUS+  Cocultivado  (%)

40  
69  
80  
77  
Número  de  piezas  de  tejido

(50)  
(90)  
producido

0
Después  de  3  
semanas  en  medio  selectivo

GUS+,  células  
HygR Co­cultivado  (%)

77

128  
51

743  
254
(0)

(0)  
(6)

(23)  
(9)

Los  callos  derivados  de  scutella  se  cocultivaron  con  cuatro  cepas  de  A.  
tumefaciens  y  luego  se  cultivaron  en  un  medio  selectivo.  LBA4404(pTOK233)  

(Figura  1)  proporcionó  la  mayor  frecuencia  de  piezas  de  callo  que  produjeron  
células  resistentes  a  la  higromicina  (Tabla  2).  La  superioridad  de  
LBA4404(pTOK233)  fue  especialmente  evidente  en  el  caso  del  cv.  Koshihikari.

La  mayoría  de  las  colonias  de  células  que  se  recuperaron  de  la
Se  cultivaron  tejidos  de  arroz  que  habían  sido  cocultivados  con  A.  tume   primera  ronda  de  selección  proliferó  en  el  segundo  medio  selectivo.  Las  plantas  
faciens  EHA101  (piG121  Hm)  en  medio  que  contenía  higromicina.  Se  observó   se  regeneraron  fácilmente  cuando  las  células  resistentes  se  transfirieron  a  un  
proliferación  de  células  en  el  medio  selectivo  en  el  caso  de  los  callos  inducidos  a   medio  de  regeneración  que  contenía  higromicina  (Figura  2d).  La  frecuencia  de  
partir  de  escutelos  (Figura  2b),  embriones  inmaduros  y  células  en  cultivo  en   regeneración  varió  del  50  al  80%  de  las  colonias  seleccionadas.
suspensión  (Tabla  1).  Los  callos  dieron  la  frecuencia  más  alta  (23  %;  169/743)  de  
piezas  de  tejido  que  produjeron  células  resistentes  a  la  higromicina.  Las  regiones   Se  obtuvieron  cientos  de  plantas  resistentes  a  la  higromicina  que  expresaron  
proliferantes  mostraron  evidencia  de  la  expresión  uniforme  de  GUS  (Figura  2c). actividad  GUS  de  forma  estable.  La  cepa  más  eficiente,  LBA4404(pTOK233),  
produjo  dichas  plantas  de  todos  los  cultivares  probados,  con  frecuencias  entre  
12,8
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11 Transformación  de  arroz  por  Agrobacterium

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11 274  Yukoh  Hiei  et  al.

Tabla  2.  Producción  de  células  resistentes  a  la  higromicina  (HygR)  que  expresan  GUS  (GUS+)  a  partir  de  callos  derivados  del  
escutelo  inoculados  con  cepas  vadas  de  A.  tumefaciens

cultivo  
de  arroz

tsukinohikari

Koshihikari

cultivo  
de  arroz

tsukinohikari

Asanohikari

Koshihikari
Experimento

1  

2  

3  

4  

5  6

1  2

1  

2  3

HygR,  resistente  a  la  higromicina.
GUS+,  GUS  positivo.
1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  8

1  

2  
3  4
~

64  
65  
45  
88

86  
77

74  
138  
215
3/262  (1)  
5/197  (3)  
2/177  (1)
Callos  que  produjeron  GUS+,  células  HygR /  

Tabla  3.  Eficiencia  de  transformación  de  arroz  por  A.  tumefaciens  LBA4404(pTOK233)

(A)  células  plantas

42  
112  
20  
35  
48  
29  
18  
24

19  
23

16  
34  
49
callos  inoculados  (%)

LBA4404  EHA101  LBA4404  EHA101
Experimento  (plG121Hm)  (plG121Hm)  (pTOK233)  (pTOK233)

10/521  (2)  141/540  (26)  22/605  (4)  56/187  (30)  114/324  
(35)  44/254  (17)  20/325  (6)  100/349(29)  3/  314  (1)  
91/338  (27)  139/301  (46)  159/305  (52)  59/421  (14)  
66/425  (16)  110/360  (31)  64/295  (22)  66/251  ( 26)  
108/263  (41)  30/260  (12)  63/436  (14)  172/394  (44)  
229/397  (58)  45/420  (11)  61/236  (26 )  65/241  (27)  65/143  (45)  27/219  (12)

6/269  (2)   7/271  (3)  65/283  (23)  18/310  (6)  
60/273(22)  11/176  (6)  34/138(25)  
16/140  (11)  49/215  (23)  3/  162  (2)

Número  de  callos  con  desprendimiento  de  escutelo

HygR  inoculado
Producido  Producido  GUS+
plantas  H3;gR

15  
19  
24  
23  
10'  
21

11  
17

13  
26  
40
producido
HygR  y

(B)

12  
15  
18  
13  
7  
16

11  
15

13  
26  
40
3/251  (1)

Frecuencia
(B/A,  %)

28,6  
13,4  
28,1  
20,0  
15,6  
18,2

12,8  
19,5

17,6  
18,8  
18,6

y  28,6%  en  relación  con  el  número  de  piezas  de  callos  derivados  del  escutelo  que   2e  y  f),  pero  ocasionalmente  se  observó  quimerismo  (quimeras  periclinales  y  
habían  sido  cocultivadas  con  células  bacterianas  (Cuadro  3). quimeras  en  forma  de  punto).

Muchas  de  las  células  resistentes  a  la  higromicina  mostraron  una  tinción  azul  
Caracterización  de  las  plantas  en  la  generación  Ro
uniforme  en  el  ensayo  histoquímico  para  GUS.  Sin  embargo,  algunas  de  las  
colonias  de  células  incluían  áreas  no  teñidas  que  sugerían  que  algunas  de  las   Se  cultivaron  plantas  que  expresan  GUS,  resistentes  a  la  higromicina,  en  un  
colonias  resistentes  a  la  higromicina  eran  quiméricas.  Los  ensayos  GUS  de   invernadero,  y  se  evaluaron  en  cuanto  a  ploidía,  morfología  y  fertilidad.  Un  total  de  
segmentos  de  hojas  o  raíces  de  plantas  regeneradas  dieron  como  resultado  una   103  plantas  (cv.  Tsukinohikari)  del  cocultivo  de  callos  derivados  del  escutelo  con  
tinción  azul  de  muestras  enteras  en  la  mayoría  de  los  casos  (Figura EHA101  (plG121Hm)  y  196  plantas  (93  del  cv.  Tsukino­
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11hikari  y  103  del  cv.  Koshihikari)  de  aquél  con  LBA4404  (pTOK233).  Todas  
las  plantas  eran  diploides,  como  lo  reveló  el  análisis  de  citometría  de  flujo  
(datos  no  mostrados),  y  ninguna  de  ellas  exhibió  aberraciones  morfológicas.  
En  cuanto  a  la  fertilidad,  por  el  contrario,  se  observaron  variaciones  
desde  la  esterilidad  completa  hasta  la  fertilidad  total.

Sin  embargo,  la  mayoría  (alrededor  del  70%)  de  los  transformantes  
produjeron  tantas  semillas  como  las  plantas  de  control  derivadas  de  
semillas  (Figura  2g).  La  progenie  de  transformantes  semifértiles  está  
ahora  bajo  evaluación  de  fertilidad,  y  los  datos  preliminares  indican  que  
son  totalmente  fértiles.
Las  plantas  que  expresan  GUS  resistentes  a  la  higromicina  se  
analizaron  mediante  hibridación  de  Southern.  Por  ejemplo,  el  ADN  de  29  
plantas  derivadas  de  20  colonias  independientes  de  células  resistentes  
del  cv.  Tsukinohikari,  que  se  produjo  mediante  el  cultivo  conjunto  de  
callos  derivados  del  escutelo  con  EHA101  (plG121Hm),  se  digirió  con  
Hindlll  y  se  permitió  que  hibridara  con  las  sondas  hpt  y  gus  (algunos  de  
los  datos  resultantes  se  muestran  en  la  Figura  3a  yb).  Dado  que  el  T­DNA  
de  plG121Hm  tiene  un  solo  sitio  HindIII  (Figura  1),  el  número  de  bandas  
de  hibridación  reflejaba  el  número  de  copias  de  genes  integrados  en  las  
plantas  a  menos  que  se  hubieran  integrado  repeticiones  de  múltiples  
copias  del  T­DNA.

La  mayoría  de  las  bandas  detectadas  representaban  fragmentos  de  más  
de  6,0  kb,  que  es  el  tamaño  mínimo  de  los  fragmentos  hibridantes  
esperados  del  mapa  de  plG121Hm  (Figura  1).  Las  plantas  regeneradas  a  
partir  de  una  colonia  dada  de  células  dieron  un  patrón  idéntico,  lo  que  
indica  que  estas  plantas  eran  clonales.  De  lo  contrario,  las  movilidades  de  
las  bandas  diferían  de  una  planta  a  otra.  El  número  de  copias  de  los  
genes  integrados  varió  de  uno  a  seis  (Tabla  4).  Varios
Transformación  de  arroz  por  Agrobacterium  275

las  plantas  dieron  señales  solo  con  la  sonda  hpt ,  algunas  otras  dieron  
señales  solo  con  la  sonda  gus ,  y  algunos  de  los  fragmentos  que  se  
hibridaron  con  la  sonda  gus  tenían  menos  de  6,0  kb  (datos  no  mostrados).  
Estos  fragmentos  de  ADN  inesperados  probablemente  se  produjeron  por  
reordenamiento  del  ADN  tras  la  transformación.

Herencia  de  los  genes  marcadores

La  progenie  autofecundada  se  evaluó  en  cuanto  a  resistencia  a  higromicina  
y  expresión  de  GUS.  Los  patrones  de  segregación  de  la  descendencia  
de  39  plantas  de  las  20  colonias  independientes  de  células  descritas  
anteriormente  se  muestran  en  la  Tabla  4.  Las  plántulas  resistentes  y  
sensibles  se  distinguieron  claramente  en  placas  de  agar  que  contenían  
higromicina  (Figura  2h),  y  una  proporción  de  segregación  de  Se  observó  
3:1  para  12  de  los  20  clones  independientes.  La  mayoría  de  la  progenie  
mostró  una  clara  segregación  de  plantas  GUS­positivas  y  GUS­negativas,  
y  los  números  estimados  de  loci  fueron  consistentes  con  los  estimados  
sobre  la  base  de  la  resistencia  a  la  higromicina.

El  número  estimado  de  loci  fue  menor  que  el  número  de  copias  de  los  
genes  que  se  midieron  mediante  el  análisis  de  Southern  en  algunas  
plantas.  Es  probable  que  más  de  dos  copias  de  genes  se  hayan  integrado  
cerca  una  de  la  otra  en  un  cromosoma  de  tal  planta.  Algunas  plantas  
mostraron  patrones  de  segregación  extraños  (plantas  11,  18a  y  196).  Por  
ejemplo,  el  número  de  plantas  resistentes  a  higromicina  fue  menor  que  el  
de  plantas  sensibles  en  la  progenie  de  la  planta  19e.  Las  plantas  que  
dieron  proporciones  de  segregación  inusuales  para  la  resistencia  a  la  
higromicina  dieron  resultados  similares  para  la  actividad  GUS.  Además,  
se  observaron  plantas  que  eran  quiméricas  para  la  actividad  GUS  entre  
dichas  plantas  (progenie  de  las  plantas  11,  18a  y  19e).

La  progenie  R1  de  las  plantas  lb,  3a,  8a,  9,  10c  y  12a,  que  dieron  
patrones  de  segregación  de  3:1  o  15:1  tanto  para  la  resistencia  a  la  
higromicina  como  para  la  expresión  de  GUS,  se  analizaron  mediante  
hibridación  Southern  (partes  de  los  datos  se  muestran  en  Figura  4).  Toda  
la  progenie  positiva  para  GUS,  resistente  a  la  higromicina,  generó  bandas  
que  se  hibridaron  con  las  sondas  hpt  y  gus ,  mientras  que  no  lo  hizo  toda  
la  progenie  sensible  y  negativa.

Figura  3.  Análisis  Southern  de  transformantes  (generación  Ro).
El  ADN  de  una  planta  no  transgénica  (C)  y  transformantes  (la  12b)  se   sensibles  al  fármaco  y  negativas  a  la  actividad  GUS.
digirió  con  HindIII,  se  fraccionó  mediante  electroforesis,  se  transfirió  a  una  
membrana  de  nailon  y  se  permitió  que  hibridara  con  la  sonda  hpt  (a)  o  gus  
( b ) .
También  se  observó  una  clara  segregación  mendeliana  para  la  
resistencia  a  la  higromicina  y  para  la  expresión  de  GUS  en  la  progenie  R2  
de  las  plantas  la,  3a,  8a,  9,  10c  y  12a.  Por  ejemplo,  la  progenie  a  2  de  dos  
tercios  de  las  plantas  R1  positivas  para  GUS  resistentes  a  higromicina  
de  la  planta  10c  eran  plantas  positivas  para  GUS  resistentes  a  higromicina  
y  plantas  negativas  para  GUS  sensibles  a  higromicina  en  una  proporción  
de  3:1.  La  progenie  R2  del  tercio  restante  era  exclusivamente  resistente  a  
la  higromicina  y  positiva  para  GUS.  La  progenie  R2  de  las  plantas  R1  
negativas  a  GUS  y  sensibles  a  la  higromicina  de  la  planta  10c  eran  todas  
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11 276  Yukoh  Hiei  et  al.

Tabla  4.  Estimación  del  número  de  copias  de  transgenes  en  los  transformantes  producidos  por  EHA101  (piG121Hm)  y  patrones  de  segregación  para  
resistencia  a  higromicina  y  expresión  de  GUS  en  la  progenie

Transformando  a

1  un

lb  

2  
3a  
3b  
4a  

4b  5  6a
6b
6c  
7a  
7b  
8a  
8b  
9  
10a  
10b
10c  
11  
12a  
12b  
13  
14  
15  
16a  
16b  
16c  
16d
17a
17b  
18a  
18b  
19a  
19b  
19c  
19d  
19e  
20
HPT  GUS

2
2
1
NT  

4  2
NT  
4
NT  

6  

2
1  

1  

2  

4  

1  2  2
Número  
de  copia  

generación  R0
en  la  

Nuevo  Testamento

NT  

2  

2  

1  

1  2  2

2
2

Nuevo  Testamento

Nuevo  Testamento

Nuevo  

Testamento  3  3  3  3  3

2
Nuevo  Testamento

NT  
1
NT  

6  2
NT  
5
NT  
2
1
Nuevo  Testamento

NT  

2  

2  

1  

1
1  2  1

6  

1  

1  

2  

4  1  2  2

Nuevo  Testamento

Nuevo  Testamento

1
NT  

3  

3  

2  

2  

Nuevo  Testamento

NT  
2
Número  de  

plantas  en

37
Resistencia  a  la  
higromicina

Número  de  generación  R1

58  22  42  18  
48  22  28  2  
29  1  27  3  39  
1  30  0  46  4

38  2  42  18  
32  8  76  24  
36  14  23  7  
36  14  32  8

72  28  89  41  
40  10  70  20  
47  13  30  10  
54  26  42  18  
31  9  21  9  9

31
45
40  0  29  21  
48  12  26  14  
36  14  31  9  
27  13

8  32
47  13
3

5
loci

1  
1  1  

2
2  
2­3  
1­2  

1
1  

1  

1  

1  

1  

1  

1  

1  

2­3?  

1  
de  

2­3  2­3  2
2
2­3  1  1  

1  

1  1  1

1  1  1

1
?  

1
+  C

15  
14  
13  
18  
19  
18  
20  
19  
14
15
2  
17  
13  
15  
15  
15  
17
dieciséis

14

16  
15  
15  
15  
15  
14

15
17
15

17  
17  
17

15  
expresión  GUS

Número  de  

plantas  en
Número  de  generación  R1

6  2  14  4  15  13  

7  6  16  

0  13
dieciséis
­

5  6
7  

2  

1  

2  

0  1

6
5
8  

3  

7  

5  

5  

5  

3  

5  

7  

4  

5  

5  

5  

5  

6  

3
5  

7  

4  

3  

3  

3  

5  

4
loci

1?  

1  

1  

1  

1  

1  

1  

1  

1
1­2
de  

1  1  
1  
1­2  
2  1­2  
2­3  
2­3  1
1

1  1­2  

1  1  1  1  1­2

1?  1  
1­2  
1­2  1­2
1
?  

a  Los  transformantes  con  designaciones  que  difieren  solo  en  las  letras  del  alfabeto  se  regeneraron  a  partir  de  una  sola  colonia  de  células.

R,  resistente;  S,  susceptible;  C,  quimera;  NT,  no  probado.
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11Figura  4.  Análisis  de  Southern  de  la  progenie  R1  de  los  transformantes  3a,  9  y  12a.

El  ADN  de  los  transformantes  Ro  (0),  la  progenie  R1  resistente  a  la  higromicina  y  GUS  
positiva  (1,  2,  5  y  6)  y  la  progenie  R1  sensible  a  la  higromicina  y  GUS  negativa  (3  y  4)  se  
digirió  con  Hind,  I,  se  fraccionó  por  electroforesis,  se  transfirió  a  una  membrana  de  nailon  
y  se  dejó  hibridar  con  la  sonda  hpt  (a)  o  gus  (b).

Análisis  de  los  límites  del  T­DNA

Las  regiones  de  unión  entre  el  ADN  genómico  de  arroz  y  el  ADN­T  
se  amplificaron  a  partir  de  transformantes  selectivos  y  se  
determinaron  las  secuencias  de  nucleótidos.  Las  secuencias  de  
tres  límites  derechos  y  cinco  límites  izquierdos  del  arroz  que  había  
sido  transformado  con  la  cepa  EHA101  (piG121Hm)  se  muestran  
en  la  Figura  5  junto  con  la  secuencia  de  los  bordes  T­DNA  de  
pTiT37  (Yadav  et  al,  1982;  Zambryski  et  al ,  1982),  que  es  la  fuente  
de  los  bordes  de  T­DNA  en  plG121Hm.  uno  de  los  correctos

Límite  derecho

pTiT37  
tabaco  arroz  
11  arroz  12a

arroz  30
ADN­T
Transformación  de  arroz  por  Agrobacterium  277

los  límites  correspondían  precisamente  al  sitio  encontrado  en  los  
transformantes  del  tabaco  (Yadav  et  al.,  1982;  Zambryski  et  al.,  
1982).  Las  otras  dos  uniones  derechas  tenían  dos  bases  más  que  
podrían  haberse  originado  a  partir  de  T­DNA.  Los  cinco  límites  
izquierdos  estaban  en  la  región  repetida  de  25  pb  como  los  límites  
izquierdos  que  se  encuentran  en  los  transformantes  de  tabaco.

Discusión
Las  ventajas  de  la  transferencia  de  genes  mediada  por  
Agrobacterium  sobre  otros  métodos  que  pueden  usarse  para  la  
transformación  de  plantas  superiores  incluyen  la  alta  eficiencia  de  
transformación,  la  transferencia  de  fragmentos  de  ADN  con  
extremos  definidos,  la  transferencia  de  segmentos  relativamente  
grandes  de  ADN  y  la  ausencia  de  un  requisito  para  las  técnicas  de  
cultivo  de  protoplastos.  Por  lo  tanto,  este  tipo  de  transferencia  de  
genes  es  normalmente  el  método  de  elección  cuando  se  utiliza  más  de  un  método
está  disponible.  La  capacidad  de  Agrobacterium  para  transformar  
monocotiledóneas  ha  sido  objeto  de  un  serio  debate  durante  
algún  tiempo,  ya  que  estas  plantas  no  son  huéspedes  naturales  
de  esta  bacteria.  La  controversia  ahora  parece  estar  resuelta,  al  
menos  para  el  arroz,  ya  que  el  presente  estudio  y  el  de  Chan  et  al.  
(1993)  han  demostrado  claramente  la  integración  estable  de  ADN  
extraño  en  cromosomas  de  arroz  en  un  proceso  mediado  por  A.  
tumefaciens,  así  como  la  transmisión  mendeliana  del  ADN  a  la  
progenie.  Obtuvimos  cientos  de  transformantes  independientes  de  
tres  cultivares  de  arroz  japónica  y  se  caracterizaron  en  detalle  más  
de  20  plantas.

Varios  factores  afectaron  la  eficiencia  de  la  transformación.  La  
optimización  de  las  condiciones  de  cultivo  de  tejidos  y  de  las  
condiciones  de  co­cultivo  fue  de  una  importancia  crítica.  La  
composición  del  medio  fue  especialmente  importante  para  el  
cultivar  koshihikari,  que  generalmente

repetición  de  borde  derecho  de  25  pb

­­TKAKCT&TCAGTGTTTGACAGGATAT&TTGGCGGGTAAACCTAAGAGAIKAAG&GCGTTTA­­  ­­TKAACTATCAGT~­­  ­­
T&PJ~CT&TC&GTGTTTC.~Igctcctcctcctctgtcgcc­­  ­­
T&&&CT&TCRGTGTTTGRtctggtctttttcctttgtt­­  ­­
TAAACT&TCXGTgTTTaaagaggaataaaa  aaatta­­
fuera  de  T­ADN

Límite  izquierdo ADN­T repetición  del  borde  izquierdo  de  25  pb fuera  de  T­ADN

pTiT37   ­­TAAGCGTCAATTTGTTTACACCACAAT&TATCCTGCCACCAGCCAGCCAACAGCTCCCC­­
rlce  2   ­­TAAGCGTCAATTTGTTT&CACCACAATATAgcgaaatattaagtgcgccg­­
arroz  10a   ­­TAAGCGTCAATTTGTTTACACCAgtgagacgggcaacagctgat­­
arroz  ii*  arroz   ­­TAAGCGTCAATTTGTTTACccccatccacgttccgattt­­
ii*  arroz  12a ­­TAAGCGTCAATTTGTTTACACCKCAATATAgcagagctaattattatggagta­­
­­TAAGCGTCKATTTGTTT&CACCKCAAT&T&TCCaacgtcaaagggcgatttat­­
Figura  5.  Análisis  de  secuencia  de  uniones  de  ADN  T­DNNplant.
Las  secuencias  de  las  uniones  que  se  encuentran  en  los  transformantes  de  arroz  selectivos  se  muestran  debajo  de  las  secuencias  de  los  bordes  de  T­DNA  de  pTiT37.  Las  secuencias  
supuestamente  originadas  a  partir  del  ADN  genómico  del  arroz  se  muestran  en  minúsculas,  y  las  bases  que  podrían  originarse  a  partir  del  ADN  genómico  del  arroz  o  del  T­DNA  se  muestran  en  cursiva.
Se  muestra  una  secuencia  de  consenso  para  uniones  derechas  en  transformantes  de  tabaco  entre  las  secuencias  de  pTiT37  y  arroz.  'n'  representa  cualquier  nucleótido.
*La  planta  de  arroz  11  tenía  múltiples  copias  de  T­DNA  y  se  determinaron  las  secuencias  de  dos  límites  izquierdos.
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11 278  Yukoh  Hiei  et  al.

Tabla  5.  Medios  para  cultivo  de  tejidos  de  arroz

Medio

Mmm

N6F

N6F­H

N6S3

N6S3­AS

N6S3­CH

N6­7­SÓLO

N6­7K­CH

2N6

2N6L

2N6­AS

2N6­CH

2N6K­CH
Composición

Sales  AA  y  aminoácidos  (Toriyama  y  Hinata,  1985),  vitaminas  MS  (Murashige  y  Skoog  1962),  500  mg  1­1  casaminoácidos,  68,5  g  I­+  
sacarosa,  36  g  1­1  glucosa,  100  llM  de  acetosiringona,  pH  5,2 .

Sales  principales  N6,  sales  menores  N6  y  vitaminas  N6  (Chu  1978),  sacarosa  20  g  1­1,  2  g  1­1  Gelrite  (Merck),  pH  5,8.

Medio  N6F  más  70  mg  1­1  de  higromicina.

Sales  principales  N6  de  concentración  media,  sales  menores  N6,  vitaminas  N6,  aminoácidos  AA,  1  g  I  ­  +  casaminoácido,  20  g  1­1  sacarosa,  
0,2  mg  1­1  ácido  naftalenoacético,  1  mg  1­1  kinetina,  3  g  1­1  Gelrita,  pH  5,8.

Medio  N6S3  más  10  g  de  glucosa  1­1  y  acetosiringona  100  pM,  pH  5,2.

Medio  N6S3  más  250  mg  1­1  de  cefotaxima  y  50  mg  1­1  de  higromicina.

Sales  principales  N6,  sales  menores  N6,  vitaminas  N6,  2  g  1­1  casaminoácido,  20  g  1­1  sacarosa,  30  g  1­1  sorbitol,  1  mg  1­1  2,4­D,  0,5  mg  
1­1  6  ­benciladenina,  100  mg  1­1  higromicina,  250  mg  1­1  cefotaxima,  2  g  1­1  Gelrite,  pH  5,8.

Sales  principales  N6  de  concentración  media,  sales  menores  N6,  vitaminas  N6,  2  g  1­1  casaminoácidos,  200  ml  1­1  extracto  de  patata  a,  20  
g  1­1  sacarosa,  30  g  1­1  sorbitol,  1  mg  1­1  2,4­D,  0,5  mg  1­1  6­benciladenina,  100  mg  1­1  higromicina,  250  mg  1­1  cefotaxima,  2  g  1­1  Gelrite,  
pH  5,8.

Sales  mayores  N6,  sales  menores  N6,  vitaminas  N6,  1  g  1­1  casaminoácidos,  30  g  1­1  sacarosa,  2  mg  1­1  2,4­D,  2  g  1­1  Gelrite,  pH  5,8.

Medio  2N6  sin  Gelrite.

Medio  2N6  más  10  g  de  glucosa  1­1  y  acetosiringona  100  µM,  pH  5,2.

Medio  2N6  más  250  mg  1­1  de  cefotaxima  y  50  mg  1­1  de  higromicina.

Sales  principales  N6  de  potencia  media,  sales  menores  N6,  vitaminas  N6,  1  g  1­1  casaminoácidos,  200  ml  1­1  extracto  de  patata,  30  g  1­1  
sacarosa,  2  mg  I  ­I  2,4­D,  250  mg  1­1  cefotaxima,  50  mg  1­1  higromicina,  2  g  1­1  Gelrite,  pH  5,8.

El  extracto  de  patata  se  preparó  como  sigue:  200  g  de  tubérculos  de  patata  se  pelaron,  se  cortaron  en  trozos  de  1­2  cm  3 ,  se  mezclaron  con  1  litro  de  agua  y  se  
esterilizaron  en  autoclave  a  120°C  durante  10  min.  Luego  se  añadió  el  sobrenadante  a  los  medios  como  se  indica.

muestra  pobres  respuestas  en  cultivo  de  tejidos,  durante  la  etapa  preliminar  
de  este  estudio.  Dado  que  muchos  cultivares  de  arroz  japónica  de  alta  calidad  
están  relacionados  con  Koshihikari,  los  métodos  descritos  aquí  deberían  ser  
muy  útiles  en  el  cultivo  de  arroz.  Las  variables  importantes  relacionadas  con  
las  condiciones  de  cocultivo  incluyen  la  adición  de  acetosiringona  al  medio  y  
una  temperatura  entre  22°C  y  28°C;  la  transformación  no  tuvo  éxito  cuando  se  
omitió  la  acetosiringona  o  se  llevó  a  cabo  el  co­cultivo  a  un  tem

temperatura  más  alta  o  más  baja  que  ese  rango  (datos  no  mostrados).  Aunque  
Chan  et  al  (1993)  indicaron  que  era  esencial  agregar  medio  de  un  cultivo  en  
suspensión  de  células  de  patata  al  medio  de  cocultivo,  nuestros  métodos  no  
requerían  tales  adiciones.
se  expresa  en  células  de  arroz  pero  no  en  células  de  A.  tumefaciens  que  se  
adhieren  a  los  tejidos.  Se  observó  expresión  temprana  de  GUS  en  tejidos  que  
incluían  ápices  de  brotes  y  embriones  inmaduros,  tejidos  que  se  transformaron  
con  éxito  en  estudios  previos  (Chan  et  al.,  1993;  Gould  et  al.,  1991;  Raineri  et  
al.,  1990).  Sin  embargo,  solo  se  obtuvieron  unos  pocos  transformantes  de  
embriones  inmaduros  y  ninguno  se  obtuvo  de  ápices  de  brotes.  Los  resultados  
de  este  estudio  indican  claramente  que  los  cultivos  de  callos  iniciados  a  partir  
de  escutelas  son  excelentes  materiales  para  la  transformación  del  arroz.

por  Agrobacterium.
Los  patrones  generados  por  la  hibridación  Southern  diferían  entre  nuestros  
transformantes,  lo  que  indica  claramente  que  los  ADN­T  se  integraron  al  azar  
en  el  genoma  del  arroz.
La  elección  de  los  tejidos  como  material  de  partida  fue  uno  de  los  factores   Los  fragmentos  de  ADN  que  se  hibridaron  con  las  sondas  hpt  y  gus  claramente  
más  importantes.  Se  seleccionaron  varios  tejidos  para  determinar  sus   no  se  originaron  a  partir  de  la  contaminación  de  A.  tumefaciens  utilizada  en  la  
respuestas  al  cocultivo  con  A.  tumefaciens.  La  expresión  de  GUS  en  los  tejidos   transformación  porque  la
inmediatamente  después  de  la  infección  ofreció  una  buena  indicación  de  los   los  vectores  en  las  cepas  empleadas  habrían  dado  bandas  de  fragmentos  de  
tejidos  preferibles.  No  fue  necesario  el  pretratamiento  de  los  tejidos,  por   tamaños  definidos,  por  ejemplo,  una  banda  de  15  kb  de  plG121Hm,  en  el  
ejemplo,  mediante  herida  o  digestión  enzimática  de  las  paredes  celulares.   análisis.  Ocasionalmente  se  observó  reordenamiento  del  ADN,  por  ejemplo,  
Dichos  pretratamientos  resultaron  ser  esenciales  en  otros  estudios  (Chan  et   eliminación  de  parte  del  ADN­T,  como  también  es  el  caso  en  la  transferencia  
al,  1993;  Moony  et  al,  1991;  Raineri  et  al,  1990).  El  intron­gus  (Ohta  et  al,  1990)   de  genes  mediada  por  Agrobacterium  en  dicotiledóneas  (Deroles  y  Gardner,  
fue  un  gen  marcador  conveniente  ya  que  este  gen  es  fuertemente 1988;  Komari,  1989,  1990a).

El  análisis  genético  de  la  progenie  R1  y  2  también  produce
Machine Translated by Google

11vided  evidencia  concluyente  de  la  incorporación  de  T­DNA  en  los  cromosomas  
de  arroz.  La  resistencia  a  la  higromicina  y  la  expresión  de  GUS  fueron  
heredadas  por  la  descendencia  R1  y  R2  de  manera  mendeliana,  y  los  datos  
del  análisis  de  Southern  de  la  generación  R1  respaldaron  los  datos  genéticos.  
La  progenie  de  un  número  limitado  de  transformantes  mostró  patrones  
inusuales  de  segregación.  Dado  que  estas  líneas  incluían  plantas  que  eran  
quiméricas  para  la  expresión  de  GUS,  parecía  que  el  quimerismo  en  la  
generación  R0  afectaba  a  las  proporciones  de  segregación.  El  quimerismo  en  
transformantes  producidos  por  A.  tumefaciens  también  ha  sido  reportado  en  
tabaco  (Schm­Jlling  y  Schell,  1993)  pero  no  ha  sido  un  factor  limitante  en  la  
aplicación  de  la  técnica.

El  análisis  de  la  secuencia  de  las  uniones  entre  el  T­DNA  y  el  ADN  vegetal  
en  los  transformantes  de  arroz  reveló  que  los  límites  del  T­DNA  en  el  arroz  
eran  esencialmente  los  mismos  que  en  las  dicotiledóneas  (Yadav  et  al.,  1982;  
Zambryski  et  al. ,  1982 ) .  Esta  evidencia  brinda  más  apoyo  a  la  hipótesis  de  
que  los  T­DNA  se  transfieren  de  Agrobacterium  a  plantas  dicotiledóneas  y  
monocotiledóneas  mediante  un  mecanismo  molecular  idéntico.

El  rendimiento  de  las  denominadas  cepas  "supervirulentas"  de  A.  
tumefaciens  se  ha  destacado  en  informes  anteriores  (Chan  et  al,  1993;  Gould  
et  al,  1991;  Raineri  et  al,  1990),  así  como  en  este  estudio.  Dado  que  se  
informó  que  las  cepas  que  portaban  pTiBo542,  un  plásmido  Ti  'supervirulento',  
operaban  de  manera  muy  eficiente  en  la  transformación  (Jin  et  al.,  1987;  
Komari,  1989),  se  han  desarrollado  dos  nuevos  tipos  de  sistemas  basados  en  
pTiBo542.  La  primera  implica  la  cepa  EHA101  (Hood  et  al,  1986),  que  lleva  
una  versión  'desarmada'  de  pTiBo542,  y  esta  cepa  ha  sido  popular  en  ensayos  
destinados  a  la  transformación  de  monocotiledóneas.  El  segundo  implica  lo  
que  se  conoce  como  vector  'superbinario',  en  el  que  un  fragmento  de  ADN  de  
la  región  de  virulencia  de  pTiBo542  se  introduce  en  un  pequeño  plásmido  
portador  de  ADN­T  (Komari,  1990b)  utilizado  en  un  sistema  de  vector  binario  
( An  et  al,  1988;  Hoekema  et  al,  1983).  En  este  estudio,  probamos  
combinaciones  de  dos  cepas  y  dos  vectores.  Las  cepas  eran  una  cepa  
"ordinaria"  LBA4404  (Hoekema  et  al.,  1983)  y  una  cepa  "supervirulenta"  
EHA101.  Los  vectores  eran  plG121Hm,  un  derivado  del  vector  binario  "normal"  
pBIN19  (Bevan,  1984),  y  pTOK233,  un  derivado  de  un  vector  pTOK162  

"superbinario" (Komari,  1990b).
Transformación  de  arroz  por  Agrobacterium  279

cultivo,  mientras  que  la  elección  de  vectores  y  cepas  es  importante  para  la  
transformación  de  cultivares  'difíciles'.  Dado  que  LBA4404(pTOK233)  
transformó  los  dos  tipos  de  cultivo  con  la  misma  eficacia,  las  cepas  como  
LBA4404(pTOK233)  serán  muy  útiles  en  la  ingeniería  genética  del  arroz.  
Incluso  tenemos  datos  preliminares  que  sugieren  que  LBA4404  (pTOK233)  
también  podría  transformar  cultivares  de  arroz  índica.

Hemos  desarrollado  un  método  para  la  producción  consistente  de  
transformantes  estables  de  arroz  de  tres  cultivares.

a  frecuencias  entre  10  y  30%  usando  callos  derivados  de  escutelo  inoculados  
con  A.  tumefaciens.  Fue  fácil  producir  más  de  20  transformantes  independientes  
en  una  sola  serie  de  experimentos  sin  manipulaciones  complicadas  en  el  
cultivo  de  tejidos.  La  eficacia  del  método  parece  similar  a  la  de  la  
transformación  de  ledones  de  dicotiledóneas  con  la  bacteria.  Además,  la  
mayoría  de  las  plantas  producidas  por  este  método  estaban  libres  de  
aberraciones  morfológicas,  probablemente  como  resultado  del  hecho  de  que  
las  células  se  mantuvieron  en  cultivo  in  vitro  durante  un  corto  período  de  
tiempo.

tiempo,  aproximadamente  4  meses  desde  la  iniciación  del  callo  hasta  la  
transferencia  de  regenerantes  al  suelo,  en  comparación  con  los  métodos  
mediados  por  protoplastos,  que  requieren  al  menos  6  meses.  Por  lo  tanto,  la  
transferencia  de  genes  mediada  por  Agrobacterium  ahora  está  disponible  
como  un  método  sencillo  y  rutinario  para  la  modificación  genética  del  arroz.

Procedimientos  experimentales

Cultivares  de  arroz  y  medios  de  cultivo

En  la  transformación  se  utilizaron  cultivares  de  arroz  japonica,  a  saber,  Oryza  
sativa  L.  Tsukinohikari,  Asanohikari  y  Koshihikari.  Los  medios  utilizados  para  
el  cultivo  de  tejidos  se  enumeran  en  la  Tabla  5.

Ápices  de  brotes,  raíces  y  ca/li  derivados  de  raíces

Las  semillas  maduras  se  descascararon,  se  esterilizaron  con  etanol  al  70  %  
durante  1  min  y  luego  con  NaCl  al  1,5  %  (p/v)  durante  30  min.  Se  enjuagaron  
minuciosamente  con  agua  estéril  y  se  dejaron  germinar  en  medio  N6F  a  25°C  
en  oscuridad  durante  3  días.  Se  cortaron  segmentos  de  0,5  mm  x  1  carnero,  
consistentes  en  ápices  de  brotes  más  dos  o  tres  hojas,  y  segmentos  (5­10  
mm  de  longitud)  de  raíces  de  las  semillas  en  germinación  y  se  usaron  para  
experimentos  de  transformación.
Los  callos  se  indujeron  cultivando  algunos  de  los  segmentos  de  la  raíz  en  
medio  2N6  a  30°C  en  la  oscuridad  durante  3  semanas.  Se  utilizaron  piezas  
de  callos  en  crecimiento  activo  (de  aproximadamente  1  mm  de  diámetro)  
para  experimentos  de  transformación.
En  los  experimentos  de  transformación,  LBA4404  (pTOK233)  fue  
ligeramente  más  efectivo  que  LBA4404  (plG  121  Hm)  y  EHA101  (plG121Hm)  
Scutella,  callos  derivados  de  scutella  y  cultivos  en  suspensión
con  cv.  Tsukinohikari  y  definitivamente  fue  el  más  efectivo  con  cv.  Koshihikari.

Contrariamente  a  nuestras  expectativas,  EHA101  (pTOK233),  por  razones   Las  semillas  maduras,  descascarilladas  y  esterilizadas  como  se  describe  
desconocidas,  no  fue  muy  eficaz  para  la  transformación  del  arroz.  Estos  datos   anteriormente,  se  cultivaron  en  medio  2N6  a  30°C  en  la  oscuridad.  Después  
de  5  días,  se  extirparon  escutellas  de  algunas  de  las  semillas  y  se  usaron  para  
sugieren  que  una  combinación  vector/cepa  'ordinaria'  es  similar  a  las  
experimentos  de  transformación.  Después  de  3  semanas,  los  callos  proliferados  
combinaciones  mejoradas  en  la  transformación  de  cultivares  que  son  'fáciles'  
derivados  de  la  escutella  de  las  semillas  restantes  se  subcultivaron  en  medio  
de  cultivar  en  tejido. 2N6  fresco  durante  4  días.  Pedazos  de  callos  en  crecimiento  activo
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11280  Yukoh  Hiei  et  al.

(1­2  mm  de  diámetro)  se  utilizaron  para  experimentos  de  transformación.
Se  suspendieron  trozos  de  callos  derivados  de  scutella  en  medio  2N6L  y  se  
cultivaron  en  un  agitador  rotatorio  (125  rpm)  a  25°C  en  la  oscuridad.  El  medio  se  
cambió  cada  7  días.  Se  usaron  células  en  la  fase  logarítmica  de  crecimiento  (4  
días  después  del  tercer  o  cuarto  subcultivo)  para  experimentos  de  transformación.

embriones  inmaduros

Las  semillas  en  desarrollo  se  recogieron  10  días  después  de  la  antesis,  se  
descascararon  y  se  esterilizaron  con  etanol  al  70  %  y  NaCl  al  1,5  %.  Luego  se  
extirparon  asépticamente  embriones  inmaduros  (de  aproximadamente  1  mm  de  
longitud)  y  se  usaron  para  experimentos  de  transformación.

Bacterias/cepas  y  plásmidos

Las  cepas  de  Agrobacterium  tumefaciens  LBA4404  (Hoekema  et  al.,  1983)  y  
EHA101  (Hood  et  al.,  1986)  se  han  descrito  previamente.  Los  plásmidos  se  
introdujeron  en  estas  cepas  mediante  electroporación  (Sambrook  et  al.,  1989).  
A.  tumefaciens  se  cultivó  en  medio  AB  (Chilton  et  al,  1974)  a  28°C.

Ohta  et  al  (1990)  construyeron  un  gen  para  GUS,  que  tiene  un  intrón  en  la  
región  N­terminal  de  la  secuencia  codificante  y  está  conectado  al  promotor  35S  
del  virus  del  mosaico  de  la  coliflor.
Este  gen  informador  intron­gus  expresa  actividad  GUS  en  células  vegetales  pero  
no  en  las  células  de  A.  tumefaciens  (Ohta  et  al.,  1990).  plG121Hm  (Figura  1)  es  
un  vector  binario  que  contiene  un  gen  de  resistencia  a  la  kanamicina  (npt),  un  
gen  de  resistencia  a  la  higromicina  (hpt)  y  el  intron­gus  en  la  región  T­DNA,  
plG121Hm  se  introdujo  en  LBA4404  y  EHA101.

piG221  (Ohta  et  al.,  1990)  se  digirió  con  EcoRI,  se  trató  con  ADN  polimerasa  
de  T4  y  se  circularizó  con  un  enlazador  HindIII  (5'­CAAGCTTG­3').  El  plásmido  
resultante  se  digirió  con  HindIII  y  el  fragmento  de  3,1  kb,  que  contenía  el  intron­
gus,  se  insertó  en  el  sitio  HindIII  de  pGL2,  un  derivado  de  pUC18  (Yanisch­
Perron,  et  al.,  1985)  que  contenía  hpt,  para  generar  pGL2­1G,  pTOK162  (Komari,  
1990b),  un  vector  binario  que  contenía  virB  y  virG  del  plásmido  Ti  pTiBo542,  se  
introdujo  en  LBA4404  y  EHA101.  Posteriormente  se  introdujo  pGL2­1G  en  
LBA4404  (pTOK162)  y  EHA101  (pTOK162).  Las  cepas  resultantes  contenían  
una  forma  cointegrada  de  pTOK162  y  pGL2­1G  generada  por  recombinación  
homóloga.  La  forma  cointegrada  se  denomina  pTOK233  (Figura  1).  Por  tanto,  
pTOK233  contenía  npt,  hpt  e  intron­gus  en  la  región  T­DNA  al  igual  que  piG121Hm.

Transformación

Las  cepas  de  A.  tumefaciens  LBA4404  (plG  121Hm),  EHA101  (piG121Hm),  
CH  (ápices  de  brotes)  o  2N6K­CH  (todos  los  tejidos  de  Koshihikari)  y  cultivados  
durante  3  semanas.  Las  colonias  de  células  que  habían  proliferado  en  el  primer  
medio  de  selección  se  escindieron  y  se  cultivaron  en  medio  N6­7­CH  (tejidos  de  
Asanohikari  y  Tsukinohikari)  o  N6­7K­CH  (tejidos  de  Koshihikari)  durante  10  
días.  Las  colonias  de  células  que  habían  proliferado  se  sembraron  en  un  medio  
de  regeneración,  N6S3­CH,  y  se  incubaron  a  25°C  bajo  iluminación  continua  
(alrededor  de  2000  lux).  Las  plantas  regeneradas  (generación  Ro)  finalmente  se  
transfirieron  al  suelo  en  macetas  y  se  cultivaron  hasta  la  madurez  en  un  
invernadero.

Prueba  de  la  progenie  para  la  resistencia  a  la  higromicina

Semillas  autofecundadas  (generaciones  R1  y  R2 )  de  transformantes  se  
sembraron  en  medio  N6F  y,  2  ó  3  días  después,  las  semillas  se  transfirieron  a  
medio  N6F­H  y  se  cultivaron  bajo  iluminación  continua  a  25°C.  La  resistencia  a  
los  medicamentos  se  calificó  7  días  después  de  la  transferencia;  los  brotes  y  las  
raíces  de  las  plántulas  resistentes  crecieron  normalmente  en  el  medio  de  
selección.

Ensayo  de  actividad  GUS

La  expresión  de  GUS  en  células  de  arroz  se  ensayó  esencialmente  como  
describen  Rueb  et  al  (1989)  con  glucurónido  de  5­bromo­4­cloro­3­indolilo  (X­
Gluc)  como  sustrato.  Se  incubaron  segmentos  de  tejidos  de  arroz  en  tampón  de  
fosfato  (NaPO4  50  mM,  pH  6,8)  que  contenía  Triton  X­100  al  1  %  a  37  °C  durante  
1  h.  Se  eliminó  el  tampón  y  se  añadió  a  los  segmentos  tampón  de  fosfato  nuevo  
que  contenía  X­Gluc  1,0  mM  y  metanol  al  20%.  La  mezcla  de  reacción  se  colocó  
bajo  un  vacío  suave  durante  5  min,  se  incubó  durante  la  noche  a  37  °C  y  luego  
los  tejidos  se  examinaron  visualmente.

Las  células  que  expresaban  GUS  eran  de  color  azul  oscuro.  Los  segmentos  de  
hojas  se  lavaron  dos  veces  en  metanol  al  99  %  durante  2  h  antes  del  examen  
visual.

Aislamiento  de  ADN  e  hibridación  Southern

El  ADN  se  extrajo  de  los  tejidos  de  las  hojas  mediante  el  procedimiento  descrito  
por  Komari  et  al.  (1989).  El  ADN  (5­20  l/g)  se  digirió  con  HindIII  y  se  fraccionó  en  
un  gel  de  agarosa  al  0,65  %  mediante  electroforesis  a  1,5  V  cm  ^{­}  durante  15  
h.  La  hibridación  Southern  se  llevó  a  cabo  como  describen  Sambrook  et  al.  
(1989).  La  sonda  para  hpt  fue  el  fragmento  BamHI  de  1,1  kb  de  pGL2­1G  y  la  
sonda  gus  fue  el  fragmento  Sall­Sacl  de  1,9  kb  de  pGL2­1G.

Secuenciación  de  regiones  fronterizas  del  T­DNA  insertado

Las  regiones  de  unión  del  ADN­T  introducido  y  el  ADN  genómico  del  arroz  se  
LBA4404  (pTOK233)  y  EHA101  (pTOK233)  se  cultivaron  durante  3  días  en   analizaron  utilizando  reacciones  en  cadena  de  potimerasa  (PCR)  mediadas  por  
medio  AB  suplementado  con  50  mg  1­1  de  higromicina  y  50  mg  1­1  de   ligación  de  cassettes,  como  se  describe  por  Isegawa  et  al.  (1992).
kanamicina.  Las  bacterias  se  recogieron  con  una  cuchara  pequeña  y  se   El  casete  y  los  cebadores  de  casete  se  adquirieron  de  Takara  (Kyoto,  Japón).
suspendieron  a  una  densidad  de  3­5  ×  10  9  células  ml  ­~  en  medio  AAM.
El  ADN  aislado  de  los  transformantes  se  digirió  con  Mbol  y  se  ligó  a  un  casete  
Los  tejidos  de  arroz  descritos  anteriormente  se  sumergieron  en  la  suspensión   Sau3AI  que  constaba  de  las  secuencias  5'­
bacteriana  durante  varios  minutos  y  luego  se  transfirieron  sin  enjuagar  al  medio   GTACATATTGTCGTTGAAACGCGTAATACGACTCAC  TATAGGGA­3'  y  3'­
2N6­AS  (todos  los  tejidos  excepto  los  ápices  de  los  brotes)  o  al  medio  N6S3­AS   CATGTATAACAGCAATCTTGCGCAI­FA  TGCTGAGTGATATCCCTCTAG­5'.
(ápices  de  los  brotes),  y  se  incubaron  a  25  °C.  en  la  oscuridad  durante  3  días.  
Después  del  co­cultivo,  los  materiales  se  enjuagaron  a  fondo  con  250  mg  de   La  mezcla  de  reacción  (50  111)  para  la  primera  PCR  consistió  en  una  alícuota  
cefotaxima  en  agua  estéril  y  se  colocaron  en  medio  2N6­CH  (todos  los  tejidos  de   de  la  mezcla  de  reacción  de  ligasa  (50  ng  de  ADN  molde),  KCl  50  mM,  Tris­HCl  
Asanohikari  y  Tsukinohikari  excepto  los  ápices  de  los  brotes),  N6S3­ 10  mM  (pH  8,3),  MgCl2  1,5  mM,  gelatina  al  0,01  %,  0,2  mM  cada  uno  de  dGTP,  
dATP,  dTTP  y  dCTP,  1  unidad  de
Machine Translated by Google

11ADN  polimerasa  Taq  y  10  pmol  de  cada  casete  cebador  C1  (5'­
GTACATATTGTCGTTGAAACGCG­3')  y  cebador  LS1  (5'­  
TCAGTACATrAAAAACGTCCGCA­3',  para  el  borde  izquierdo)  o  cebador  RS1  
(5'­GATCAGATTGTCGTTTCCCG­3',  para  el  borde  derecho).  Se  realizaron  
ciclos  térmicos  de  1  min  a  94°C,  1  min  a  60°C  y  1  lluvia  a  72°C  durante  30  
ciclos.
La  segunda  PCR  se  llevó  a  cabo  utilizando  1  p_l  de  la  mezcla  de  reacción  
de  la  primera  PCR  como  plantilla,  casete  de  cebador  C2  (5'­
TAATACGACTCACTATAGGGAGA­3'),  y  cebador  LS2  (5'­
ACCATGGATCCGCAATGTGTTATTAAGTT­3',  para  el  borde  izquierdo)  o  
cebador  RS2  (5'­TAGTCAGATCTGTCGTTTCCCGC  CT­3',  para  el  borde  
derecho).  La  composición  de  la  mezcla  de  reacción  y  los  detalles  del  ciclo  
térmico  fueron  los  mismos  que  los  de  la  primera  PCR,  excepto  por  la  plantilla  
y  los  cebadores.  Los  productos  de  PCR  se  clonaron  en  un  vector  de  clonación,  
pCRII  (Invitrogen,  San  Diego,  CA),  y  se  secuenciaron  mediante  un  
procedimiento  estándar  (Sambrook  et  al  1989)

Agradecimientos

Los  autores  agradecen  al  Dr.  K.  Nakamura  por  el  regalo  de  piG121Hm,  al  Dr.  
E.  Hood  por  el  regalo  de  EHA101  y  al  Dr.  J.  Paszkowski  por  el  regalo  de  
pGL2.  Se  agradece  la  asistencia  técnica  de  la  Sra.  C.  Ikegaya.

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