SEMINARIO INTERACTIVO 2

El nombre de cáncer incluye un grupo heterogéneo de enfermedades. La explicación

mayoritariamente aceptada para explicar la aparición de dichas enfermedades es la
denominada “teoría mutacional del cáncer”. Esta teoría propone que la acumulación sucesiva
de mutaciones, denominadas “drivers” u “oncogénicas”, en una célula son las responsables
de la proliferación celular que lleva al crecimiento de un clon neoplásico. En el cáncer
colorrectal (CRC), en concreto, se ha postulado que el origen de las neoplasias tiene lugar en
las anomalías que sufren las células madre de la cripta del intestino grueso. Hasta la fecha se
han identificado más de 10 mutaciones oncogénicas en el CRC.

Ejercicio 1 (Sara del Pozo Olivares)

Identifique las mutaciones “drivers” que aparezcan con una frecuencia superior al 5% en CRC
(buscar en la base de datos “TumorPortal: http://www.tumorportal.org/).
Las mutaciones “drivers” con una frecuencia superior al 5% son las siguientes:
- APC (76%)
- TP53 (52%)
- KRAS (43%)
- PIK3CA (19%)
- FBXW7 (16%)
- SMAD4 (12%)
- TCF7L2 (9%)
- NRAS (9%)
- BRAF (9%)
- SMAD2 (6%)
- ARID1A (8%)
- ACRVR1B (6%)
- ERBB3 (6%)
- AXIN2 (6%)
- CDC27 (5%)
- FAM123B (11%)
- KIAA1804 (6%)
- ARID2 (6%)
- MSH6 (5%)

El fenómeno que inicia la génesis de la mayor parte de los casos de CRC es la inactivación del
gen APC.

Ejercicio 2 (Sara del Pozo Olivares)

¿Qué es el gen APC?
El gen APC codifica una proteína supresora de tumores que actúa como antagonista de la vía de
señalización de Wnt. También participa en otros procesos, como la migración y la adhesión
celular, la activación transcripcional y la apoptosis. Los defectos de este gen causan poliposis
adenomatosa familiar (FAP), una enfermedad premaligna autosómica dominante que
generalmente progresa a malignidad. Las mutaciones asociadas a la enfermedad tienden a
agruparse en una pequeña región de agrupamiento de mutaciones (MCR) y dan como resultado
un producto proteico truncado.
En el siguiente pedigrí se muestra la herencia de CRC en una familia (individuos con símbolos
en negro).

Ejercicio 3 (Sara del Pozo Olivares)

¿Qué tipo de herencia es la más probable compatible con los datos familiares mostrados?
El tipo de herencia más compatible con los datos familiares mostrados es herencia autosómica
recesiva. Se descarta herencia ligada a X debido a que mujeres y hombres son afectados a partes
iguales y por lo tanto no nos hace sospechar de ella. Descartamos herencia autosómica
dominante fundamentalmente debido a que en la primera generación ninguno de los
progenitores presenta la enfermedad pero aún así sus descendientes sí (II-3 y II-5), pero lo que
si fuera dominante, alguno de los progenitores debería portar el alelo mutado y
consecuentemente padecer la enfermedad.
Este árbol familiar presenta un tipo de herencia autosómica recesiva, lo cual se puede apreciar
por ejemplo en individuos III-1 y III-2, los cuales son ambos enfermos, mientras que sus
progenitores son sanos los dos (II-1 y II-2). Para que esto ocurra, el genotipo de los progenitores
tiene que ser Aa, portadores, para poder “dar” cada uno a su descendencia ese alelo mutado y
por lo tanto tener dos hijos con genotipo aa, enfermos. El hecho de que los progenitores sean
sanos nos hace sospechar este tipo de herencia.

En el CRC esporádico después de la alteración de APC, pueden darse 2 vías carcinogénicas: la

vía de inestabilidad cromosómica o la vía de inestabilidad de microsatélites.

Ejercicio 4 (Inés Paré Fernández)

Defina brevemente las vías de inestabilidad cromosómica y de microsatélites.
La inestabilidad cromosómica se define como el desequilibrio genómico que se presenta cuando
una célula tiene un número anormal de cromosomas. En condiciones normales, durante su
división, las células distribuyen equitativamente el material genético a las células hijas. Sin
embargo, las células cancerosas presentan inestabilidad cromosómica (INC), un tipo de
inestabilidad genómica que produce la segregación desigual de cromosomas durante la mitosis.
Este fenómeno genera células con un número incorrecto de cromosomas, trastorno
denominado aneuploidía.
Los microsatélites son secuencias altamente repetitivas de nucleótidos que existen en el ADN
en condiciones normales. Están constituidas por repeticiones en tándem de 1 a 4 nucleótidos
que se denominan mono-, di-, tri- y tetranucleótidos. Existen miles de microsatélites en el
genoma humano. Estas secuencias repetitivas son muy propensas a presentar mutaciones, que
habitualmente son reparadas por los genes reparadores de errores. Estos errores provocan
inserciones y deleciones en las secuencias repetitivas. Cuando estos genes se hayan inactivados,
se produce el fenómeno de inestabilidad de los microsatélites (IMS). Esta inestabilidad es el
reflejo de defectos en la reparación de bases desapareadas (MMR, del inglés Mismatch repair),
lo que provoca la acumulación de mutaciones en las secuencias de microsatélites.
Las mutaciones en KRAS ocurren en aproximadamente el 15% de todos los tumores humanos
y en más de un 40% de tumores colorrectales metastásicos. En un ensayo clínico realizado en
pacientes con cáncer colorrectal metastásico, se evaluó la eficacia del fármaco cetuximab en
pacientes con y sin mutación en KRAS. Los resultados obtenidos se muestran en la figura
siguiente:

Responda a las siguientes preguntas:

Ejercicio 5 (Inés Paré Fernández)

¿Qué es el cetuximab?; ¿Cuál es su mecanismo de acción? Describa la vía de señalización en la
que interfiere.
El cetuximab es un anticuerpo monoclonal IgG1 que se une específicamente al EGFR y tiene una
mayor afinidad que los ligandos naturales. El EGFR es un receptor transmembrana del factor de
crecimiento epidérmico (EGFR). Es una proteína que está anormalmente sobreexpresada en
muchos tipos de cáncer, y la inhibición del EFGR provoca una disminución en la proliferación de
las células tumorales y una disminución en la producción de otros factores responsables de la
metástasis (diseminación del cáncer).
Tras la activación del EGFR, la señal puede dirigirse por tres grandes vías de señalización hacia
el interior de la célula: a través de la activación de PI3K-AKT-PTEN-mTOR y mediante la vía de
STAT3. Dentro de la familia de genes RAS se conocen los 3 miembros H-RAS, N-RAS y KRAS, y es
el último el que presenta mayor frecuencia de mutación en los carcinomas de colon.
La proteína ras inactiva está unida a GDP y la forma activa es GTP-RAS. Dicho GTP es hidrolizado
a GDP por la actividad GTPasa intrínseca de las proteínas ras, inactivándose. Cuando hay
mutaciones de KRAS, la actividad GTPasa queda bloqueada y la proteína ras permanece
constitutivamente activada y unida a GTP.

Ejercicio 6 (Inés Paré Fernández)

Describa la figura e interprete los resultados obtenidos.
En esta gráfica de mide la supervivencia global según la mutación en KRAS a lo largo del tiempo
(20 meses). En el eje de las ordenadas tenemos el porcentaje de supervivencia y en el de abscisas
está la duración del ensayo clínico en meses.
Hay dos curvas. La curva roja mide el porcentaje de supervivencia en los pacientes que no tienen
mutación en el gen KRAS. Y la curva azul mide el porcentaje de supervivencia en los pacientes
que tienen KRAS mutado.
Se pueden coger tres valores de tiempo como referencia para comparar las dos curvas.
 • A los 2,5 meses de empezar el ensayo clínico vemos que, en los pacientes con mutación
en KRAS, el porcentaje de supervivencia es 90% aproximadamente. El valor es de 100%
en pacientes sin la mutación.
• A los 6 meses (más o menos) de empezar el ensayo clínico vemos que, en los pacientes
con mutación en KRAS, el porcentaje de supervivencia es de 70% aprox. El valor es de
90% en los pacientes sin mutación.
• A los 10,5 meses (más o menos) de empezar el ensayo clínico vemos que, en los
pacientes con mutación en KRAS, el porcentaje de supervivencia es de 10-15% aprox. El
valor es de 70% en los pacientes sin mutación.
Por lo tanto, se ve que el porcentaje de supervivencia es menor a lo largo del tiempo en los
pacientes con mutación en KRAS que en los pacientes que no lo tienen mutado. Según la
pregunta 5 se sabe que KRAS forma parte de la familia de genes RAS y es el que presenta mayor
frecuencia de mutación en los carcinomas de colon.
Tras la activación del EGFR que está implicado en la invasión, crecimiento y metástasis
tumorales, la señal puede dirigirse por tres grandes vías de señalización hacia el interior de la
célula: a través de la activación de RAS-BRAF-MAPK, tras la activación de PI3K-AKT-PTEN-mTOR
y mediante la vía de STAT3.
La proteína ras inactiva está unida a GDP y la forma activa es GTP-RAS. Dicho GTP es hidrolizado
a GDP por la actividad GTPasa intrínseca de las proteínas ras, inactivándose. Cuando hay
mutaciones de KRAS, la actividad GTPasa queda bloqueada y la proteína ras permanece
constitutivamente activada y unida a GTP.
En resumen, los pacientes con mutación en KRAS tienen una proteína siempre activa que
favorece el desarrollo del cáncer y así podemos explicar los valores más bajos de supervivencia
en esta población comparada con la de los pacientes que no tienen mutación.

La mutación KRAS G12C ocurre en 3-4% de los pacientes con cáncer colorrectal y está asociada
a un peor pronóstico que otras mutaciones en KRAS. Estudios preclínicos utilizando líneas
celulares y organoides portadores de la mutación permitieron determinar los efectos del
fármaco adagrasib en la actividad tumoral. En un ensayo clínico reciente, se evaluó la eficacia
de adagrasib en monoterapia o en combinación con cetuximab en pacientes de cáncer
colorrrectal portadores de la mutación G12C.
Responda a las siguientes preguntas.

Ejercicio 7 (Inés Paré Fernández)

¿Qué es adagrasib?
Adagrasib es un inhibidor dirigido con gran precisión y de acción por vía oral de la proteína
mutante G12C en KRAS. Se podría asociar con el cetuximab para un mejor resultado (este último
dirigido al EGFR).
Ejercicio 8 (Paula Pardo Martín)
Explique las posibles razones que sentaron las bases de la administración de la terapia
combinada de adagrasib y cetuximab. Los resultados obtenidos en este estudio, basados en
los criterios RECIST 1.1, se muestran en las siguientes figuras. Describa e interprete los
resultados obtenidos.

En ambas gráficas, en el eje de abscisas se representan los pacientes con cáncer colorrectal que
han sido evaluados (cada barra corresponde a un paciente), mientras que en el eje de ordenadas
se representa el máximo cambio en porcentaje que ha sufrido el cáncer colorrectal tras la
administración de la terapia; estando la barra por debajo de la línea de base (baseline) en caso
de que el cáncer haya respondido a la terapia, por encima de la línea base en caso de no haber
respondido y haber progresado, o en la propia línea de base si el tumor no ha sufrido cambios.
Además, las barras tienen distinto color en función de si el cáncer ha respondido parcialmente
(azul), está estable (amarillo) o ha progresado (rojo).
Se puede observar que con la administración de adagrasib y cetuximab (gráfica B), el cáncer de
ninguno de los pacientes ha progresado (no hay barras rojas) y que la mayoría de las barras
están por debajo de la línea de base, alcanzándose porcentajes máximos de cambio “positivo”
de hasta el 100%. Sin embargo, con la administración de adagrasib (gráfica A), podemos observar
que el cáncer de algunos pacientes sí que ha progresado (barras rojas) y que el porcentaje
máximo de cambio “positivo” no supera el 70%, mientras que en algunos casos el máximo
cambio “negativo” ha alcanzado el 40%.
Según estos resultados, la combinación de adagrasib con cetuximab para tratar el cáncer
colorrectal resulta más beneficiosa que la administración de cetuximab en monoterapia. Por
tanto, este estudio puede que fuera una de las razones que sentara las bases de la
administración combinada de adagrasib y cetuximab. Otra posible explicación a esta
combinación es que cada fármaco está dirigido a una diana diferente (cetuximab > receptor de
factor de crecimiento epidérmico (EGFR); adagrasib > quinasa KRAS G12C)). Por tanto, su efecto
sinérgico es mayor que en el caso de que ambos compartieran diana farmacológica.

La terapia basada en fluoropirimidinas es el pilar fundamental del tratamiento del cáncer

colorrectal metastásico. Se han hecho importantes avances en su uso añadiendo otros
tratamientos farmacológicos concomitantes. En este contexto, en un ensayo clínico se evaluó
el efecto del esquema farmacológico FOLFOXIRI en combinación con bevacizumab en
comparación con el esquema FOLFIRI más bevacizumab.

Ejercicio 9 (Paula Pardo Martín)

¿Qué fármacos se evalúan en este estudio y cuáles son sus mecanismos de acción?
FOLFOXIRI: siglas de ácido folínico, 5-fluorouracilo, oxaliplatino e irinotecan.
FOLFIRI: siglas de ácido folínico, 5-fluorouracilo e irinotecan.
- Ácido folínico: análogo activo del ácido fólico, que es una vitamina que en el organismo
es reducida a ácido tetrahidrofólico por el enzima dihidrofolato-reductasa. El ácido
tetrahidrofólico es un factor necesario para la síntesis de aminoácidos y DNA, y por tanto,
 es especialmente relevante en aquellos tipos celulares con una alta tasa proliferativa. El
mecanismo de acción del ácido folínico consiste en bloquear parcialmente los efectos
de fármacos como el metotrexato, que nos inhibidores competitivos de la dihidrofolato-
reductasa (antagonistas del ácido fólico).
- 5-fluorouracilo: uracilo con un grupo de flúor en posición 5 (pirimidina fluorada)
perteneciente a la clase de los antimetabolitos e inhibidor del enzima timidilato sintasa,
que cataliza la conversión de desoxiuridilato en timidilato. Esta reacción es necesaria
para obtener la timina a partir de uracilo y, por tanto, si se inhibe, se inhibirá también la
síntesis de DNA.
- Oxaliplatino: derivado del platino de tercera generación que interacciona con la síntesis
de DNA al formar puentes intra e intercatenarios en el DNA.
- Irinotecan: derivado de la camptotecina que inhibe a la topoisomerasa I, enzima
encargado de mantener la estructura topográfica del DNA durante la replicación, la
transcripción y la mitosis.
- Bevacizumab: anticuerpo monoclonal humanizado que se une al factor de crecimiento
del endotelio vascular (VEFG) e inhibe su unión a los receptores Flt-1 (VEFGR-1) y KDR
(VEFGR-2), situados en la superficie de las células endoteliales.

Ejercicio 10 (Paula Pardo Martín)

Los resultados obtenidos fueron los siguientes. Describa la figura.

En la gráfica se pueden observar dos líneas: la de color azul representa que el tratamiento
administrado ha sido FOLFIRI junto con bevacizumab, mientras que la de color rojo representa
que el tratamiento administrado ha sido FOLFOXIRI junto con bevacizumab. El eje de abscisas
representa el número de meses transcurridos desde el inicio del tratamiento, mientras que el
eje de ordenadas representa el porcentaje de pacientes que han sobrevivido. Además, debajo
de los valores del eje de abscisas nos indican el número de pacientes en valor absoluto que han
sobrevivido en cada uno de los meses transcurridos para los dos tipos de tratamiento.
- Hazard ratio (HR) = 0,8
- Intervalo de confianza (IC) al 95% = 0,65 - 0,98
- Diferencias estadísticamente significativas, p=0,03
Se puede observar que durante los primeros meses de tratamiento, hasta los 18 meses
aproximadamente, el porcentaje de supervivencia de los pacientes es similar en ambos grupos
de tratamiento. Sin embargo, a partir de los 18 meses, se observa un mayor porcentaje de
supervivencia en el grupo de pacientes tratados con FOLFOXIRI y bevacizumab frente al grupo
tratado con FOLFIRI y bevacizumab. Además, en el grupo tratado con FOLFIRI la supervivencia
es nula a los 66 meses desde el inicio del tratamiento, mientras que en el grupo tratado con
FOLFOXIRI, deja de haber supervivientes después de 72 semanas de tratamiento.
Ejercicio 11 (Paula Pardo Martín)
En este mismo estudio, los autores analizaron distintas mutaciones en los pacientes y
obtuvieron los siguientes resultados. Describa la figura:

En ambas gráficas aparecen líneas de tres colores: la de color azul representa que los pacientes
presentan alelos salvajes de los genes que codifican para RAS y BRAF, la de color rojo representa
que los pacientes presentan una mutación positiva en el gen que codifica para BRAF y la de color
verde representa que los pacientes presentan una mutación positiva en el gen que codifica para
RAS.
En la gráfica de la izquierda, el eje de abscisas representa el número de meses transcurridos
desde el inicio del estudio, mientras que el eje de ordenadas representa el porcentaje global de
supervivientes. Además, debajo de cada valor del eje de abscisas se representa en valor absoluto
el número de pacientes supervivientes de cada grupo. Como se puede observar, el grupo de
pacientes que presentan alelos salvajes de RAS y BRAF tiene mayor porcentaje de supervivencia
que el grupo que presenta la mutación positiva de RAS, que a su vez tiene mayor porcentaje de
supervivencia que el grupo que presenta la mutación positiva de BRAF. Sin embargo, la
supervivencia nula se alcanza primero en el grupo con la mutación de BRAF (48 meses), después
en el los dos alelos salvajes de RAS y BRAF (66 meses) y por último en el de la mutación de RAS
(72 meses).
En la gráfica de la derecha, el eje de abscisas representa el número de meses trasncurridos desde
el inicio del estudio, mientras que el eje de ordenadas representa el porcentaje de pacientes
supervivientes cuya enfermedad además no ha progresado. Podemos observar que el grupo de
pacientes con los alelos salvajes de RAS y BRAF presenta mayor porcentaje de supervivencia sin
progresión de la enfermedadque el grupo con la mutación de RAS, que a su vez presenta mayor
porcentaje de supervivencia sin progresión de la enfermedad que el grupo con la mutación de
BRAF. Sin embargo, la supervivencia sin progresión nula se alcanza primero en el grupo con la
mutación de BRAF (24 meses), después en el de los alelos salvajes de RAS y BRAF (60 meses) y
por último en el de la mutación de RAS (72 meses).

Ejercicio 12 (Belén Pardo Molina)

¿Qué pacientes tendrían un fenotipo más severo? Explique la implicación fisiopatológica de
estas mutaciones.
El fenotipo más severo correspondería a la mutación BRAF, ya que los pacientes que la presentan
son los que tienen un menor porcentaje de supervivencia.
Tanto RAS (proteína G monomérica con actividad GTPasa), como BRAF (protooncogen con
actividad serina treonina kinasa) participan en la vía de las MAP kinasas, por lo que se encargan
de la proliferación celular. Una mutación en cualquiera de estos dos genes van a producir un
aumento de la proliferación celular y una situación favorable para el desarrollo y crecimiento de
tumores, además de un mal pronóstico y peor respuesta al tratamiento.

Como se ha discutido anteriormente, el 5-fluorouracilo (5-FU) es un agente quimioterapéutico

para CRC. A pesar del progreso alentador en la terapia hasta la fecha, las tasas de respuesta a
5-FU de los pacientes siguen siendo bajas, viéndose recurrentemente comprometidas por el
desarrollo de quimiorresistencia. Los cánceres sólidos exhiben un equilibrio dinámico entre la
muerte y la proliferación celular, lo que garantiza el mantenimiento y crecimiento continuo
del tumor. Evidencias previas sugieren que la apoptosis inducida por 5-FU activa vías de
supervivencia dependientes de mTOR en las células vecinas contribuyendo a la
quimiorresistencia del tumor. Para determinar el papel de mTOR en la resistencia a 5-FU, se
inyectaron organoides de pacientes con CRC en el flanco de ratones inmunodeprimidos. Los
ratones fueron tratados con rapamicina y/o 5-FU (panel i). El resultado se muestra en el panel
j.

Ejercicio 13 (Belén Pardo Molina)

Indique el papel fisiológico de mTOR y cómo la rapamicina modula su actividad.
mTOR es una proteína kinasa regulada por señales externas como factores de crecimiento o
nutrientes. En respuesta a estos, mTOR participa en diversas funciones celulares como la
nutrición o supervivencia celular. Cuando las células están expuestas a nutrientes, mTOR se
activa y promueve la síntesis de proteínas y lípidos, así como la producción de energía. Además,
mTOR también puede influir en la regulación de la autofagia y ayuda a las células a resistir el
estrés y las condiciones adversas. Su inhibición puede conducir a la muerte celular programada.
La actividad de mTOR se regula también mediante la interacción con proteínas reguladoras y
fosforilación de residuos específicos. Una de las formas de modular la actividad de mTOR es
mediante la inhibición de su activiadad kinasa a través de la rapamicina.
La rapamicina se une a una proteína intracelular llamada FKBP12 que se encuentra en muchos
tipos celulares del cuerpo humano. Se ha demostrado que FKBP12 tiene diversas funciones
biológicas, como la regulación de los canales iónicos, modulación de la liberación de calcio y
regulación de la actividad de otras proteínas intracelulares. Además, también modula el sistema
inmune proporcionando efecto neuroprotector y antiinflamatorio.
El complejo resultante de esta interacción se une específicamente a mTOR para inhibir su
actividad produciendo una reducción de la síntesis de proteínas y la inhibición de la progresión
del ciclo celular entre otros. En otras palabras, va a tener un efecto antitumoral ya que va a
inhibir la proliferación celular, diferenciación y supervivencia celular.

Ejercicio 14 (Belén Pardo Molina)

Describa en qué consiste el modelo de generación de tumores en ratones que han utilizado en
el estudio. Explique la cronología de los experimentos realizados y mostrada en el panel i de
la figura anterior.
El método consiste en introducir organoides de pacientes con cáncer colorrectal en ratones
inmunodeprimidos previamente. Una vez que las células tumorales se desarrollan en el nuevo
huésped, se pueden llevar a cabo experimentos con los cuales se observan los efectos de
distintos tratamientos y la respuesta tumoral frente a estos.
En este caso se trabaja con 5-FU, rapamicina y con ambos al mismo tiempo. El efecto que se
pretende conseguir es disminuir la proliferación celular y la expansión tumoral.
Se trata de un modelo en el que los organoides se van a inyectar a los ratones por vía subcutánea
entre los días -15 a -10, es decir, entre 10 y 15 días antes del comienzo del tratamiento. Como
se puede ver en la línea horizontal, se va a administrar rapamicina desde el día 0 hasta el día 6 y
5-FU los días 0, 2, 4, 6. El modelo termina el día 8 al someter a los ratones a la eutanasia.

Ejercicio 15 (Elena Palomo Castro)

Describe la figura del panel j, indicando las variables de los ejes de abscisas y ordenadas. Indica
cuál es el efecto de la rapamicina sobre la toxicidad de 5-FU.
En la figura del panel j se representa la evolución del volumen de un tumor en mm2
(representado en el eje de ordenadas en rango de 0 a 600) en función del tiempo en días
(representado en el eje de abscisas en rango de 0 a 8 días) según la administración del vehículo,
en marrón, de rapamicina, en rojo, del 5-fluorouracilo, en verde, y de 5-fluorouracilo y
rapamicina en conjunto, en azul.
Se observa cómo con el vehículo, la rapamicina o el 5-fluorouracilo, el volumen del tumor
continúa aumentando tras la administración. Sin embargo, al administrar conjuntamente el 5-
fluorouracilo y la rapamicina se consigue disminuir el volumen del tumor progresivamente.
Al inhibir el complejo mTOR, ya no se produce el mismo fenómeno de quimiorresistencia por su
activación al administrar 5-FU y por tanto, la toxicidad de 5-FU disminuye considerablemente.

Estudios previos sugieren que la liberación de ATP extracelular, desde las células en apoptosis,
conduce a la activación paracrina de mTOR en las células vecinas. Para resolver esta hipótesis
se analizan los niveles de la proteína S6 fosforilada en respuesta a concentraciones crecientes
de ATP empleando organoides procedentes de pacientes con CRC. El resultado se muestra a
continuación.

Ejercicio 16 (Elena Palomo Castro)

Describa la técnica de Western e inmunoblot para analizar la expresión de proteínas de los
organoides. ¿Qué masa molecular aproximada tiene la proteína S6 y la -tubulina? ¿Por qué
analizan los niveles de proteína S6 y -tubulina? Indique por qué se analizan los niveles de
proteína S6 fosforilada en respuesta a ATP. Describa las imágenes mostradas e interprete los
resultados obtenidos.
El Western blot o inmunoblot consiste en una técnica de análisis de proteínas realizada a partir
de los resultados de una electroforesis en gel. Las bandas de proteínas obtenidas en la
electroforesis son trasladadas a una membrana de nitrocelulosa con anticuerpos específicos
para la proteína que se desea analizar. Por último, se hace uso de fluorescencia o productos
enzimáticos para detectar la unión entre la inmunoglobulina y la proteína.
Según el resultado de la imagen, la masa molecular aproximada de la proteína S6 es 35 kDa, y la
de la -tubulina es aproximadamente 55 kDa.
La proteína -tubulina es un componente fundamental de los microtúbulos, que participan en
división y movimiento celular. Los niveles de esta proteína se miden como control de que el
análisis de los organoides se ha realizado correctamente, ya que es una proteína abundante en
el medio intracelular.
La proteína S6 es una proteína ribosomal de la subunidad de 40S del ribosoma de las células
eucariotas. Se analiza para compararla con su estado fosforilado. La fosforilación de la proteína
S6 se asocia con la estimulación de la mitosis en células (proliferación celular) y la regulación del
tamaño celular. Con crecientes concentraciones de ATP extracelular se observa cómo aumenta
la cantidad de proteína S6 fosforilada al activarse una proteína kinasa, lo que significa que ante
apoptosis de células, las células vecinas han activado un proceso de supervivencia celular.

El ATP extracelular puede activar la señalización en la célula diana a través de una familia de
proteínas transmembrana denominada receptores purinérgicos. Para identificar qué miembro
de esta familia está involucrado en la traducción de señales desde el ATP hasta mTOR, se
determina la expresión génica de los distintos subtipos conocidos en organoides humanos no
transformados y en organoides tumorales.

Ejercicio 17 (Elena Palomo Castro)

Describa brevemente la técnica que se ha utilizado para analizar los niveles de expresión
genética. Describa la gráfica que se presenta e interprete el resultado obtenido.
Para medir los niveles de expresión de mRNA representados en la gráfica se ha empleado una
técnica denominada RT-PCR. Esta consiste en una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) a
partir de un molde de DNA, denominado cDNA, complementario a la cadena de RNA. A partir
de este cDNA se pueden obtener múltiples copias, amplificando la muestra. El cDNA se obtiene
mediante un enzima denominado retrotranscriptasa (de ahí que se denomine RT-PCR la técnica).
La gráfica muestra los niveles de expresión de mRNA mensajeros que codifican para múltiples
receptores purinérgicos en células sanas de organoides de colon y en células de organoides de
cáncer colorrectal. Se observa una similar y reducida expresión de la mayor parte de los
receptores, destacando la expresión de P2X4, muy elevada en las células sanas con respecto a
las de organoides de CRC. De este modo, la transducción de señales desde el ATP extracelular
hasta mTOR se puede concluir que se produce mayoritariamente a través de estos receptores.