UNIVERSIDAD POPULAR AUTONOMA DE VERACRUZ

Sede

Tihuatlán

Licenciatura

criminología y criminalística

Asignatura

medicina forense I

Catedrático

Oswaldo Ponce Greer

Actividad

Proceso de la prueba de ADN

Alumno

Roberto Méndez Alvarado

Cuatrimestre

Tercero
Contenido
Prueba de ADN................................................................................................................... 2
Procedimiento técnico.....................................................................................................2
Obtención de muestras de ADN en cadáveres....................................................................4
Pretratamiento................................................................................................................. 4
Extracción........................................................................................................................ 5
Referencia........................................................................................................................... 6

Prueba de ADN

Los resultados de un “estudio de marcadores de ácido desoxirribonucleico (ADN)

para determinar paternidad” como prueba pericial en materia de genética y
biomedicina molecular en un juicio, se presentan en un dictamen elaborado por un
experto perito en la rama de ciencia y en la especialidad de genética, con estudios
y experiencia comprobable, debidamente certificado ante el poder judicial, los
plenos del tribunal superior de justicia y el consejo de la judicatura.
Procedimiento técnico

El análisis de ADN se compone de las siguientes etapas:

1) Toma de muestras: los forenses obtienen ADN de una infinidad de fuentes
biológicas muchas veces no imaginadas, como chicle, manchas,
pintalabios, una tasa, una botella con agua, un pasamontaña, restos
calcinados, un rastrillo, cepillo de dientes, etc.
2) Extracción y purificación del ADN de todas las muestras:
 Lisis celular, es decir, la destrucción de las células, ya sea
epiteliales, de osteocitos, descalcificar el hueso; de tejido
desintegrarlo y homogeneizarlo, entre otros.
 Purificación, para separar al ADN de las proteínas y los restos
celulares que dejó la lisis celular previa.
 Precipitación, que consiste en separar al ADN mediante su
deshidratación en alcohol absoluto y dejarlo secar.
 Resuspensión, para rehidratar el ADN con una solución que lo
protege de la posible degradación.
3) Copia o amplificación de segmentos cortos de ADN mediante PCR: Una de
las técnicas más sencillas es la espectrofotometría, la cual se puede
realizar con cantidades mínimas de muestra. Además de la concentración,
 se estima la pureza del ADN en cuanto a la presencia de sales o proteínas
que pudieran interferir posteriormente para obtener un perfil genético. las
muestras forenses suelen cuantificarse por medio de PCR en tiempo real.
consiste en amplificar la muestra de interés en presencia de muestras a
diferentes concentraciones de ADN que sirven como referencia (0.5, 3, 5,
10, 20 ng/L, etc.). Los equipos de PCR tiempo real detectan con gran
sensibilidad la amplificación de las muestras de referencias con relación a
la muestra de interés.
 Ampliación por PCR: El objetivo de la reacción en cadena de la
polimerasa consiste en amplificar o generar millones de copias
secuencias del genoma, en este caso STRs lo que genera el perfil
genético. La PCR consiste en 25-30 ciclos en los que suceden los
siguientes tres pasos en cada ciclo:
1) desnaturalización, por calor se desnaturalizan (separan) las cadenas
de ADN
2) alineamiento de los iniciadores o primers que se unen por
complementariedad de bases y delimitan las regiones que se van a
replicar,
3) extensión, en cada ciclo de PCR se duplica la secuencia blanco
(STRs), por lo que en 25 a 30 ciclos teóricamente habrá millones de
copias.
4) Visualización de los fragmentos mediante electroforesis capilar: Los alelos
STRs se diferencian por el número de veces que se repite una secuencia
corta, esto significa que el tamaño va a ser diferente entre un alelo y otro.
Para ver estas diferencias se emplea la EC, donde el producto de PCR de
cada muestra se separa a través de un capilar relleno de polímero por
acción de un campo eléctrico, proceso que dura alrededor de 30 minutos
por muestra. Como parte de la EC, también se detectan los productos para
ofrecernos una representación gráfica de la corrida llamada
electroferograma.
5) Comparación visual de los códigos obtenidos: Finalmente, en el
electroferograma se observa una serie de picos que –de acuerdo a su color
y posición– indican los genotipos que tiene en individuo para cada STR, lo
que constituye su perfil genético. Si un individuo presenta uno o dos picos
(alelos), indica que su genotipo es homocigoto o heterocigoto,
respectivamente.
6) Análisis de los resultados: Una vez obtenidos los perfiles genéticos, estos
deben ser sometidos a un riguroso proceso de revisión e interpretación.
7) Elaboración del Dictamen.
El perfeccionamiento de la prueba se practica sobre muestras de células
epiteliales a partir de raspado de exudado bucal con citocepillo e hisopos estériles
obtenidas de las personas involucradas e identificadas oficialmente. Las muestran
se toman de la familia nuclear (presuntos progenitores y supuesto hijo). Las
personas a las que se les toma la muestra, no requieren de ayuno u otra condición
especial. El estudio proporciona resultados e información del perfil genético para
determinar paternidad y no arroja otro tipo de información sobre enfermedades u
otra condición de los individuos a los cuales se les tome la muestra.
Las personas a las que se les toma la muestra deben leer u oír y firmar un formato
de identificación y consentimiento. Dicho formato también es firmado por el
PERITO CERTIFICADO, quién es el custodio legal de las muestras. Las muestras
son analizadas en laboratorio en donde se aplican las técnicas científicas
requeridas para la extracción del material genético, la amplificación del mismo y la
detección de amplicones.

Obtención de muestras de ADN en cadáveres

Al lugar en el que se realice la exhumación, para realizar la toma de muestras

cadavéricas, a la hora de realizar la toma de muestras, deben seleccionar alguna
de las siguientes:
Dientes: Se recomienda seleccionar al menos 4 piezas dentales, si es posible
molares, que no estén externamente dañados ni hayan sido sometidos a
endodoncias. Se extrae la pieza dental completa, sin romper sus raíces. Si no es
posible la extracción, se recomienda enviar la mandíbula completa.
Huesos: Se limpiarán de restos de putrílago y siempre que sea posible se
seleccionará un hueso largo y compacto, preferiblemente un fémur.
En caso de que se pueda escoger entre huesos y dientes, se seleccionan siempre
estos últimos, ya que el ADN se conserva mucho mejor en la cavidad pulpar del
diente. En aquellos casos en los no sea posible obtener muestras del fallecido,
también es posible establecer la paternidad o parentesco biológico a través de
restos biológicos del presunto padre obtenidos de su entorno familiar (cepillos de
dientes, cabellos con raíz, prendas de vestir, colillas, sobres, sellos, etc.), o bien
en entornos hospitalarios (biopsias, donaciones de sangre o esperma, etc.).

Pretratamiento

Uno de los primeros pasos, previos a la propia etapa de extracción, suele consistir
en un pretratamiento de los RO, encaminado a acondicionar y/o mejorar el
rendimiento en la posterior extracción de ADN. La mayor parte de los protocolos
recomiendan una limpieza superficial, Esta limpieza puede basarse en lavados
con lejía diluida y/o agua destilada. Sin embargo, algunos estudios han
demostrado que se trata de un procedimiento demasiado agresivo y que puede
ser contraproducente para el posterior éxito en la obtención de ADN,
proponiéndose métodos químicos alternativos. La mayor parte de los protocolos
propone la eliminación de dicha capa superficial mediante abrasión mecánica o
lijado. Otro método alternativo, suele consistir en la irradiación de las piezas a
analizar con luz ultravioleta. Una vez limpiadas las muestras (descontaminadas), si
se trata de huesos largos se cortan en fragmentos. Ya sean huesos largos o
dientes, siempre se pulverizan mediante un molino de impactación
electromagnética refrigerado con nitrógeno líquido, para así aumentar la superficie
disponible para los tratamientos químicos posteriores.

Extracción

El último paso consistirá en la propia digestión de la muestra, mediante proteinasa

K, y purificación del extracto resultante. De este modo, como métodos más
ampliamente extendidos se pueden destacar el basado en la extracción mediante
disolventes orgánicos (fenol:cloroformo) o mediante resinas quelantes (método de
unión a «glass-milk» o suspensión de silica) . También han sido sugeridos otros
como el uso de otro tipo de resinas, tipo Chelex. En la actualidad, uno de los
métodos más comúnmente usados es el basado en la combinación de
descalcificación con EDTA y purificación con silica. A continuacion se mencionan
los mas usados:
Protocolo «Fenol:cloroformo»: Este protocolo es una adaptación del
procedimiento estándar de extracción de ADN por fenol: cloroformo, en el cual las
muestras son digeridas con proteinasa K y un detergente como Triton X-100 o
SDS, que rompe las membranas celulares.
Protocolo «Silica-sal»: Este protocolo se fundamenta en la adición al polvo de
hueso/diente de una solución de extracción (extraction buffer), consistente en
EDTA y proteinasa K, y su incubación toda la noche. Al sobrenadante obtenido se
le añade ˜ una solución de unión (binding buffer) de base de tiocianato de
guanidinio (GuSCN) concentrado y cloruro o acetato sódico (NaCl/Ac), y la
suspensión de silica, todo lo cual se incuba en oscuridad.
Protocolo «Desmineralización-silica: Este protocolo podría ser considerado
como una variación del anterior, pues se basa también en la retención en silica
(comercial), aunque no incluye la sal GuSCN. Se valora de forma independiente,
pues es el procedimiento operativo estándar de la Comisión Internacional de
Personas Desaparecida (International Commission on Missing Persons [ICMP].
Protocolo «Fishing» (purificación): Este método de extracción está basado en
la hibridación y separación magnética que proporciona ADN puro sin ningún
inhibidor detectable. Previo al propio proceso de «captura de ADN», la muestra
(polvo de hueso/diente) es sometida inicialmente a una extracción con el tampón
estándar ampliamente descrito (EDTA, SDS y proteinasa K). El sobrenadante
obtenido se somete de forma repetitiva a una solución de unión y lavado posterior
filtrado, manteniéndolo finalmente en dicha solución. El siguiente paso consiste en
la incubación de la muestra con iniciadores (primers) marcados con biotina, para
posteriormente inmovilizar el ADN en partículas magnéticas recubiertas de
estreptavidina, usando un concentrador de partículas magnéticas.

Referencia
Barrio, P. (29 de diciembre de 2021.) Revisión de métodos de extracción de ADN
a partir de restos óseos en el laboratorio forense. Revista española de medicina
legal. Disponible en: file:///C:/Users/Roberto/Downloads/S0377473212001071.pdf
DIMYGEN. (s.f.). prueba de paternidad. Disponible en: https://dimygen.com/perito-
en-adn-paternidad.pdf
LABGENETICS. (s.f.). Prueba de ADN post-mortem sobre restos cadavéricos.
Disponible en: https://www.labgenetics.es/pruebas-de-adn-e-identificacion-
genetica/pruebas-de-paternidad-y-parentesco/prueba-de-paternidad-post-mortem-
sobre-restos-cadavericos/
Villalobos, H. (febrero 2018). Lo que se debe saber acerca de…… Las pruebas de
ADN en el contexto forense. Revista de ciencias forenses de Honduras. Disponible
en: http://www.bvs.hn/RCFH/pdf/2017/pdf/RCFH3-2-2017-8.pdf