UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

CURSO
PROFESOR

:
:

Laboratorio de Microbiologa
Gretty Villena

INFORME DE PRCTICAS
PRCTICA N

03

TTULO

Tincin diferencial cido-resistente

ALUMNOS

Carrasco, David
Farfn, Axel
Oropeza, Yoselin
Sibille, Stefana

FACULTAD

Ciencias

HORARIO DE PRCTICAS
(DA Y HORA)

Lunes/14:00 a 16:00 hrs

FECHA DEL EXPERIMENTO

09/08/2013

FECHA DEL REPORTE

23/09/2013

Tincin Diferencial cido-Resistente

Introduccin:
Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Sporosarcina, Clostridium y
Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se
producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los
nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose
una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la
clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable,
la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar
perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son
patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters.
La pared celular de la endospora presenta distinto comportamiento que la membrana
bacteriana frente a la tincin, por lo que se utilizan tcnicas especiales de coloracin
Debido a esto el proceso de tincin simple no es muy efectivo, se utilizan otros medios
para poder teir adecuadamente estas estructuras. En este caso se usan las
conocidas tinciones cido resistentes, en esta prctica se ven las que siguen la
metodologa de Schaeffer & Fulton y Dorner.

Materiales:
Tcnica de Drner

Cultivos de 48 horas de Bacillus sp.

Aceite de inmersin
Asa de Klle
Bao de agua a 100 C
Lminas porta objeto
Soluciones colorantes:
Carbofucsina
Tinta China
Tubos con agua destilada estril

Tcnica de Schaeffer y Fulton

Cultivos de 48 horas de Bacillus sp.

Aceite de inmersin
Asa de Klle
Lminas porta objeto
Mechero de alcohol
Pinza
Papel secante
Soluciones colorantes:
Carbolfucsina
Verde malaquita
Solucin decolorante:
Alcohol cido

La preparacin del alcohol cido es 95 por 100 conteniendo 2.5 por 100 de HNO 3
(Seeley & Van Demarck; 1972).

Metodologa:
Tcnica de Drner
1. Preparar una suspensin de clulas Bacillus sp. , usando el asa de klle, en 0.5 ml de
agua estril en un tubo de prueba.
2. Aadir igual volumen de carbolfucsina y se colocar el tubo en bao mara por diez
minutos.
3. Transferir una gota de la suspensin de clulas coloreadas al extremo de un
portaobjetos, agregar una gota de tinta china y con ayuda de un cubreobjetos extender
la mezcla, varias veces hasta obtener una delgada pelcula.
4. Secar la lmina con papel toalla dando pequeos toques y agregar aceite de inmersin.
5. Finalmente pasar a examinar al microscopio bajo un objetivo de inmersin.

Tcnica de Schaeffer y Fulton

1. Fijacin de la muestra de Bacillus sp.
En la lmina portaobjeto agregar una gota de agua destilada. Luego de
esterilizar el asa de Klle con ayuda del mechero de alcohol (constantemente
prendido hasta terminar con la fijacin), extraer el algodn estril que cubre al
cultivo y esterilizar la boquilla del tubo con Bacillus sp., despus con ayuda de la
asa sacar un pequea cantidad de muestra y esparcirla encima de la gota de
agua en el portaobjetos. Seguidamente, volver a esterilizar la boquilla del tubo
con el cultivo y cerrar con algodn para luego esterilizar el asa de Klle.
Finalmente secar paulatinamente la muestra utilizando el calor proporcionado
por el mechero.
2. Aplicar el colorante primario, carbolfucsina, en exceso.
3. Con ayuda de la pinza, calentar el portaobjetos con el colorante ya agregado
utilizando la llama del mechero hasta observar vapores. Mantener esta
temperatura por tres minutos, puede ayudarse aumentando colorante poco a
poco.
4. Lave la muestra hasta que vea que no se desprende ms colorante.
5. Agregar el decolorante, alcohol cido gota a gota entre seis a ocho gotas hasta
notar que no se desprende ms colorante.
6. Enjuague con agua.
7. Agregar el colorante de contraste, verde malaquita, en exceso por dos minutos.
8. Enjuague con agua.
9. Seque la muestra con ayuda de papel secante.
10. Agregar aceite de inmersin.
11. Observar a 1000x.

Resultados:

Tcnica de Drner
Bacillus sp

G.A. 1000X

Figura 1. Espora central

Tcnica de Schaeffer y Fulton

Bacillus sp: Esporas teidas con carbolfucsina. Clula Vegetativa teida con verde
malaquita.

G.A. 1000X

Discusin:
Tincin de Drner
Para teir la endospora se utiliz la tcnica Ziehl-Neelsen, este mtodo consiste en
aplicar fenol y calor para que la fucsina bsica penetre en la endospora. La fucsina
fenol o carbofuscina caliente es capaz de teir todo tipo de clulas bacterianas,
adems el fenol facilita la penetracin de la fucsina en la pared celular (Gamazo C.,
Lpez-Goi & Daz R., 2009).
Con el fin de visualizar la espora, se tiene que decolorar la clula vegetativa. Por esta
razn la tcnica de Drner hace uso de la tinta china como decolorante y a su vez
como elemento principal de tincin negativa.
Las clulas vegetativas aparecen como cuerpos brillantes rodeados por un fondo azulnegro debido a que las partculas de la tinta no pueden penetrar a la bacteria
(Presscott, Harley & Klein, 2002).

Tincin de Schaeffer y Fulton

El primer tinte utilizado es la carbolfucsina, esta ser la culpable de la tincin de la

endospora. La carbolfucsina es un colorante fenificado, esto explica porqu tiene una
alta reactividad ya que el cido fenlico tiene utilidad de mordiente, reforzando la
accin de tincin (Garca, Paredes & Fernndez, 1994).
Las endosporas son estructuras resistencia y latencia, ante una tincin simple o gram
estas no son teidas pues poseen cubiertas a base de protenas que le otorgan una
impermeabilidad o la presencia del cido dipicolnico que le dara una posible
resistencia trmica (Tortora, Funke & Case, 2007; Swamy, 2008).
Por lo que para su tincin es necesaria la presencia de calor luego de agregar el tinte
de alta reactividad. Esto modificar la permeabilidad de las capas de la endospora
ayudando a la penetracin de la carbolfucsina (Vsquez, Martn, Silonz & Serrano,
2010).
En este procedimiento es necesario el uso de un colorante de contraste, el cual
permitir teir a la clula vegetativa. En esta prctica se hizo uso del verde malaquita,
un colorante derivado de la anilina, que posee tres anillos bencnicos (Fig. 2); es un
colorante dbilmente bsico (tiene una carga positiva dbil) y por tanto, se une
dbilmente a la bacteria (Snchez et al, 2013).

Figura 2. Estructura de la molcula de Verde Malaquita.

Determinacin de la Muestra:

Para la determinacin de la especie perteneciente al gnero Bacillus, usado en el

laboratorio, utilizamos 2 criterios:
1) Por la posicin de la espora dentro de la clula vegetativa: (Madigan, et. al, 2009)
- Central
- Terminal

2) Adems nos basamos en otro libro, el Manual de Bergey de Bacteriologa

determinativa, que nos tiene los siguientes criterios:
I) Esporangio no hinchado. Esporas cilndricas o elipsoides centrales o terminales.
Esporas no teidas fcilmente. Gram-positivas.
I.1) Dimetro mayor o igual a 0.9 micras
Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis y Bacillus megaterium.
I.2) Dimetro menor a 0.9 micras
Bacillus subtilis y Bacillus licheniformes.

Se concluye que Bacillus anthracis no es nuestra muestra ya que es patgena y es

muy poco probable que la se haya manipulado esta especie en el laboratorio sin la
indumentaria necesaria .Primero se determin que la bacteria posee una espora
central (Fig. 1) pero no en posicin ecuatorial sino casi una subterminal, pero esto
no es suficiente. Por eso utilizamos el segundo criterio para esto necesitamos poder
determinar su tamao, la metodologa que usamos fue primero determinar el
tamao del campo visual para mediante una proporcin poder conocer el tamao de
nuestra bacteria, este dato se conoca de un experimento anterior y es 14 micras
para 1000 aumentos. Luego, con un software se midi los pxeles que conforman a
la bacterias y se compar con los pixeles que conforman el campo visual y se
determin que aproximadamente la bacteria mide 0.6 micras. Con estos datos
podemos determinar que la bacteria es Bacillus subtilis pero podemos confundirla
con Bacillus cereus debido a esto se necesitan ms pruebas para comprobar esta
aseveracin (Breed et. al, 1957).

Errores experimentales:
En la tcnica de Drner al momento de esparcir la tinta china no se hizo con mucha
delicadeza, debido a eso no se observ de manera tan adecuada. Adems, se utiliz
mucha tinta china.
Para la determinacin de la especie de Bacillus sp, el criterio del dimetro que se utiliz
no es muy confiable debido a que no se midi en ese instante sino se us un dato
antiguo, adems de realizar pruebas de motilidad, componente de pared (cidos
grasos); cantidad de GC, etc. para que sea confiable. Adems la tincin no ayudo
mucho ya que no se realiz satisfactoriamente (Breed et. al, 1957).

Conclusiones:
1. La tincin de Dorner es una tincin diferencial cido-resistente que permite la

observacin de las endosporas dentro de una clula bacteriana en su fase de

esporulacin, pudiendo apreciarse la endospora de una manera muy ntida y resaltante
debido a que la estructura vegetativa queda incolora, a diferencia de la tincin de
Schaeffer y Fulton donde no se observaron las endosporas claramente.
2. La tincin de Scharffer y Fulton puede resultar ms complicada de realizar por el hecho
de tener que mantener una temperatura constante por tres minutos, pues si no se llega
a eso, el tinte no penetrar la endospora y si hay un excedente de temperatura o
tiempo, la clula se podr destruir. Sin embargo, cuando no hay errores experimentales
la tincin resulta muy til pues se ve la diferencia de colores entre la bacteria y su
respectiva endospora.
3. Segn nuestro anlisis, la muestra es posiblemente Bacillus subtilis pero puede ser
adems Bacillus cereus que se confunde a menudo con Bacillus subtilis.

Referencias Bibliogrficas:

 Breed R., Murray E. & Smith N. 1957. Bergey's Manual of Determinative

Bacteriology. The Willians & Wilkins Company. Pp 613.

Gamazo C., Lpez-Goi, Daz R. 2009. Manual prctico de Microbiologa Tercera

edicin. Editorial Elsevier Masson. Espaa. ISBN 978-84-458-15199.

Garca, P., Paredes, F., Fernndez, M. 1994. Microbiologa Clnica prctica.
Segunda Edicin. Servicio Publicaciones UCA. Espaa. Pp. 30-43.
Madigan M, Martiko J & Parker J.2009. Biologa de los Microorganismos. Dcima

Edicin. Prentice Hall. Barcelona. Pp. 496-499.

Presscot, L.M., Harley, J.P., Klein D.A. 2002. Microbiology. 5th edition. McGraw-Hill

Higher Education.
Snchez A., Gamazo C., Camacho A. 2013. Microbiologa basada en la

experimentacin. Editorial Elsevier Masson. Espaa. ISBN 978-84-9022-085-6. Pp.

5-10.
Swamy P.M. 2008. Laboratory Manual on Biotechnology. Rastogi Publications.India.

231 p. ISBN 9788171339181.

Tortora, G., Funke, B., Case, C. 2007. Introduccin a la Microbiologa. Editorial

Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Pp. 71.

Vzquez, C., Martn, A., Silniz, M., Serrano, S. 2010. Tcnicas bsicas de

Microbiologa. Observacin de Bacterias. Reduca (Biologa). Serie Microbiologa. 3

(5): 15-38. ISSN: 1989-3620.