UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 10
CONTROL DEL CRECIMIENTO POR AGENTES QUÍMICOS
Integrantes:
1. Alvarez Jijon, Jim Waldir
2. Ccahuay Ramirez, Diego Armando
3. Mendoza Sullon, Angie Marilyn
4. Tolentino Garriazo, Julio Cesar
5. Vindrola Muñoz, Natalia Sofia

Grupo (día/ hora) : A* Martes de 11am-1 pm

Fecha de la práctica :19 /06/18
Fecha de entrega del informe : 26/06/18

2018

I. Introducción
Existen agentes antimicrobianos que se encargan del control químico del crecimiento, ya sea
matando al microorganismos, como es el caso de bactericidas, fungicidas y viricidas; o
inhibiendo su crecimiento como: bacteriostaticos, fugistáticos, virustáticos.
Entre los agentes antimicrobianos se encuentran: Agentes esterilizantes son aquellos que
producen la inactivación total de todas las formas de vida microbiana o sea, su “muerte” o
pérdida irreversible de su viabilidad. Agentes desinfectantes o germicidas son agentes (sobre
todo químicos) antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patógenos
infecciosos de un material. Pueden en muchos casos suelen presentar efectos tóxicos sobre
tejidos vivos, por lo que se suelen emplear sólo sobre materiales inertes. Agentes antisépticos
son sustancias químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis o putrefacción de
materiales vivos. Se trata de desinfectantes con baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos
donde se aplican (Sánchez, 2005).
El método que se desarrolla a continuación es utilizado como análisis de susceptibilidad a los
fármacos, donde se mide la concentración inhibidora mínima, es decir, la mínima cantidad de
agente necesario para inhibir el crecimiento de un organismo control. (Madigan,2009)
En la vida cotidiana, doméstica o laboral, se utilizan un sinnúmero de compuestos químicos
para controlar el crecimiento de los microorganismos. Los detergentes y jabones que
utilizamos para la higiene corporal diaria, para el lavado de la ropa o de los utensilios de
cocina, tienen la finalidad de reducir la carga microbiana, inhibir el crecimiento de los
microorganismos de la superficie corporal o de la ropa o en el mejor de los casos, destruirlos.
En unidades especializadas como los laboratorios microbiológicos, hematológicos,
instalaciones industriales, entre otros, se utilizan agentes químicos en forma rutinaria para
controlar el crecimiento de microorganismos indeseados (Montoya, 2008).

El crecimiento microbiano no es el aumento de tamaño de una célula, en realidad se refiere

al número de células. Los microbios que se encuentran en la etapa de crecimiento aumentan
en cantidad y se agrupan en colonias, son grupos de células lo suficientemente grandes como
para ser observadas sin el uso de microscopio. Si se conocieran las formas de crecimiento
microbiano se puede determinar la forma de control de crecimiento de los microbios, como
también se puede aprender el modo de estimular el crecimiento de los microbios útiles.
Tortora (2007)

El objetivo de esta práctica es:

 ● Determinar el efecto bacteriostático de algunos agentes químicos como colorantes
básicos, desinfectantes y metales pesados.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Materiales
❖ Agar nutritivo en tubos(caliente)
❖ Cultivo en caldo nutritivo: Staphylococcus sp
❖ Discos de papel de filtro
❖ Placas estériles
❖ Pinzas
❖ Asa de kölle
❖ Mechero y fósforo
❖ Marcador indeleble
❖ Reactivos : a)soluciones colorantes :cristal violeta
(concentraciones 1/1000,1/5000,1/10000) , verde malaquita (concentraciones
1/1000,1/5000,1/10000), azul de metileno (concentraciones
1/1000,1/5000,1/10000); b) soluciones desinfectantes: fenol (concentraciones
0.5% , 1% y 3%) ; c)Soluciones de metales pesados : sulfato de
cobre(concentraciones 0.5% , 1% y 3%) y cloruro de
mercurio(concentraciones 0.5% , 1% y 3%).

2.2. Metodología
 ● En primer lugar dividimos nuestras tres placas petri con plumón indeleble y las
dividimos en 6 secciones cada placa, porque lo vimos más conveniente .

● Después colocamos dos asadas del cultivo de Staphylococcus sp(en el caso de nuestro
grupo) en los tubos de agar nutritivo que no deben estar tan calientes porque matarían
a las bacterias ni tan fría porque se solidificar el agar y homogeneizamos estos tubos
para tener una concentración regular de toda la bacteria en todo el tubo.

Figura 1: Inoculación de Staphylococcus sp en el medio de cultivo

● Se vertió el contenido de los tubos en las placas petri y se dejó enfriar.

Figura 2: Adición del medio inoculado sobre una placa petri

● En condiciones asépticas se cogió un disco de papel filtro con las pinzas y se
sumergió ligeramente en cada una de las soluciones (colorantes, desinfectantes y de
metales pesados) por un tiempo de 1 minuto por cada disco.

● Una vez que paso el tiempo de los discos en las soluciones lo colocamos sobre la
sección que rotulamos en la placa petri .
● Se repitió este procedimiento con cada uno de las soluciones y sus distintas
concentraciones y para los distintos colorantes.
 ● Se incubaron las placas a 37°C por 24 horas y se observó los resultados.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cuadro 1. Medición de halos de inhibición

Antiséptico o Concentración Bacillus sp E. coli Staphylococcus sp

desinfectante

A. Cristal violeta 1/1000 6mm 2mm 6mm

1/5000 2mm 1mm No se observó

1/10000 No se observó No se observó 4mm

B. Verde malaquita 1/1000 8mm 4mm 4mm

1/5000 6mm No se observó No se observó

1/10000 4mm No se observó No se observó

1/1000 0.5 mm 1mm No se observó

C. Azul de metileno
1/5000 No se observó No se observó 14mm

1/10000 No se observó No se observó 18mm

0.5 % 6mm No se observó 4mm

D. Fenol
1% 4mm No se observó No se observó

3% 2mm No se observó No se observó

0.5 % 3mm 5mm 2mm

E. Sulfato de cobre 1% 5mm 6mm 4mm

3% 1.1cm 9mm 8mm

F. Cloruro de Hg 0.5 % 1.9mm 2 mm 4.2mm

1% 2 mm 3.3 mm 3 mm

3% 2.8 mm 2.6 mm No se observó

4.1 Colorantes Catiónicos

A. Cristal Violeta
En el cristal violeta con microorganismos gram negativos (E.coli) se observó que estos son
pocos sensibles al cristal, en el lugar donde las concentración era 1/ 100 y en el lugar donde
las concentraciones era 1 / 1000 se tornó poco crecimiento alrededor de esta y en 1 /10000
crecieron sin excepción.
Según M. Burrows (1974), los colorantes se usan para teñir, y que muchos de ellos muestran
gran actividad bactericida en algunos microorganismos y otros no.
Esto lo podemos comprobar al observar el desarrollo de gram positivos )S. Aureus y Bacillus
sp) Al someterlo a consternaciones de 1 / 100 se observó que guardaba cierta distancia
alrededor del cristal Violeta lo que indica la sensibilidad al poder bactericida del cristal
violeta de este microorganismo, en concentraciones de 1 / 1000 y 1 / 10000 el crecimiento
fue más notable a menor distancia del cristal violeta, según el Tratado de Microbiología de
W. Burrows. "los gérmenes gran negativo en su mayor parte son menos sensibles a los
colorantes que los gran positivos”.

B. Verde de Malaquita
Se obtuvo como resultados la formación de los halos en las diferentes concentraciones el halo
formado transparente indica que la bacteria no ha crecido en esa zona entonces lo llamaremos
halos de inhibición, se observa en el cuadro 1 que a mayor concentración el halo es mayor
pero esta varía según la bacteria para Bacillus sp. la formación del halo es mayor a
comparación de Echerichia coli. y Staphylococcus sp. , en estas últimas la formación de halo
solo se dio a la mayor concentración (1/1000). El verde malaquita es un colorante catiónico
actúa de forma toxica para la célula y su efecto se verifica según cuanto inhibe, a mayor
longitud de halo mayor será la inhibición de la bacteria y en Bacillus sp.es que ocurre mayor
inhibición, pero en estas bacterias a menor concentración solo actúa como bacteriostáticos.
Este colorante reacciona con los ácidos nucleicos y por eso son tóxicos y letales para la
célula, interfieren en la síntesis de acidos nucleicos y proteínas (acridina) o interfieren en la
síntesis de la pared celular (derivados del trifenilmetano). Wistreich y Lechtman (1989),
menciona que principalmente los colorantes derivados del trifenilmetano como el verde de
malaquita, el cristal violeta y el verde brillante, tienen alto poder destructor contra bacterias
Gram positivas. El verde malaquita es un colorante verde activo frente a una gran variedad de
parásitos externos y agentes patógenos como hongos, bacterias, etc.
C. Azul de Metileno
Se observa en el cuadro 1 que para este colorante catiónico a la bacteria que mayor inhibe es
a Staphylococcus sp. y a las concentraciones menores (1/5000 y 1/10000). Para Bacillus sp.
y Echerichia coli. Solo se forma halo en la de mayor concentración (1/1000) y el halo del
segundo es mayor que la del primero. Granados y Villaverde (2003), indica que el azul de
metileno o cloruro de metiltionina es el colorante empleado como tintura para pigmentar
algunas partes del cuerpo durante la realización de la cirugía. Su uso es como antiséptico del
tipo bacteriostático, cauterizador interno, queratoplastico, cicatrizante y antipuriginoso, pero
no bactericida salvo en raras ocasiones, siendo poco irritable a nivel local. Es uno de los
primeros colorantes antisépticos usados, es un colorante germicida débil y se utilizó como
antiséptico urinario por su acción demasiado débil. Willey (2009) menciona que en su
mecanismo de acción presenta acción oxido- reductora y la propiedad de colorear tejidos.
Este colorante no es bactericida, al 1% se comporta como bacteriostático frente a Escherichia
coli, Staphylococcus aureus.

4.2 Solvente
D. Fenol
Carpenter,(1969) menciona que el fenol es rápidamente un
bactericida a bajas concentraciones, causando: daños a membranas,
con pérdida de constituyentes citoplásmicos;inactivación
irreversible de oxidasas y deshidrogenasas de membrana;
desnaturalización de proteínas. Tienen baja solubilidad en agua,
por lo que se emplean en fórmulas que incluyen agentes
emulsificadores (jabones) que, además, aumentan su actividad.
Depende de la concentración: A bajas concentraciones (≤1%) tiene
acción bacteriostática. Joklik et al.(1994) señala, a elevadas concentraciones es
bactericida; inactiva de forma irreversible sistemas enzimáticos esenciales (oxidasas y
deshidrogenasas de membrana), desmorona la pared celular y precipita proteínas celulares. El
tiempo de actuación oscila entre 15-20 minutos. Espectro de actividad Antiséptico y
desinfectante eficaz frente a bacterias Gram positivas(Bacillus sp y S.aureus) y Gram
negativas(E.coli), pero la acción de inhibición no pudo ser demostrada en el caso de E.coli,
porque no se produjo ninguna distancia entre fenol y microorganismo. El fenol tiene
importancia histórica en el desarrollo de técnicas quirúrgicas sépticas. Actualmente se utiliza
otros desinfectantes más eficaces y activos a concentraciones mucho más bajas. Los
compuestos fenólicos, como el ácido fenólico como el ácido fenico puro, son bactericidas o
bacteriostáticos dependiendo de la concentración a la cual, se usen.

4.3 Sales (desinfectantes)

E. Sulfato de Cobre
Se observó que tanto Bacillus sp, E. coli y Staphylococcus sp mostraron ser sensibles ante el
sulfato de cobre:
Para una concentración de 0.5% de sulfato de cobre el mayor halo de inhibición fue de 5mm
para la bacteria E. coli. Así mismo, para una concentración de 1% de sulfato de cobre el halo
de inhibición sigue siendo mayor para E. coli. Por lo que se podría considerar que este
desinfectante tiene mayor facilidad para inhibir el crecimiento de E. coli. Sin embargo, para
una concentración de 3% de sulfato de cobre se muestra un halo de inhibición superior para la
bacteria Bacillus sp por lo que se podría decir que para esta concentración Bacillus sp no
tiene posibilidad de crecimiento adicional.

La literatura científica cita la eficacia del cobre para inactivar muchos tipos de bacterias,
entre las que se incluyen: E. coli, Stahylococcus aureus, Bacillus megaterium y Bacillus
subtilis.
Los mecanismos antimicrobianos del cobre son diversos y complejos, se presenta dentro de
las células como en los espacios intersticiales entre células. El cobre, al ser metal, tiene la
capacidad de donar o aceptar electrones (alta oxidación catalítica y alto potencial de
reducción). Esta propiedad permite que los iones de cobre alteren a las proteínas dentro de las
células de los microbios, desnaturalizándolas y por lo tanto impidiendo que estas puedan
realizar sus funciones normales. También se ha observado que el cobre es responsable de
inhibir el transporte electrónico en las interacciones de la pared celular, ligando el ADN y
desordenando la estructura. Debido a esto y otros mecanismos, el cobre también puede
inactivar hongos y virus.1
Cabe resaltar, que se requiere de condiciones específicas para que el cobre pueda eliminar
microbios o evitar su crecimiento adicional. Entre los factores que influyen en su eficacia se
encuentra la temperatura, humedad, concentración de iones cobre y el tipo de
microorganismo.
Sanchez y Saldaña (2005), mencionan que las sales de cobre se prescriben todavía en
terapéutica dermatológica. Siendo la más utilizada el sulfato de cobre al 1:1000 por ser
astringente, secante y antiséptico, usándose en forma de fomento.

F. Cloruro de Mercurio
El cloruro de mercurio es toxico y de uso limitado, con propiedades antisépticas. En solución
al 0,1% fue muy usado como desinfectante potente, pero es muy tóxico, y apenas se emplea
en la actualidad. (Korolkovas y Burckhalter, 1983)
Según Sanchez-Saldaña y Saenz (2005), los antisépticos mercuriales tienen una acción
esencialmente bacteriostática y fungistática, pero de escasa potencia, que se debe a la acción
precipitante de las proteínas presentes en el protoplasma bacteriano, al combinarse con los
grupos sulfidrilos (SH-). Su espectro de acción es más pronunciado sobre las bacterias
grampositivas que sobre las bacterias gramnegativas, además tiene acción sobre el
Pityrosporum ovale. Su uso en la actualidad es limitado por ser sumamente tóxicos. Se han
usado tópicamente sobre la piel, en forma de pomada, al 5% o 10%, una a dos veces al día. El
óxido amarillo de mercurio, al 1% y 2%, se ha indicado en piodermitis; el precipitado blanco
de mercurio, del 1% al 5%, es menos irritante, se usa principalmente en el tratamiento de la
psoriasis y dermatitis seborreica. El cloruro de mercurio, en solución al 0,1%, fue muy usado
como desinfectante potente, indicado en la pitiriasis versicolor con pocas lesiones, pero es
muy tóxico, no se puede usar en áreas extensas de la piel y apenas se emplea en la actualidad
Con lo señalado por Faddin (2003), se deduce que a concentraciones mayores de 1% el
experimento ha tenido que formar halos de inhibición. Siendo el caso para B. cereus se
puede observar que el halo de inhibición de la concentración de 0.5% es de 1.9 mm, el cual
no presenta tanta sensibilidad respecto a mayores concentraciones, como en el cloruro de
mercurio de 1% y 5%, de 2 mm y 2.8 mm respectivamente.
Sea el caso de E. coli vemos la formación de halo respecto a la relación cloruro de mercurio y
concentración no es directamente proporcional con el halo sino que la concentración del 3%
es menor que la concentración de 1% pero mayor que el cloruro de mercurio 0.5%; debido a
la mala manipulación del agar 3% donde se nota la contaminación de microorganismos.
El Staphylococcus aureus se puede inhibir mejor usando algún metal pesado a bajas
concentraciones, es decir se observa un mayor halo de inhibición en la concentración de
0.5% de aproximadamente 4.2 mm, mientras que en la concentración de 1% este se desarrolla
en 2 mm.

V. CONCLUSIONES
- Se concluye que el cristal violeta y el verde de malaquita tienen alto poder de
inhibición contra las bacterias gram positivas Bacillus sp y Staphylococcus sp;
mientras que el azul de metileno se comportó como bacteriostático frente a E.
coli y Staphylococcus sp.

- Las sales como HgCl2 y Cu2SO4 no pueden ser usadas como antisépticos por
ser tóxicas. Ambas sales mostraron inhibición para Bacillus sp, E. coli y
Staphylococcus sp, presentando el mayor poder de inhibición a una
concentración de 3%, especialmente para Bacillus sp.
III. RESULTADOS
Cuadro 1. Resultados de los factores químicos que afectan el crecimiento de
microorganismos.
Antiséptico o Staphylococcu
desinfectante Concentración Bacillus sp E. coli s sp
1/1000 +++ no no
1/5000 ++ no no

Cristal Violeta 1/10000 ++ no no

1/1000 ++ no no
1/5000 + no no

Verde de malaquita 1/10000 + no no

1/1000 no no 1,58cm
1/5000 no no 1,4 cm

Azul de metileno 1/10000 no no no

0,50% + no no
1% no no no

Fenol 3% + no no
0,50% + + 1,5 cm
1% + ++ 1,73cm

Sulfato de cobre 3% + +++ 2,13cm

0,50% + ++ 2,4cm
1% + ++ 2,57cm

Cloruro de Mercurio 3% ++ +++ 2,86 cm

 Figura 3 Staphylococcus sp utilizando sulfato de cobre y fenol como antiséptico

Al utilizar el desinfectante de sulfato de cobre se forma un halo el cual tiene un diámetro

proporcional a la concentración del desinfectante. Es decir, mientras mayor concentración, el
halo es de mayor tamaño.

Figura 4: Staphylococcus sp utilizando azul de metileno y cloruro de mercurio como

antiséptico

Los halos formados por el cloruro de mercurio son de mayor tamaño y más notorios que los
que se formaron con el azul de metileno. En ambos casos el diámetro es proporcional a la
concentración del antiséptico.
Figura 5: Staphylococcus sp utilizando Verde de malaquita y cristal violeta como
antiséptico

No se formó halo al utilizar el desinfectante de verde malaquita ni el cristal violeta en

ninguna de sus concentraciones.

IV. DISCUSIONES

El principio que cumple esta práctica se basa en que el agente antimicrobiano se difunde
desde el disco hasta el agar generando una zona de inhibición. El diámetro de esta zona es
directamente proporcional con cuatro factores: la cantidad de agente antimicrobiano, la
solubilidad del agente, el coeficiente de difusión y la eficacia total del agente. (Madigan,
2009). Es por eso que en nuestro resultados se puede notar que el aumento del diámetro del
halo está relacionado directamente con la concentración del antiséptico. Una mayor
concentración del antiséptico, generará un mayor diámetro.

También se puede notar que las bacterias gram positivas son las que se encuentran más
afectadas por los agentes antimicrobianos, en comparación con las gram negativas. Esto se
debe a la composición de la pared celular, las gram negativas cuentan con una membrana
externa que les da una mayor resistencia. Sin embargo, este no es el único factor que
interviene.

Los agentes antimicrobianos cumplen un rol en la inhibición del crecimiento:

Los colorantes básicos que se han utilizados como antisépticos son :
● Cristal violeta, es un derivado del trifenilmetano, cuyo mecanismo se basa en la
alteración de ácidos nucleicos cuando se incorpora el grupo fosfato.
● Verde malaquita, es un derivado de la anilina.
● Azul de metileno
Son muy selectivos hacia las gram positivas, mientras que las gram negativas suelen ser
resistentes por su membrana externa. El efecto antibacteriano se debe a la base que es más
lipofílica con respecto al catión, lo cual le permite ingresar al interior de la célula ,donde se
une a los grupos fosfatos de los ácidos nucleicos.(Enrique Iañez. 2007) La acridina, es una
proteína, se inserta entre dos bases sucesivas del ADN y los separa generando errores en la
duplicación del ADN.(Sánchez Leonardo , Sáenz, Eliana.2005) .
En nuestro resultados se puede ver que el Bacillus sp es más susceptible al efecto antiséptico
de los colorantes básicos que el Staphylococcus sp. También , se puede percibir una mayor
reacción antimicrobiana por parte del cristal violeta a la cual le sigue el verde de malaquito y
finalmente el azul de metileno. Esto puede ser explicado por la reactividad de cada colorante.
Al analizar el caso del Bacillus sp se puede deducir que el cristal violeta es el colorante más
reactivo mientras que el azul de metileno es el de menor reactividad.

El fenol es desinfectante
● Fenol, puede actuar como un antiséptico rompiendo la membrana citoplasmática o
como desinfectante al desnaturalizar proteínas. Dependiendo de su concentración.
(Madigan,2009)
Al ser un desinfectante se encarga de destruir al microorganismo y solamente se puede usar
en objetos inanimados. De acuerdo con nuestros resultados, se puede decir que el fenol tiene
un efecto de menor magnitud que los colorantes básicos, ya que solo se formó el halo el
bacillus sp y no en el staphylococcus sp.Además el diámetro del halo no es tan gran grande
como el caso de los colorantes básicos.

Metales pesados actúan como antisépticos o desinfectantes:

 ● El sulfato de cobre es un algicida en piscinas, ya que precipita las proteínas por lo que
es catalogado como un antiséptico
● Cloruro de mercurio es un metal pesado usado en la antiguedad,el cual forma
mercáotidos con los grupos SH de la cisteína,son muy efectivos, pero al mismo
tiempo generan una alta toxicidad. (Enrique Iañez, 2007)
Los metales pesados cumple un rol antimicrobiano más efectivo, al comparar con los casos
anteriores. Esto se demuestra ya que según nuestros resultados, el ambos metales han podido
inhibir el crecimiento de una gram negativa, específicamente, E. coli. Siendo el cloruro de
mercurio el metal que generó una mayor zona de inhibición al interactuar con la bacteria
Staphylococcus sp y con la E. coli.

Algo extra que debemos tener en cuenta al momento de realizar la práctica, es el tiempo se
toma al enfriar el agar nutritivo. Un error que cometió nuestro grupo fue la solidificación del
agar debido a que nos excedimos en el tiempo de colocar el agar en la placa. Sin embargo,
también se debe de evitar colocar el agar muy caliente porque puede llegar a matar a las
bacterias y así afectar en nuestros resultados.Es por eso que el agar no debe estar tan caliente
ni tan frío.
Figura 6: agar solidificado
V. CONCLUSIONES

● El efecto inhibidor o desinhibidor de un componente químico, depende de la

concentración y de la cantidad que se deposite sobre el microorganismo.
●
El lugar donde interfere cierto componente, en el medio, actuando como
barrera. Ya sea, inhibiendo la síntesis de la pared celular (acelerando la
degradación), alterando la permeabilidad selectiva de la membrana
citoplasmática y/o Desnaturalizando las proteínas.

VI. BIBLIOGRAFÍA
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del área de la biología. Universidad Nacional del Nordeste.
● Madigan,M.T; Martinko, J.M.; Parker, J. 2007. Brock: Biología de los
Microorganismos. 8va edición. Prencice Hall.
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● MONTOYA, H. (2008). Microbiología básica para el área de la salud y afines.
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