“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE
SANTA MARÍA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS
BIOQUÍMICAS Y
BIOTECNOLÓGICAS

Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica

ASIGNATURA
Bioquímica I – Práctica

PRÁCTICA
Enzimas II

DOCENTE
Dra. Medina Perez Jeaneth Marisol

SUBGRUPO Nº 1
Integrantes
1º Arenas Villacorta Alejandro Tomas
2º Condori Nina Violeta Hilda
3º Flores Choquetico Karina Lizbet
4º Tunquipa Fernandez Alessandro Wilber

Horario y Grupo: Jueves 7:00 AM – 10:00 AM / 02

PRÁ CTICA Nº 9
ENZIMAS II

RELACION DE EXPERIMENTOS.
Universidad Cató lica de Santa María
E.P. Farmacia y Bioquímica

1. Efecto de la concentració n de sustrato (urea) sobre la velocidad inicial.

2. Efecto de la temperatura sobre la velocidad inicial.
3. Efecto del pH sobre la velocidad inicial
4. Efecto de la concentració n de la enzima (ureasa) sobre la velocidad inicial.

OBJETIVOS

1. Caracterizar los factores que afectan la velocidad inicial de las reacciones

enzimá ticas, tales como la concentració n de sustrato, la temperatura, el pH y la
concentració n de la enzima.
2. Interpretar las curvas cinéticas obtenidas con cada uno de los factores
mencionados.

EXPERIMENTO 1.
INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÖ N DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD INICIAL.

Se hará un experimento donde se tengan varios tubos con diferente concentració n de

sustrato, midiendo la velocidad inicial en cada tubo.

Usar las mismas condiciones que en el experimento 2 de la prá ctica anterior, pero
habrá que usar varios tubos: por ejemplo 6 tubos con diferentes concentraciones de
sustrato, éstas pueden variar entre 0.003 M y 0.06 M. Calcular cuá ntos ml. de solució n de
ú rea 0.3 M se deberá medir para cada sistema. Se usará la misma cantidad de enzima que
en el experimento anterior y calcular cuá nto de buffer fosfato pH 7.4 le deberá
corresponder a cada sistema.

No olvide que cada tubo o sistema tiene un volumen total de 3.0 ml. y deberá usar un
tubo o sistema blanco o control.

Proceda a completar la siguiente tabla:

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Siga los mismos pasos que para el experimento 2 de la prá ctica anterior. Al final
determinar el amoniaco a través de la reacció n del Nessler.

EXPRESION DE RESULTADOS.
Complete la tabla de arriba, expresar la velocidad inicial en nanomoles por minuto. Para
los cá lculos puede usar los datos de la tabla o los que haya obtenido en su experimento.
En el espacio siguiente y usando papel milimetrado haga el ploteo de Michaelis-Menten.

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Haga el Ploteo de los inversos 1 / Vi frente a 1 /(S) (lineweaver – Burk) en papel

milimetrado y utilice el siguiente espacio:

Dependiendo del tiempo disponible, puede hacer otros tipos de Ploteo.

Calcular:

EXPERIMENTO 2.
INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD INICIAL
En este experimento se examinará el efecto de por lo menos cinco temperaturas sobre la
velocidad inicial. Se trabajará con las siguientes temperaturas:
Bañ o de hielo : 0 A 4 ºC Bañ o María : 50 ºC
Agua T. Ambiente : 20 ºC Bañ o hirviente : 92 – 96 ºC
Bañ o María : 37 ºC

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En cada temperatura usar un sistema igual al del experimento anterior. Proceder de la

misma forma. Hacer un blanco para cada temperatura; no obstante, si hay limitaciones en
el material es importante hacer solamente el blanco de las temperaturas de 50 ºC y bañ o
hirviente.

Expresió n de Resultados.

1. Complete la siguiente Tabla:

Puede trabajar con estos datos o con los obtenidos en el experimento.

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2. Utilizando papel milimetrado, haga la grá fica del ploteo velocidad inicial versus
temperatura y péguelo en el espacio siguiente:

3. Estimar lo siguiente:
Temperatura ó ptima de la ureasa : 37 ºC Q10 : 1.82

EXPERIMENTO 3.

INFLUENCIA DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD INICIAL.

Se examinará la velocidad inicial a diferentes pH. Se preparará diferentes sistemas o tubos

con diferentes pH, que pueden variar entre 6.2 y 8.2 . Se usará n las mismas condiciones
que en el experimento 2 de la prá ctica anterior, solamente que en cada pH se deberá usar
diferentes buffer fosfato. Se recomienda un blanco para cada pH; pero si esto no es posible,
usar blancos para los sistemas que crea conveniente.

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Expresió n de Resultados.

1. Calcular la velocidad inicial para cada pH y anotarla en la siguiente Tabla.

2. Hacer un ploteo de velocidad inicial versus pH, utilizando el espacio siguiente.

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Completar:
El pH ó ptimo de la ureasa es: 7,4

EXPERIMENTO 4.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA SOBRE LA VELOCIDAD INICIAL.

En este experimento se examinará el efecto de por lo menos 4 concentraciones de enzima.
Para tal efecto se puede usar las siguientes concentraciones de enzima ( ureasa ): 5, 10, 15
y 20 g / ml. Tener en cuenta que el volumen total de cada sistema es de 3 ml. ; es decir,
las mismas condiciones que en los experimentos anteriores, solamente que en cada tubo
hay diferente concentració n de enzima.

Expresió n de resultados.

1. Complete la tabla siguiente, anotando la velocidad inicial en nmoles/minuto que

corresponde a cada concentració n de enzima.

* Agua destilada.
2. Usando papel milimetrado, haga el ploteo de la velocidad inicial ( Vi ) frente a la
concentració n de la enzima ( E ) y péguelo en el espacio indicado abajo. Puede trabajar con
los datos señ alados en la Tabla o con los obtenidos en su experimento.

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INTERROGANTES.

1. ¿Qué es la KM y que importancia y significado tiene? En que unidades se la expresa.

KM es la constante de Michaelis-Menten que expresa la concentració n de sustrato con
la que se alcanza la mitad de la velocidad má xima de una reacció n. Esta es muy
importante ya que es inversamente proporcional a la afinidad de la enzima por el
sustrato. Se expresa como Katal, pero es una unidad muy grande de modo que se usa
la unidad de actividad enzimá tica (UI).
2. ¿Qué es la velocidad máxima? En que unidades se le expresa.
Es la velocidad a la cual todos los centros activos de las enzimas se encuentran
trabajado sobre un sustrato en específico (complejo enzima sustrato). Se expresa
como unidad de actividad enzimá tica (UI).
3. ¿Có mo se explica el efecto de la temperatura sobre la velocidad inicial de una enzima?
¿Qué es temperatura ó ptima?
Al ser las enzimas proteínas, tienden hacer sensibles a la temperatura. A bajas
temperaturas, la mayor parte de las enzimas tienen poca actividad enzimá tica, ya que
no hay suficiente cantidad de energía para que tenga lugar la reacció n catalizada. No
obstante, al incrementar la temperatura, lo que se provoca es el aumento de la energía

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cinética de las moléculas, por lo que las moléculas de sustrato empiezan a colisionar
con el sitio activo de las enzimas con mayor probabilidad, hasta llegar a la
temperatura ó ptima. Por encima de esta temperatura, las enzimas empiezan a perder
su acció n catalítica, se va desnaturalizando. La temperatura optima es la temperatura
donde se da la mayor la actividad enzimá tica.
4. ¿Có mo se explica el efecto del pH sobre la velocidad inicial de una reacció n
enzimá tica?¿Qué es pH ó ptimo?
Las enzimas poseen grupos químicos ionizables, (carboxilos, aminas, tiol, etc.), que
segú n el pH del medio pueden tener carga negativa, positiva o neutra. Entonces, el
efecto del pH ocasionara grandes cambios en la velocidad inicial de la actividad
enzimá tica, ya que se modificará n las cargas haciendo que la actividad enzimá tica
incremente hasta llegar a un pH ó ptimo, en donde se dará la mayor actividad
enzimá tica, por encima de este pH la acció n catalítica de la enzima ira disminuyendo.
El pH ó ptimo es el pH en el cual se da la mayor actividad enzimá tica.
5. ¿Có mo explica el efecto de la concentració n de las enzimas sobre la velocidad de
reacció n que catalizan?
En una disolució n acuosa, el movimiento molecular hace que las moléculas de sustrato
colisionen con la enzima, formando un complejo enzima sustrato. Conforme se
incrementa la concentració n de sustrato, las colisiones se dan con mayor frecuencia
aumentando la velocidad de reacció n, en ese caso se habla de una reacció n de primer
orden. Sin embargo, el incremento de la velocidad enzimá tica solo tendrá lugar hasta
que se logren ocupar todos los sitios activos de las enzimas; sí se incrementa la
concentració n del sustrato, las enzimas estará n saturadas, por lo que la velocidad no
dependerá de la concentració n de sustrato, de modo que será una reacció n de orden
cero (estacionario), y se habrá llegado a la velocidad má xima
6. ¿Qué otros factores pueden influenciar sobre la velocidad de una reacció n enzimá tica?
- Concentració n de enzimas: mayor concentració n de enzimas mayor velocidad de
reacció n.
- Salinidad: afecta el potencial ió nico y en consecuencia pueden interferir en
algunos enlaces de la enzima.
- Activadores enzimá ticos: las enzimas requieren de cofactores para activarse, por
lo que el tipo de cofactor ayudara a mejorar su acció n catalítica.
- Inhibidores enzimá ticos
- Inhibidores reversibles
- Competitivo, semejanza estructural con el sustrato, reduce la actividad enzimá tica.
- No competitivos, no hay semejanza estructural con los sustratos, no compiten con
los mismos por lo que disminuyen la velocidad máxima de reacció n.
- A competitivo, estabilizan el complejo enzima sustrato impidiendo la formació n
del producto, se disminuye tanto Km como la velocidad má xima de reacció n.
- Inhibidores no reversibles: son específicos para cada enzima y no inactivan a
cualquier proteína. Funcionan uniéndose covalentemente a la enzima de modo
que alteran la estructura del sitio activo evitando así la unió n entre enzima
sustrato.

7. ¿El pH y la KM puede ser afectados por la temperatura?

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Sí, el pH al ser una medida de la cantidad de iones hidró genos presentes en una
solució n se verá afectada por el incremento de temperatura, puesto que aumentará la
solubilidad y la disociació n de las sales, ácidos y bases; incrementando la
concentració n de iones en la muestra. Ademá s, se disminuirá la viscosidad lo que hará
que incremente la movilidad de los iones. KM también se verá afectado, pero
dependerá de la reacció n, es decir si la formació n del complejo enzima sustrato es
exotérmica el valor de KM aumentara con la temperatura, en cambio sí es
endotérmica, KM se reducirá con la temperatura.
8. ¿Si alcanzada la velocidad má xima, se aumentara má s enzima qué ocurre?
Sabiendo que la velocidad má xima se mide cuando se desaparece el sustrato o aparece
el producto o cuando todos los centros activos está n ocupados, entonces si se
aumentara má s enzima a una reacció n en donde ya no hay sustrato, no habrá reacció n
catalítica, no sucederá nada, pero sí aú n existe concentració n de sustrato las enzimas
catalizaran estos sobrantes, hasta que éstas se saturen o hasta que se haya
transformado todo el sustrato en producto.

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