BIOTECNOLOGA

JUAN PABLO MIRANDA BECERRA

SERIN PROTEASA: SUBTILISINA

Ec. 3.4.22.61
La subtilisina es una proteasa alcalina que hidroliza los enlaces peptdico de las protenas, se utiliza como biodetergente entre sus aplicaciones ms importantes logrndose que con menor cantidad de detergente sea retirada mayor cantidad de materia orgnica.

FICHA TCNICA
Las serin proteasas tienen una triada cataltica de serina, aspartato e histidina in comn. En las subtilisinas el sitio activo cuenta con una red de carga de participacin Asp-32, His-64, y el sitio activo Ser-221 dispuestos en una trada cataltica. La enzima se caracteriza por la secuencia de aminocidos y la estructura tridimensional que representa una protena globular tpica de la estructura -hlice/-lmina Tienen un tamao de aproximadamente 27 kDa, que consiste de 269 a 275 aminocidos

Nombre: Subtilisina

Ec. 3.4.22.61

Reaccin:

La hidrlisis de las protenas con una amplia especificidad para enlaces

peptdicos, y una preferencia por un gran residuo no cargado en P1. Hidroliza amidas de pptidos

Otros nombres:
alcalasa Alcalasa 0.6L Alcalasa 2.5 enzima ALK bacillopeptidasa A bacillopeptidasa B Bacillus subtilis proteinasa alcalina bioprase bioprase AL 15 bioprase APL 30 colistinasa subtilisina J subtilisina S41 subtilisina Sendai subtilisina GX subtilisina E subtilisina BL genenasa I esperasa Maxatase Thermoase PC 10 proteasa XXVII Thermoasa Superase subtilisina DY subtilopeptidasa SP 266 savinasa 8.0L savinasa 4.0T Kazusasa proteasa VII Opticlean Savinase Savinase 16.0L Savinase 32,0 L EX orientase 10B proteasasi

Caracteristicas principales Accin:

Degradadora de protenas y pptidos; pH ptimo: valores de pH de 8.5 a 9; pH estabilidad: en rangos de pH de 5.5 a 10.5 Temperatura ptima: aproximadamente 50C

Aplicaciones
Detergentes Curtidura Cosmticos Procesamiento de alimentos Ungentos cuidados de la piel Contacto con limpiadores de lentes investigacin en la qumica orgnica sinttica

Proceso de Produccin:
Es producido por fermentacin utilizando cepas microbianas del gnero Bacillus. Las especies pueden ser Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis , Bacillus lentus , u otros bacilos , cada uno produciendo su propia variante de la molcula de subtilisina . Aunque la estructura primaria de la protena enzimtica es diferente en cada variante, la estructura terciaria global, que determina la actividad cataltica, es la misma. En grandes tanques de 10 000 a 100 000 L de capacidad se cultivan los productores de enzimas. El nutriente contiene: Almidn degradado de antemano (5 a 15%) como fuente de carbono y fuente de energa 2 a 3% de harina de habas de soja como fuentes de protena 2 % de albmina de leche o de gelatina como fuentes nitrgeno Fosfato para la estabilizacin del grado de acidez pH. Esterilizacin con vapor 20-30 minutos a 121C Enfriamiento a temperatura de cultivo 30-60C. pH neutro y cultivo bien aireado Se genera un cultivo puro de Bacillus licheniformis se inyecta primero en matraces en agitacin con medio de cultivo. El cultivo inyectado [inculo] se coloca en un biorreactor ms pequeo (1050 Lt y generalmente se almacena en otro cultivo en volmenes de unos 500 a 1OOO L antes de ser Inyectado al reactor de produccin. Las bacterias usan primero las fuentes de nitrgeno fcilmente utilizables del medio; antes de 1020 horas se puede analizar en el medio la proteasa subtilisina. La a-amilasa colocada de antemano para la posterior degradacin del almidn desaparece ms tarde, mientras que la produccin de proteasa sigue mientras haya protenas en el medio. Para no poner en peligro el producto deseado debido a la asentacin de otros microbios, el contenido del biorreactor se enfra rpidamente a unos 5 C. Se separan las clulas (aproximadamente 100 gL-1) tras unos preparativos mediante centrifugacin o filtracin. Las proteasas del sobrenadante del cultivo se concentran finalmente mediante ultrafiltracin. En sta, las membranas sirven de unidades de separacin, pues tienen poros tan finos que no pueden pasar las molculas disueltas, como las proteasas, a pesar de poder pasar agua y las sales disueltas y otras pequeas molculas. Con ello la proteasa se concentra diez veces. Los preparados enzimticos secos pueden separarse por precipitacin, pero preferentemente se hace por evaporacin. Para ello se coloca la disolucin que contiene las enzimas en un flujo de aire caliente, de modo que el agua se evapore rpidamente. Se originan partculas de 0,5 a 2 mm de tamao. Para conseguir un preparado libre de polvo se aade material inerte y materiales creos para, por ejemplo, incorporar polietilenglicol y arraigar la enzima seca sobre ellos (perlas) o cubrirla.ii

Mecanismo de accin:

La unin del sustrato

El carbono del enlace carbonilo es atacado por la serina del sitio activo. La formacin de un intermedio tetradrico.

Estabilizacin tetradrico intermediario.

Este estado de transicin se estabiliza por puentes de hidrgeno a la columna vertebral de la serina 221 y la cadena lateral de la asparagina 155

Esta transicin de estado se desintegra como un protn es donado desde el sitio activo de histidina 64 al grupo amina en el sitio de escisin del sustrato a liberar el primer producto de la reaccin y la formacin simultnea de la intermediario covalente acil-enzima.

La enzima se desacilada por ataque nucleoflico por agua, seguido por la formacin de otro intermediario tetradrico que tambin se estabiliza por puentes de hidrgeno a la enzima.iii

Esto se desintegra con la transferencia de protones a la histidina del sitio activo y la liberacin del segundo producto peptdico. Con respecto a la tercera miembro de la trada catalica, aspartato 32, hay otro rasgo caracterstico de las proteasas de cerco una resonancia entre su carboxilato e

histidina 64 mediada por un enlace de hidrgeno.

BIBLIOGRAFIA:
i

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/21/62.html BIOTECNOLOGIA PARA PRINCIPIANTES REINHARD RENNEBERG , REVERTE, 2008 iii Protein Science 1997 March; 6(3): 501523. PMCID: PMC2143677 Subtilases: the superfamily of subtilisin-like serine proteases. R. J. Siezen and J. A. Leunissen
ii