LABORATORIO DE ANALISIS INSTRUMENTAL

GISELL MEJIA

GUSTAVO ROJAS

ANGELICA TULANDE

PROFESOR: FERNANDO CASTRO

UNIVERSIDAD DEL ATLNTICO

FACULTAD DE QUMICA Y FARMACIA

 CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA

1.)

2.)

Sistema de suministro y almacenamiento de fase mvil: Garantiza la disponibilidad

de fase mvil al sistema en condiciones apropiadas, de modo que se evite la contaminacin
y la degradacin de la misma

Sistema de bombeo: Todos los sistemas HPLC incorporan un sistema de bombeo, con
las siguientes caractersticas:

Debe ser capaz de gestionar altas presiones, de hasta 400 atm., Mantener un flujo libre
de pulsos, Proporcionar caudales constantes y reproducibles, Permitir cambios de
disolvente de modo simple y rpido, Ser qumicamente inerte y resistente a la corrosin.

Sistema de inyeccin de muestra: La inyeccin de un volumen de muestra preciso, y

muy pequeo (5-500 L), debe hacerse a la entrada de la columna en un breve periodo de
tiempo para perturbar lo menos posible el rgimen de circulacin de la fase mvil y evitar el
ensanchamiento de banda. Cuando la vlvula gira hacia la posicin de inyeccin de la
derecha, la fase mvil arrastra la muestra hacia la columna. El objetivo de utilizar este tipo
de vlvulas es de no interrumpir el flujo de fase mvil a travs de la columna e introducir en
el flujo de la misma un volumen de muestra que estar contenida en un tramo de tubera de
volumen fijo.
 Columna cromatografa: La separacin se lleva a cabo dentro de la columna, por lo
tanto, se puede decir que la columna es el corazn de un sistema

Detector: Los detectores empleados en HPLC se han diseado, adaptado y perfeccionado

con el fin de incorporar celdas de flujo que permitan medir las bajas concentraciones de
analito que hay en el lquido. Los distintos detectores se clasifican segn se encarguen
de medir una propiedad del soluto o de la disolucin

3.)

Tiempo cero o tiempo de retencin del componente inerte (t0).

El tiempo cero (t0) o tiempo muerto (tm), es el tiempo de retencin del componente inerte o
gas portador.

Tiempo de retencin de un componente (tii).

El tiempo de retencin (ti o tR) es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce
la mezcla y el instante en que se detecta la seal propia del componente en su mxima
intensidad. Los tiempos de retencin no son reproducibles, ni siquiera en una misma columna
cromatogrfica.

Tiempo de retencin corregido de un componente (t'i).

Es le tiempo que transcurre entre la aparicin de la saal que corresponde a un componente

inerte y a la del componente considerado:

t'i = ti - t0

Tiempo de retencin relativa (rip).

Es la razn entre los tiempos de retencin corregidos del componente considerado, i, y de

otro, p, que se toma como patrn de referencia.

Volumen de retencin de un componente (VR).

Es el volumen necesario de fase mvil para transportar el soluto de un extremo a otro del
sistema cromatogrfico.

Volumen cero o muerto (V0 o Vm).

Es el volumen de eluyente que se consume sin que se detecte ningn componente. Se define
igual que el volumen de retencin pero el tiempo utilizado es el tiempo muerto.

Volumen de retencin verdadero (V'R).

El volumen de retencin verdadero de un componente es la diferencia entre el volumen de

retencin del componente y el volumen muerto.

Coeficiente de particin o de reparto de un componente (K).

Se define como el cociente entre la concentracin de componente presente en la fase

estacionaria y la concentracin de componente presente en la fase mvil.

Velocidad lineal media a lo largo de una columna (u).

Es la velocidad lineal media a la que se desplazan las molculas de soluto a lo largo de una
columna.

Factor de selectividad ().

Es la relacin entre los tiempos de retencin de dos componentes:

donde es el factor de selectividad, tRy y tRxson los tiempos de retencin de los

componentes x e y , y Kx y Ky son los coeficientes de distribucin de los componentes.
Dependiendo del valor de se tiene una idea aproximada de como ser la separacin
cromatogrfica:

> 2 se obtiene una mala separacin ya que son necesarios periodos muy largos para
realizarla.

1< <2 se obtiene una buena separacin cromatogrfica.

Factor de capacidad (K').

El factor de capacidad relaciona volmenes o tiempos de retencin de un componente

respecto a la fase mvil

Eficiencia

Para definir la eficacia se utiliza el concepto de piso terico, y se define ste como la seccin
terico-transversal en la cual se realiza el equilibrio de particin durante el flujo de fase
mvil. Cuanto mayor es el nmero de platos terico (N) mayor ser la eficiencia de la
columna.

Resolucin (R o Rs).

Es el parmetro que expresa el grado de separacin que se puede obtener en un sistema

cromatogrfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un
sistema cromatogrfico para dos componentes

Una pobre resolucin es debida principalmente a:

Hay demasiada muestra en la columna.

La columna o placa es corta.

La fase mvil no discrimina entre los componentes.

La columna es demasiado gruesa.

4.)

5.)

Tipo de Detector Detector Type Abbreviation

Quimioluminiscencia Chemiluminescence CL
Conductividad Conductivity CD
Electro Qumica Electro Chemical EC
Evaporativo de dispersin de luz Evaporative Light Scattering ELS
Fluorescencia Fluorescence FL
Espectrmetro de Masas MS Mass Spectrometer MS
Laser Multi Angulo de dispersin de luz Multi Angle Laser Light Scattering MALS
Rotacin ptica Optical Rotation OR
Fotodiodo array Photo Diode Array PDA
Indice de refraccin Refractive Index RI
Ultra Violeta Ultra Violet UV
Visible Visible VIS

Detectores UV, VIS y PDA

Los detectores UV, VIS, y PDA se clasifican como detectores de absorbancia. Proporcionan
una buena sensibilidad para que compuestos que absorbe la luz a nivel ~ pg. Son fciles de
operar y proporcionar una buena estabilidad. Detectores de UV es un detector muy
comnmente utilizado para el anlisis HPLC. PDA detecta un espectro completo de forma
simultnea. Detectores UV y VIS visualizar el resultado obtenido en dos dimensiones
(intensidad de la luz y el tiempo), pero PDA aade la tercera dimensin (longitud de onda).
Esto es conveniente para determinar la longitud de onda ms adecuada sin repetir los anlisis.

Detector de ndice de refraccin

Detector RI mide el cambio en el ndice de reflejo. Mediante la medicin de este cambio, la
presencia de componentes se puede observar.

Evaporativo Light Scattering Detector

ELSD ofrece una buena sensibilidad para analitos no voltiles a nivel de ng. El eluyente de
la columna se nebuliza y despus se evapora para que formar partculas finas. El analito es
entonces irradiada con un haz de lser y la radiacin dispersada es detectada. Otra ventaja es
que ELSD se puede utilizar para el mtodo del gradiente mientras que RI no puede.

Detector multi-ngulo de dispersin de luz

Para el anlisis SEC, MW de analito se calcula a partir de la curva de calibracin obtenida
utilizando un conjunto de estndares conocidos. Sin embargo, mediante el uso de un MALS,
MW puede ser determinada directamente sin la necesidad de la curva de calibracin.
Tambin puede proporcionar una MALS MW absoluta del analito con lmite de deteccin
muy bajo.

Espectrmetro de Masas
Los analitos se detectan basndose en su peso molecular. La informacin obtenida es
especialmente til para la identificacin de compuestos estructurales. Sin embargo, su uso
no se limita a la identificacin de la estructura y se puede utilizar para cuantificar lmite de
deteccin muy bajo de componentes elementales y moleculares.

Detector de conductividad
Las soluciones que contienen componentes inicos conducen la electricidad. Detector de
conductividad mide la resistencia electrnica y el valor medido es directamente proporcional
a la concentracin de los iones presentes en la solucin. Por lo tanto, se utiliza generalmente
para la cromatografa de iones.

Detector de Fluorescencia
La ventaja del mtodo de fluorescencia es su alta sensibilidad para determinados grupos de
compuestos a ~ nivel fg. Mediante el uso de una longitud de onda especfica, tomos de
analito son excitados y luego emitir la seal de luz (fluorescencia). La intensidad de esta luz
emitida se controla para cuantificar la concentracin del analito.

Detector de quimioluminiscencia
Similar a FL, pero en lugar de utilizar una fuente de luz para excitar los tomos de analito, la
excitacin se inicia por reaccin qumica. Puesto que no se bas en la fuente de excitacin
externa, el ruido es pequeo, resulta en elevada relacin de seal a ruido, es decir, que
proporciona una sensibilidad an mayor que FL.

Detector Rotacin ptica

Especfico para la medicin ismero ptico. La columna puede separar R-y de tipo L-
ismeros pticos, pero los detectores generales (por ejemplo, UV) no puede distinguir que es
ni R L. Detector Rotacin ptica proporciona esta informacin.

Detector electroqumico
Hay varios tipos diferentes de ECs. La deteccin se basa en amperometra, polarografa,
culombimetra y conductrometria. Ofrecen una alta sensibilidad, simplicidad, conveniencia
y aplicabilidad generalizada. Es especialmente adecuado para el uso con el sistema de tipo
semi-micro o capilar
6.)

Problemas ms comunes encontrados en HPLC

Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus posibles causas
posibles, y cmo solucionarlos.

Presin Alta
o Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o Guarda Columna por
partculas.
 o Solucin: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna
desconectada del detector. Si sto no funciona reemplaze el fritado a la
entrada de la columna. Si la presin sigue alta reemplaze la columna.
o Solucin a largo plazo: Asegurese que todas las fases mviles se filtren
apropiadamente antes que entren a la bomba de HPLC . Tambin filtre todas
las muestras antes de inyectarlas.
Prdida de la Resolucin
o Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC del Guarda Columna
por partculas.
o Solucin: vea la seccin de Presin Alta
o Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases
mviles en el sistema de HPLC.
Picos Hendidos
o Posible causa : Obstruccin de la Columna de HPLC o del Guarda Columna
por partculas.
o Solucin: Marcha atrs columna roja con presin baja est al lado de abre.
Si es necesario reemplaze el fritado de la entrada o la columna.
o Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases
mviles en el sistema de HPLC.
Variacin en los Tiempos de Retencin
o Posible causa : Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase
mvil.
o Solucin: Bomba primera y est fases seguras tan mviles es propiamente
[degassed]
o Solucin a larga plazo: Asegurese fase tan mvil est propiamente y
adecuadamente desgasificada. Si usa desgasificacin electrnica en lnea
asegura esa cadencia del flujo no es demasiado alto para evita [degassing]
completo.
Variaciones de la Lnea Base
o Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a
una mala desgasificacin de los solventes de la fase mvil.
o Solucin: Asegurese que todas las fases mviles estn debidamente
desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la presin a toma de
corriente del detector.
Lnea Base con mucho Ruido
o Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba.
o Solucin: Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC . Use Solventes
desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo
de la fase movil del sistema.
Picos Falsos (Detectores Electroqumicos y de Fluorescencia)
o Posible causa: Oxgeno Disuelto
o Solucin: Desgasificar adecuadamente las fases mviles para reducir la
concentracin de oxgeno disuelto.
o Solucin a largo plazo: Agregar un sistema de filtracin al vaco en lnea.
Peridicamente chequear el nivel de oxgeno disuelto.
Baja Ninguna Presin
o Posible causa: Trabajar con bombas, sellos pistones expuestos por mucho
tiempo a partculas en suspencin en la fase mvil.
o Solucin: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.