Cromatografía líquida

Prof. Joan Manuel Rodríguez Díaz, Ph.D.

e-mail: joanrd9@yahoo.com
Contenidos:

• Fundamentos de la Cromatografía Líquida de Alta

Eficiencia (HPLC)
• Tipos de cromatografía HPLC según los
mecanismos de retención
• Instrumentación para HPLC
• Bombas
• Inyectores
• Columnas
• Fases estacionarias
• Fase móvil
• Detectores universalices y selectivos
• Análisis cualitativo y cuantitativo en cromatografía
Conceptos

Separación de los
componentes de una mezcla
(muestra), disueltos en una
fase móvil a medida que se
van desplazando con diferente
velocidad a través de una fase
estacionaria
 Cromatografia
Analogía

Los procesos cromatográfico puede ser comparado a un grupo de abejas y

moscas sobrevolando una cierta región.

Que efecto esperarían al pasar un grupo de abajas y moscas por una flor?

Fase estacionaria Analitos

 Cromatografia
Analogía

Para una misma mezcla, la simple cambio de la fase estacionaria puede ser suficiente para
alterar completamente el orden de elución de los componentes de la mezcla.

Fase estacionaria Analitos

Instrumentación básica para cromatografía líquida
 Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidad

Cuales mezclas pueden ser

separadas por CLAE ?
para una sustancia cualquiera poder ser “arrastrada” por un líquido
esta debe disolberse en este líquido.

DE FORMA GERAL:
CLAE es aplicable para separación y análisis de mezclas cuyos
constituyentes sean solubles en la FM. No hay limitaçión de volatilidad o de
estabilidad térmica.
Cromatografía Líquida
Componentes típicos - CLAE
 Cromatografía Líquida
Esquemas de un equipo para CLAE
Características de los Disolventes para las
fases móviles en HPLC:

- Elevada pureza química (solventes puros para HPLC).

- Elevada pureza física (libres de gases y partículas).

- Características adecuadas según el detector a utilizar

(Índice de refracción, absorción en el UV, etc.).

- Baja viscosidad.

- Polaridad que garantice un adecuado poder de elución.

 Requisitos dos sistemas de bombeamento

1 – Generación de presiones hasta 6.000 psi

2 – Salida con ausencia de pulsos
3- Velocidades de flujo de 0,1 a 10 mL/min
4 – Control y reproductibilidad de flujo de
0,5% o mejor
5 – Componentes resistentes a la corrosión

Bomba recíproca (también son llamadas de bombas de

pistón o de diafragma)
Sistemas de inyección de la muestra

Soportan presiones de hasta 7.000 psi

Volúmenes típicos: 5 a 500 µL
Micromuestreo: 0,5 a 5 µL
 Cromatografía Liquida
Fase movil para CLAE
Solventes puros y mezclas de solventes de acuerdo con la
polaridad requerida en la separación.
• Elución isocrática:
• Cuando la separación es hecha utilizando un único solvente de
composición constante.

• Elución con gradiente:

• Son utilizados dos o tres sistemas de solventes que difieren
bastante entre si en polaridade.
• Después que la elución comienza, la relación entre los
solventes se varia de modo programado, de forma
contínua o en pasos.
La elución con gradientes produce efectos similares a los
producidos por la programación de temperatura na CG.
 Cromatografía Liquida
Elución com gradiente Columna C18, 5 µm, fase reversa
Detector fluorescencia:
excit. 334 nm – emis. 425 nm
 Precolumnas: Columnas para CLAE

- Filtran la fase móvil

- Atrapan compuestos con retención irreversible en la F.E.
En ellas ocurre la separación
Columnas cromatográfica.

Tipos
- Columnas clásicas (diámetro interno: 2 – 5 mm)
-Columnas SBC (diámetro interno: 0,5 - 2 mm)
-Columnas microbore (diámetro interno: 0,1 – 0,5 mm)
-Columnas capilares (diámetro interno: 0,025 – 0,1 mm)
 Columnas para CLAE

Las columnas generalmente son

construidas de acero, aunque
tubos de vidrio con paredes
resistentes son encontrados
ocasionalmente. Estos últimos son
restrictos a presiones más bajas
de 600 psi.

Existem comercialmente centenas de colunas

empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase
estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
Colunas para CLAE

•Remoción de material particulado

•Contaminantes del solbente
Precolumnas
•Contaminantes de la muestra
•Saturar a FM con a FE

Aumenta la vida útil de la coluna

COLUMNAS TÍPICAS
•Material: acero
•Largo: 10 a 30 cm
•Diámetro: 4 a 10 mm
•FE: Partículas de 5 a 10 µm
•Eficiencia: 40 mil a 60 mil
platos/metro
Tipos de columnas:
 Cromatografía Liquida
Separación isocrática de alta velocidad
Columna de alta - 4 cm de largo
velocidad y alta - 0,4 cm d.i.
100.000 platos/metro
eficiencia - FE: spherisorb 3 µm

FM: 4,1% EtAc em n-Hexano

1– p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato
 Colunas para CLAE
Fase estacionária para CLAE
Basicamente son dos tipos de FE:

• Pelicular:
• Consiste de lechos de polímero o vidrio no-poroso, esférico, con diámetros típicos del
orden de 30 a 40 µm, recubierto con una capa fina y porosa de:
• Sílice
• Alúmina
• Resina de poliestireno-divinil-benzeno
• Resina intercambiadora de iones
• Partícula porosa:
• Consiste de macropartículas porosas con diámetros de 3 a 10 µm. Las partículas son
constituidas de los mismos materiales del recubrimiento pelicular.
 Detectores CLAE:
UV-VISIBLE:
a) λ Fija (210, 254 y 280 nm).
b) λ Variable (190 -600 nm).
Ventaja: son muy específicos y sensibles.
 Detectores CLAE:
MULTIESPECTRAL:

Mide y almacena los espectros UV (A vs λ ) de cada pico o

sustancia detectada y los cromatogramas (A vs t).

Ventajas:
- Se obtiene información estructural.
- Se puede chequear pureza (el DAD analiza tres segmentos del
pico y le hace el espectro a cada uno, si los tres espectros
obtenidos son similares la sustancia esta pura).
 Detectores CLAE:
INDICE DE REFRACCION:
Mide cambios del índice de refracción de la FM cuando arrastra un soluto
eluido.
Ventaja:
- Muy generales.
Desventajas:
- Muy inestable a los cambios de T y P.
- Menos sensible.
 Detectores CLAE:
FLUORESCENCIA:
Aplicación: Sustancias fluorescentes (Ej. algunas vitaminas) y sustancias
con fluorescencia inducida (derivatización pre- o post- columna).
Ventaja:
- Muy sensibles y específicos.
Desventajas:
- Se limita a sustancias fluorescentes.
 Detectores CLAE:

• Eletroquímicos: existen varios tipos disponibles actualmente. En cambio no sean tan

explorados como los detectores ópticos, ellos presentan algunas ventajas como alta
sensibilidad, simplicidad y amplia aplicabilidad.
• Amperométricos
• Coulométricos
• Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104
• Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106
 Detectores CLAE:
Detector de MS:
 Ventajas HPLC-MS:
• Mejora de la selectividad
• Mejora de la sensibilidad
• Multidimensionalidad de los datos
• Mejora la calidad del espectro de masas
• Se evitan pasos off-line:
- Pérdida mínima de muestra
- Reducción del tiempo de análisis
• Se requiere menos cantidad de muestra

¡¡Identificación y
determinación de solutos
solapados!!
 Detectores CLAE:

• Espectrometria de masa - universal

• Así como em la CG, el acoplamiento de um espectrómetro de masa potencializa
la técnica de separación y cuentificación

Interface CL-MS
Detectores CLAE:
Tipos de Cromatografía según los mecanismos
de retención.

- Cromatografía en Fase Normal

- Cromatografía en Fase Inversa

- Cromatografía en Fase Inversa con Supresión Iónica

- Cromatografía en Fase Inversa con Par Iónico

- Cromatografía de Intercambio Iónico

- Cromatografía de Exclusión por Tamaño

-Cromatografía de Afinidad
 Cromatografía en Fase Normal
fase estacionaria más polar que el disolvente

Retención interacciones polares

enlace de hidrógeno dipolo – dipolo

dipolo – dipolo inducido

Elución Según polaridad

creciente del
disolvente
 Cromatografía en Fase Inversa
fase estacionaria menos polar que el disolvente

Retención interacciones hidrofóbicas

fuerzas de dispersión

Elución Según polaridad

decreciente del
disolvente
Rellenos y modos de interacción
Fase sólida Estructura
Fase inversa
Octadecil (C-18) -(CH2)17CH3
Octil (C-8) -(CH2)7CH3
Etil (C-2) -CH2-CH3
Ciclohexil -CH2CH2-ciclohexil
Fenil -CH2CH2CH2-fenil

Fase normal
Ciano (CN) -(CH2)3CN
Amino (NH2) -(CH2)3NH2
Diol (COHCOH) -(CH2)3OCH2CH(OH)CH2(OH)
Gel de sílice -SiOH
Alúmina Al2O3
Disolventes más utilizados como fases móviles

Fase Normal De baja polaridad

Fase Inversa Polares

Agua
Metanol
Modificadores
Acetonitrilo
orgánicos Tetrahidrofurano
Aplicaciones ambientales de HPLC
 Condiciones
Cromatográficas