Instrumento

Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la fotoluminiscencia son similares a
los que se encuentran en los fotómetros o espectrofotómetros ultravioleta/visible. Un fluorómetro
como fotómetro, emplea filtros para la selección de la longitud de onda. Por el contrario, la mayor parte
de los Espectrofluorómetro emplean un filtro para limitar la excitación de la radiación y un
monocromador con rejilla para dispersar la radiación fluorescente de la muestra. El haz dirigido a la
muestra primero pasa a través de un filtro primario o un monocromador, el cual transmite radiación que
excita la fluorescencia, pero excluye o limita la radiación que corresponde a la longitud de onda de la
fluorescencia. La radiación de la fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las direcciones,
pero se observa mejor en ángulos rectos al haz de excitación; a otros ángulos, una dispersión
aumentada desde la solución y las paredes de la celda pueden causar grandes errores en la medición de
la intensidad. La radiación emitida llega a aun foto detector después de a ver pasado por un segundo
filtro o monocromador que aísla para su medida.

El haz de referencia pasa a través de un atenuador que reduce su potencia aproximadamente la de la

radiación fluorescente. Las señales procedentes del fotomultiplicador de la muestra y de la referencia se
dirigen a un amplificador diferencial cuya salida se visualiza en un medidor o en un regsitro.

Componentes.

Fuentes.

Fuentes: más intensas que las utilizadas en absorción molecular F = 2,303 K`P0 bC

Lámparas: La lámpara más común para los fluorómetros de filtro es la lámpara de arco de mercurio a
baja presión equipada con una ventana de sílice fundida. Esta fuente emite líneas útiles para producir la
excitación previa a la fluorescencia a 254, 302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm. Las líneas individuales se
pueden aislar con filtros de interferencia o absorción adecuados. Ya que, en la mayoría de los
compuestos fluorescentes, la fluorescencia se puede inducir con distintas longitudes de onda, al menos
una de las líneas del mercurio suele resultar adecuada.

Para los espectrofluorímetros, en donde se requiere una fuente de radiación continua normalmente se
utiliza una lámpara de arco de xenón de alta presión, de 75 a 450 W. Estas lámparas requieren una
fuente de alimentación potente capaz de producir corrientes continuas de 5 a 20 A y de 15 a 30 V. El
espectro de una lámpara de arco de xenón es continuo desde aproximadamente 300 a 1.300 nm. El
espectro se parece al de un cuerpo negro. En algunos instrumentos, se obtienen destellos espaciados
regularmente en el tiempo mediante la descarga de un condensador a través de la lámpara a frecuencia
constante; de esta manera se producen impulsos de luz de gran intensidad. Además, las señales de
salida de los detectores son, así, señales de corriente alterna, que pueden ser fácilmente amplificadas y
procesadas.

Láseres.

Desde los comienzos de los años setenta, se utilizan también diversos tipos de láserescomo fuentes de
excitación para medidas de fotoluminiscencia. Un particular interés tienen los láseres sintonizables de
colorante que utilizan, como sistema de bombeo, un láser de nitrógeno pulsante el o un láser de
Nd:YAG.

La mayoría de los espectrofluorímetros comerciales utilizan lámparas (ya descritas) como fuentes, por
ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las fuentes de láser ofrecen importantes
ventajas en determinados casos: por ejemplo, (1) cuando las muestras son muy pequeñas como en
cromatografía con microcolumnas y en electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de un
microlitro o menor, (2) en los sensores de control remoto, como en la detección fluorimétrica de
radicales hidroxilo en la atmósfera o de clorofila en seres vivos acuáticos, donde la naturaleza colimada
de los haces de láser es vital; o (3) cuando se requiere una radiación de excitación altamente
monocromática para minimizar los efectos de las interferencias fluorescentes.

Filtros y monocromadores.

Tanto los filtros de interferencia como los de absorción se han utilizado en los fluorómetros para la
selección de la longitud de onda del haz de excitación y de la radiación fluorescente resultante. La
mayoría de los espectrofluorímetros están equipados con al menos uno y a veces dos monocromadores
de red.

Detectores

La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por ello, para su medida se necesitan ganancias de
amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los detectores más utilizados en instrumentos
de fluorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad de recuento de fotones para mejorar la
relación señal/ruido. También se utiliza, a veces, la refrigeración de los detectores para mejorar la
relación señal/ruido. También se han propuesto, para los espectrofluorímetros, los detectores de diodos
en serie y de transferencia de carga. Este tipo de detectores permite el registro rápido de los espectros
de excitación y de emisión y particularmente son útiles en cromatografía y en electroforesis.

Cubetas y compartimentos para las cubetas.

Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilíndricas como rectangulares, fabricadas con
vidrio o con sílice. Se debe tener cuidado en el diseño del compartimento de la cubeta para reducir la
cantidad de radiación dispersada que llega hasta el detector. Con este propósito, a menudo, se
introducen deflectores en el compartimento. Incluso más importante que en las medidas de
absorbancia, es evitar dejar las huellas dactilares en las cubetas ya que la grasa de la piel con frecuencia
fluoresce.

Límites de detección

Calibración

Debido a las variaciones de la intensidad de la fuente, de la sensibilidad del detector y de otras variables
instrumentales, es imposible obtener, con un fluorómetro o con un espectrofluorímetro dado,
exactamente las mismas lecturas para una disolución o un conjunto de disoluciones de un día a otro. Por
esta razón, es una práctica habitual calibrar el instrumento y ajustarlo a un nivel de sensibilidad
reproducible. El calibrado se suele llevar a cabo con una solución patrón de fluoróforo estable. El
reactivo más común para este cometido es una disolución patrón de sulfato de quinina de
concentración aproximadamente 10-5 M. esta disolución, generalmente, se excita con una radiación de
350 nm y emite radiación a 450 nm. Para otras regiones de longitud de onda se ha descrito otros
compuestos.

Perkin-Elmer Corporation ofrecen un conjunto de 6 patrones de fluorescencia disueltas en una matriz de

plástico, que forman unos bloques solidos estables, que se pueden utilizar indefinidamente sin una
conservación especial. Con esto patrones, el instrumento se calibra fácilmente en la región de
longitudes de ondas que se va a utilizar en análisis.

Tipos de instrumento

La sofisticación, característica de comportamiento y el costo de los fluorómetros y espectrofluorómetros

son tan diferentes como las correspondientes medidas de absorción de cada instrumento. En muchos
aspectos, los instrumentos del tipo filtro están mejor adaptados para el trabajo analítico cuantitativo
que los instrumentos más elaborados basados en monocromadores. Los fluorómetros son más sensibles
que los espectrofluorómetros porque los filtros tienen una cantidad de radiación más elevada que los
monocromadores. Además, la fuente y el detector se pueden colocar más cerca de la muestra en el
instrumento más sencillo, un factor que refuerza la sensibilidad.

Fluorómetros

Los fluorómetros de filtro proporcionan una forma relativamente simple y barata de llevar a cabo
análisis cuantitativos por fluorescencia. Como ya se ha señalado, para seleccionar las longitudes de onda
de la radiación de excitación y de emisión se utilizan filtros de interferencia y de absorción,
Generalmente, los fluorómetros son compactos, robustos y fáciles de usar

La estructura básica de un fluorómetro de filtro de un solo haz es esencialmente la que aparece en la

figura. El filtro primario F1 permite que pase el ultravioleta, pero elimina la radiación visible producida
por la lámpa. El filtro secundario F2 transmite la radiación visible fluorescente, pero absorbe cualquier
radiación ultravioleta que pueda ser dispersada hacia la fotocelda. Como en cualquier fotómetro de un
solo haz, el voltaje suministrado tanto a la lámpara como al fototubo debe estabilizarse para conservar
una sensibilidad constante durante el análisis.

Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan ópticas de doble haz tal como se muestra en la
siguiente figura, para compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente.

Espectrofluorímetros

Algunos fabricantes de instrumentos ofertan espectrofluorímetros capaces de obtener los espectros de

excitación y los de emisión. En la figura se muestra el diseño óptico de uno de ellos, que utiliza dos
monocromadores de red. La radiación que procede del primer monocromador se divide en dos, una
parte se dirige hacia el fotomultiplicador de referencia y la otra hacia la muestra. La radiación
fluorescente resultante, después de ser dispersada en el segundo monocromador, se detecta en un
segundo fotomultiplicador.
Hay dos clases de espectrofluorómetros: aquellos a los que se adapta un accesorio fluorescente para el
espectrofotómetro y los que lo traen ya integrado; estos últimos cuentan generalmente con dos
monocromadores. Los ditamentos iluminan la muestra con el ultravioleta de una lámpara de xenón o
mercurio, y con un ángulo de 90°; a través de un filtro o de un monocromador con abertura ajustable. La
luz fluorescente es analizada por el espectrotrofotómetro, y puede ser barrida manual o
automáticamente. Aunque el espectrofotómetro sea del tipo de doble haz, solo puede funcionar como
el de un solo haz cuando se usa un fluorómetro. Un espectrofluorometro diseñado de tal forma
generalmete resulta más eficiente que un espectrofotómetro adaptado. Lo ideal es que ese instrumento
sea de doble haz y pueda registrar en forma de relación; debe de ser capaz de barrer tanto la radiación
primaria como la secundaria a elección del operador; debe de tener un angulo de observación ajustable
de 180° a 0°, según sea posible en la práctica, debe de tener control automático del haz primario para
mantener constante a energía incidente que ilumina la muestra, y debe ser posible regular en el la
temperatura de la muestra y del patrón.