PRUEBAS BIOQUÌMICAS PARA IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

Grupo B

ANDREY PAYÁN GONZÁLEZ

MSc. PhD

UNIVERSIDAD DEL VALLE

FACULTAD DE SALUD
ESCUELA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
CALI – VALLE DEL CAUCA
2023

1
 Andrey Payán González

GUÍA DE TRABAJO PARA EL TALLER DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE GRAM NEGATIVOS

Grupo B

UNIVERSIDAD DEL VALLE

FACULTAD DE SALUD
ESCUELA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
CALI – VALLE DEL CAUCA
2023

2
INTRODUCCIÓN

El primer paso en la identificación de una bacteria es su aislamiento sobre medios sólidos para generar colonias
aisladas unas de otras, y así poder observar la morfología de éstas. La morfología observada orienta la
identificación inicial del microorganismo que las genera. Posterior a esto, debe realizarse la coloración de Gram
a partir de las colonias, la cual permite una identificación basada morfología y características de tinción. Una vez
se establece que las colonias corresponden a bacilos Gram negativos, que es la categoría de la cual se va a
tratar en este taller, se procede a realizar pruebas bioquímicas correspondientes para su identificación. Estas
pruebas en su mayoría se basan en detectar la actividad metabólica de las enzimas sobre diferentes sustratos
que se encuentran en los medios de cultivo de identificación. Esto se consigue inoculando diferentes tubos de
pruebas bioquímicas, a las que común mente se les llama “Batería de identificación”.

En los medios de cultivo que se emplean como pruebas bioquímicas, se encuentran indicadores de pH, los
cuales muestran un cambio de color cuando se hidroliza el sustrato y se convierte en otros productos. Así pues,
con la combinación de resultados de la acción metabólica de la bacteria frente a diferentes sustratos es posible
identificar el tipo de bacteria que ha crecido en un agar a partir de una muestra clínica.

Lo primero que se debe conocer de una bacteria es si ésta utiliza la glucosa como fuente principal de energía.
Las bacterias al igual que todas las células deben tener siempre tres elementos básicos: una fuente de carbono,
de nitrógeno y de azufre. Como sabemos, tanto los azucares como las proteínas son fuente de carbono, sin
embargo, las proteínas se utilizan menos fácilmente con este fin, ya que al ser moléculas estructuralmente más
complejas requieren procesos de metabólicos mas complejos.

Cuando se siembra una bacteria en un medio, lo primero que ella va a necesitar será una fuente de carbono, la
glucosa es entonces la fuente más inmediata por no estar unida a grupos funcionales difíciles de romper como si
lo está en las proteínas o en los aminoácidos. Así, al ser la glucosa la fuente de carbono más frecuentemente
preferida por bacterias aisladas en microbiología clínica, las bacterias tenderán a preferirla aún ante la presencia
de otras moléculas en un mismo medio.

Como bien sabemos, el catabolismo de la glucosa puede darse tanto por la vía fermentativa (anaerobia) como
por la vía oxidativa (respiración), así mismo, las bacterias también metabolizan los hidratos de carbono por una
de estas dos vías e incluso, frecuentemente las bacterias utilizan ambas (anaerobios facultativos). Tanto en la
oxidación como en la fermentación de la glucosa se producen ácidos, en el caso de la oxidación, ácidos débiles
como los ácidos tricarboxilicos y para la fermentación, ácidos fuertes como el ácido láctico.

No obstante, existen también bacterias asacaroliticas, que no utilizan la glucosa por ninguna de las dos vías
anteriormente mencionadas, sino que encuentran su fuente de carbono en otros compuestos.

La mayoría de las bacterias utilizan primeramente azucares simples, pero cuando estos se agotan o no están
presentes en el medio, utilizarán como segunda opción azucares compuesto; sin embargo, si la bacteria no
posee las enzimas específicas para romper los enlaces que unen estos azucares compuestos (pej: Lactosa),
entonces pasarán a tomar otras fuentes de carbono como los aminoácidos presentes en las proteínas o sus
derivados.

3
Entonces, como primera medida para determinar la utilización de glucosa, se debe realizar una prueba
bioquímica en el medio TSI (agar hierro triple azúcar), la cual permite identificar las bacterias fermentadoras de
carbohidratos. Es la prueba inicial que separa las bacterias en dos grandes grupos: las fermentadoras y las no
fermentadoras de glucosa. Las demás pruebas hacen parte de una batería bioquímica de identificación, que está
determinada de acuerdo con una identificación general previa (basada en la morfología y la tinción de Gram).

Existen diversos medios de cultivo para la realización de pruebas, algunos muy particulares en los cuales
pueden realizarse varias pruebas simultáneas a una misma bacteria, es el caso del medio MIO, en el cual, es
posible determinar el comportamiento de la bacteria frente a tres pruebas: presencia de ornitina descarboxilasa,
producción de indol y movilidad. En un mismo tubo a la bacteria en cuestión se le pueden determinar tres
características al mismo medio, pues posee todos los componentes necesarios para ello.

Finalmente se debe mencionar que al momento de hacer la lectura de las reacciones que producen variación
del pH en un tubo, frecuentemente se emplean las letras A para denominar a la producción de ácido y la letra K
para denotar la presencia de un producto alcalino. Así pues, se pude decir que si en un tubo que contiene una
prueba bioquímica se observa en la superficie el viraje del indicador hacia alcalino y en el fondo de este un viraje
del indicador hacia un pH ácido, este tubo se lee como K/A.

Esta guía de trabajo servirá de orientación para el desarrollo del taller referente a las pruebas bioquímicas para
la identificación de bacilos Gram negativos y se describirá la metodología que será utilizada para la evaluación
del tema.

4
1. OBJETIVOS
1,1. OBJETIVO GENERAL:

Interpretar de manera adecuada las pruebas de: citrato, agar con lisina y hierro (LIA), movilidad-indol-ornitina
(MIO), agar con triple azúcar y hierro (TSI), ureasa, y oxidación-fermentación, para la identificación de bacterias
Gram negativas.

1,2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Identificar el fundamento de los diferentes tipos de reacciones bioquímicas que pueden ocurrir en los
medios de identificación.
 Reconocer los procesos bioquímicos asociados a las pruebas.
 Conocer los componentes de las pruebas de identificación y reconocer para que las usan las bacterias
en cada caso
 Evidenciar las causas posibles de error que pueden afectar la interpretación de las diferentes pruebas
de identificación.
 Reconocer los tiempos máximos de incubación que se emplean en cada medio de identificación.

2. METODOLOGÍA.

 Responda de manera individual, las preguntas del taller y Prepárese para sustentarlo en el
desarrollo del taller.
 El profesor lo llamará a sustentar de manera oral la resolución de las peguntas ante todo el
grupo. En el caso de que no sea llamado a sustentar , deberá enviar el taller escrito resuelto al
finalizar el taller antes de 12:30 pm, al correo del profesor.
 Si no asiste a la sustentación del taller no podrá enviarlo al correo y la nota será de 0.
 Conteste las preguntas en este mismo documento a mano, inmediatamente después de cada
pregunta, luego transfórmelo en un pdf y téngalo preparado para su envío, en caso de que le
sea requerido.
 Recomendación: para resolver las peguntas del taller, debe iniciar estudiando la composición
del medio de cultivo, así como los indicadores que contiene y los tiempos de incubación
máximos. Puede apoyarse en el video: Introducción al taller 2. Pruebas bioquímicas de Gram
Negativos, que se encuentra en el CAMPUS.

2,2. Preguntas

1. Un estudiante siembra un tubo de Agar Hierro Triple azúcar (TSI). Lo incuba 8 h en la primera lectura y
24 h en la segunda lectura. En la primera lectura obtuvo un resultado 1. En la segunda lectura obtuvo un
resultado 2. ¿Qué puede explicar estos resultados?

5
 Tubo sin inocular

1 2

a ) ¿Cuál es indicador que está variando el color de rojo a amarillo,

b) ¿Cuáles elementos que tiene el medio para que la bacteria pueda utilizar como fuentes de carbono, empleó a
las 8 horas y cuales a las 24 h?
c) ¿Cómo se leería el tubo 1?
d) ¿Cómo se leería el tubo 2?

2.
El siguiente es un tubo de TSI.
a) ¿Cuál el producto que se revela con la producción del
pigmento negro?
b) ¿Cual es el compuesto del que parte la bacteria para
producirlo
c) ¿Qué es ese pigmento?
d) ¿Cómo se leería este tubo?

6
3. Existen bacterias fermentadoras de la glucosa que
producen H2S y bacterias que no son fermentadoras y
también pueden producir H2S. Si yo observo el TSI que se
muestra aquí y además en una prueba OF del mismo
microrganismo observo la reacción que se muestra también
aquí. ¿Cómo debo leer esta prueba de TSI?

4. Estos tubos corresponden al medio de identificación de

LIA con diferentes reacciones. El tubo 1 corresponde a
un agar sin siembra y los demás son recciones de
diferentes organismos a las 24 horas de incubación.
a) ¿En cual o cuales de los tubos ocurrió una
descarboxilación (Tiene enzima para descarboxilar la
lisina)?
b) Explique en orden cronológico las reacciones de
sustratos llevaron al tubo 3.
c) En cual de los tubos ocurrió una desaminación (Tiene
enzima para desaminar la lisina)
d) Explique que reacciones de sustratos llevaron a estos
colores de la pregunta anterior.
e) ¿De dónde proviene el pigmento negro del tubo 5?
f) ¿Cuál es su lectura en los tubos 2, 3 4 y 5? En cada
caso mencione positivo o negativo

5.

7
En el medio Movilidad Indol Ornitina (MIO) siembro una bacteria
aerobia estricta y la incubo por 24 h. Al cabo de ese tiempo leo la
prueba y la interpreto como inmóvil (ver imagen en frente). Un
compañero me dice que estoy equivocado, y me lo comprueba
haciendo una prueba de movilidad en “Gota Pendiente”. Yo la
observo, y efectivamente ¡¡¡¡es móvil!!!….
a). ¿Cómo es posible explicar estas diferencias, sin atribuirlo a un
error en el procedimiento?
En este video se aprecia lo que se vió en la
b) ¿Si una bacteria es inmóvil, esto quiere decir que debe ser
técnica de la Gota pendiente:
indol negativa y también ornitina decarboxilasa negativa?
https://www.youtube.com/watch?v=y4P-
c) ¿Cuales reactivos puedo emplear para evidenciar la
KCMaaLU
producción de indol en este medio?
d) ¿Cómo se llama el producto final de degradación de la
ornitina?
e) Tome en cuenta la siguiente imagen de los diferentes tipos de
combinaciones que se pueden encontrar en un medio de MIO, y
mencione que se ve en cada una de esas combinaciones.

6. En el laboratorio en donde usted trabaja, se agotó la existencia del medio MIO. Un compañero le dice que es
posible realizar la Prueba de Indol utilizando un caldo de peptonado (por ejemplo: triptona). ¿Es posible? ¿Por qué?

7. A) Si tengo una bacteria no fermentadora de la glucosa por que no puedo emplear la prueba de LIA para
determinar la presencia de enzima LISINA descarboxilasa. B) ¿Qué opción tengo para hacerlo?

8.

8
 En el laboratorio, ud siembra al mismo tiempo un agar
urea de Christensen (1) y un caldo de urea de Stuart (2)
con la misma bacteria. Al día siguiente obtengo un
resultado rosado en el agar urea de Christensen y no en
el de Stuart.
a) ¿Es posible? ¿Por qué?
b) ¿Cuanto tiempo de incubación dejaría UD el agar urea
de Christensen , antes de poder decir definitivamente que la
reacción es negativa?
2
1

9.
En un agar citrato de Simmons de 24 h de incubación,
que se muestra enfrente, observo crecimiento de colonias
en el pico de flauta pero no observo cambio de color en el
medio, (sigue siendo verde). En la mayoría de los casos
un resultado positivo es un cambio de color de verde a
azul como se observa abajo
a) ¿Cómo interpreto este resultado?
b) ¿porque no se produjo cambio a azul?
c) ¿Cuál es el periodo mínimo de incubación, antes de
poder decir definitivamente que la reacción es negativa?
d) ¿Cual es la fuente de nitrógeno en este medio?

10.

9
Después de 24 h de incubación en el tubo destapado de la prueba
de OF (de glucosa) observó un cambio de color a amarillo mientras
que en el tubo tapado también es amarillo. Paralelamente obtuve un
TSI como el que se observa, de la misma bacteria.
a) ¿Es posible? ¿Por qué?
b) ¿qué otros resultados son posibles en el TSI si el OF es el
mismo?
c) ¿Es posible fabricar un OF de otros azucares?
OF TSI
d) ¿Cuál es el periodo mínimo de incubación del OF, antes de poder
decir definitivamente que la reacción es negativa?
e) ¿Porque no observo el pigmento negro en el OF?

11. Complete la siguiente tabla de indicadores:

Indicador Color en pH ácido Color en pH alcalino

Purpura de bromocresol
Azul de bromotimol
Rojo fenol
Rojo neutro

Indicador En ausencia de H2S En presencia de H2S

Sulfato ferroso

3. BIBLIOGRAFÍA Recomendada

1. Mac Faddin, J.F. Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. 3ª ed. Buenos Aires:
editorial Médica Panamericana; 2003.

2. Koneman, E.W. y otros. Diagnóstico Microbiológico: Texto y Atlas a color. 6ª edición. Buenos Aires: Editorial Médica
Panamericana; 2008. pp. 206-207

10
3. Becton, Dickinson and Company. BBL Motility Indole Ornithine (MIO) Medium. [página de la casa comercial BD]. 2007.
[Consultado 24 abril 2016]. Disponible en:
https://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/US/L007472(08)(0207)_ES.pdf

11
 4. ANEXOS
4,1. Anexo 1
REACCIÓN EN MEDIOS DIFERENCIALES CON INDICADORES DE pH 1

1
Modificado por Andrey Payán G. Tomado de: http://www.jlindquist.net/generalmicro/102diff.html Consultado el 01-04-2008

12
4,2. Anexo 2

Principios Generales Aplicados a Muchos de los Medios Diferenciales Basados

en Cambios de pH2

Reacción Reacción aparente.

Actividad
aeróbica o Substrato (Notada por el indicador Algunos ejemplos
microbiana
anaeróbica apropiado en el medio))

O F y medios d e
Varios aminoácidos en peptonas,
Desaminación Alcalina fermentación, TSI, LIA y
extracto de levaduras, etc..
otros medios diferenciales
Aeróbica

Oxidación
O F , CTA y otros medios
Uno o más Azucares específicos (Respiración Ácido (Débil)
diferenciales
aeróbia)

En cantidad TSI, O/F y medios d e

cantidad relativamente
relativamente fermentación fermentación, Mac
grande de ácido
Uno o más grande Conkey, XLD ,
Azucares
específicos En cantidad
cantidad relativamente
relativamente fermentación TSI, XLD Agar,
pequeña de ácido
pequeña.
Anaeróbica

Aminoácidos específicos en
descarboxilación alcalina LIA, MIO, XLD.
cantidades relativamente pequeñas

Color Negro
Reducción con
Tiosulfato (no es una reacción TSI, LIA, XLD, Hektoen.
formación de H2S
relacionada con el pH)

2
Modificado por Andrey Payán G. Tomado de: http://www.jlindquist.net/generalmicro/102diff.html Consultado el 01-04-2008

13