REPORTE NÚMERO 5: Pruebas Bioquímicas para Gram positivos

Nombre del alumno: Martinez Moreno José Antonio, Anaya Vargas Carlos Manuel, Ávila Castro
Diego Alfredo, Perez Penagos Oscar Abenamar

Asignatura: Microbiología Industrial

Licenciatura QFBT

Periodo: 2020-2

Sección 1: MIERCOLES 15:00 – 18:00

Fecha de entrega: 30 - septiembre - 2020

UVM Lomas Verdes

Resumen

En esta práctica se realizará pruebas bioquímicas de gram positivo en catalasa y coagulasa pero
primero se hará el crecimiento de las cepas de gram positivo y una vez obtenidas se realizarán las
pruebas. En la catalasa poniendo la muestra en un portaobjetos con ayuda de el asa en la muestra
problema, luego colocando gotas de peróxido de hidrógeno y se observan burbujas en la muestra. En
la de coagulasa se tomará una muestra del plasma y con el asa se tomará otra muestra problema y se
inoculara el plasma, después se pondrán a baño maria por 4 horas y cada media hora se revisará si el
plasma presenta coágulos y si esto pasa sera prueba positiva y si sucede lo contrario será una prueba
negativa.

PALABRAS CLAVE: catalasa, coagulasa, gram positivo, peróxido de hidrógeno, plasma.

INTRODUCCIÓN:

Catalasa los eritrocitos, donde se encuentra en el

La catalasa (peróxido de hidrógeno: peróxido
de hidrógeno oxidorreductasa, EC 1.11.1.6) es
una de las enzimas más abundantes en la
naturaleza y se encuentra ampliamente
distribuida en el organismo humano, aunque
su actividad varía en dependencia del tejido;
ésta resulta más elevada en el hígado y los
riñones, más baja en el tejido conectivo y los
epitelios, y prácticamente nula en el tejido
nervioso. A nivel celular se localiza en las
mitocondrias y los peroxisomas, excepto en
citosol.2 Esta enzima es una metaloproteína
tetramérica, cuyo peso molecular se encuentra
en el rango de 210-280 kD. Consta de 4
subunidades idénticas que se mantienen unidas
por interacciones no covalentes. Cada
subunidad contiene un grupo prostético de
protoporfirina IX y el contenido protohémico
y el de hierro representan un 1,1 % y 0,09 %
respectivamente del peso molecular total de la
enzima.
En algunas especies la CAT contiene
moléculas de nicotinamín adenín dinucleótido
fosfatado en su forma reducida (NADPH)
ligadas estrechamente a la enzima; así se ha
demostrado que la CAT humana y la de res
están ligadas a 4 moléculas de NADPH, 1 en
cada subunidad y que no existe interacción
directa entre el grupo hemo y el NADPH.4 En
la figura aparece la representación de una
subunidad de la enzima.
El NADPH unido a la enzima no está
involucrado en su actividad catalítica o
peroxidativa. Esta molécula puede intervenir
en la prevención y reversión parcial de la
inactivación de la CAT por su propio sustrato
tóxico y estabiliza a la enzima por tener un
efecto alostérico sobre su conformación.
Además, la CAT constituye un reservorio de
NADPH, lo cual juega un importante papel
durante el estrés oxidativo.
FUNCION ENZIMATICA
La CAT como parte del sistema antioxidante
está involucrada en la destrucción del H2O2
generado durante el metabolismo celular. Esta
enzima se caracteriza por su alta capacidad de
reacción, pero relativamente poca afinidad por
el sustrato. Presenta 2 funciones: la catalítica y
la peroxidativa. Ambas se pueden representar
por la ecuación:
H2O2 + H2R ---------- 2H2O + R
Coagulasa
La coagulasa ligada o factor de aglutinación
no está presente en filtrado de cultivos.
Convierte el fibrinógeno en fibrina insoluble
de forma directa sin intervención de los
factores plasmáticos.
La función de la coagulasa in vivo no ha sido
todavía aclarada y aún queda en el campo
especulativo, aunque está bien esclarecido, que
esta enzima está implicada en el desarrollo de
los abscesos, mediante la formación de una
capa de fibrina alrededor de la lesión, lo que
impide la localización y fagocitosis del agente
patógeno. 2
Se identificaron otros factores que intervienen
en la patogenesidad del mismo mediante el
mecanismo de la coagulación. La expresión de
estos factores empleando las técnicas de
recombinación genética en microorganismos
poco patógenos como Lactococcus lactis,
permitió conocer que los mismos se
encuentran directamente asociados a su
patogenicidad.
Prueba de la Catalasa
La prueba de la catalasa es un método rápido y
fácil para la diferenciación de Streptococcus y
Staphylococcus.
Todas las especies de Streptococcus son
catalasa negativa y Staphylococcus son
catalasa positivo.
Antecedentes
Streptococcus y Staphylococcus bacterias son
las dos causas más comunes de la enfermedad
en el hombre y los animales. Ambos tipos de
bacterias son cocos gram positivos (forma
redonda). A pesar de que a menudo tienen
diferente morfología cuando se examina con
un microscopio, a veces es difícil determinar si
usted tiene un Streptococcus e Staphylococcus
después de la tinción de Gram.
La prueba de la catalasa hace que sea fácil
distinguir entre Streptococcus y
Staphylococcus, Staphylococcus porque es
catalasa positivo y Streptococcus son catalasa
negativo.
Realización de una prueba de catalasa
Materiales necesarios
Placa de agar que contiene colonias
bacterianas que han demostrado ser cocci
gram positivo
El peróxido de hidrógeno (3% de solución)
portaobjetos de microscopio
Puntas de pipeta o bucle bacteriana o
toothpics para recoger una colonia bacteriana
Prueba de la coagulasa
es una técnica de laboratorio que se utiliza
para poner en evidencia la presencia de la
enzima coagulasa. Esta enzima tiene la
propiedad de coagular el plasma. Loeb en
1903 fue el primero en describir a esta enzima.
Esta prueba se realiza a los cocos Gram
positivos, catalasa positivos, permitiendo
distinguir las cepas de Staphylococcus aureus
del resto de los estafilococos, ya que él es el
único microorganismo de importancia clínica
que la produce.
Es una enzima producida por un determinado
microorganismo capaz de coagular el plasma
sanguíneo. Su aplicación clínica más
importante es la ayuda a la diferenciación del
Staphylococcus Aureus de otros
Staphylococcus.
Prueba de la coagulasa
Al poner en contacto el microorganismo
problema con plasma, si el microorganismo
posee la enzima coagulasa, el plasma
coagulasa
JUSTIFICACIÓN:
La identificación bioquímica bacteriana se
basa fundamentalmente en la comparación de
las características metabólicas de bacterias
desconocidas con aquellas de cultivos tipo. La
fiabilidad de la identificación está· en
proporción directa al número de características
similares. En Microbiología, la experiencia y
asociación entre el microorganismo y el sitio y
tipo de infección es de gran ayuda en la
identificación preliminar.
OBJETIVO:
● Aplicar diferentes metodologías para
determinar el género de diferentes
microorganismos
HIPÓTESIS
1. Si la prueba de catalasa es para detectar
bacterias que usan oxígeno como
Staphylococcus aureus estas bacterias serán
capaces de protegerse de los subproductos
tóxicos del metabolismo del oxígeno ya que se
les agregó el peróxido de hidrógeno y el
oxígeno del ambiente.
2. Si las bacteria Streptococcus pyogenes no se
protegen de los subproductos tóxicos del
metabolismo del oxígeno cuando se le agregó
el peróxido de hidrógeno y el oxígeno del
ambiente y al no observarse la presencia la
catalasa no es procesada por la bacteria.
3. Si el Staphylococcus aureus al no producir
su enzima para procesar la coagulasa y al
aplicarle la prueba de coagulasa esta bacteria
no convertirá el fibrinógeno en plasma en
fibrina.
4. Si la prueba de la oxidasa no es para todas
las bacterias aerobias estrictas que bacterias
serían las indicadas para determinar este tipo
de prueba y si producen el citocromo c oxidasa
para dar positivo a esta prueba.
5. Si la Prueba Rápida de Estreptococo tipo A
es aplicada a estreptococo tipo B da positivo si
la prueba es específica para Estreptococo tipo
A que Estreptococo se va a distinguir con esta
prueba
6. Si la técnica de aglutinación de látex se
utiliza para distinguir a los S. pyogene estos al
no producir el polisacáridos en su pared
celular este microorganismo se podrá
distinguir en la prueba de aglutinacion de
latex.
7. Si la prueba de Gonochek- II se le aplica a
la especie M. catarrhalis da color si la prueba
es específica para la especie Neisseria a que
bacteria se va a distinguir con esta prueba.
METODOLOGÍA:

ANÁLISIS DE RESULTADOS: sobre la muestra determinamos si la prueba es

positiva o negativa.
Prueba de la Catalasa

Para la realización de esta prueba realizaremos

la prueba sobre una colonia de Staphylococcus
aureus y Streptococcus pyogenes. Para la
realización de esta prueba, se utilizan de 1-2
gotas de una solución de peróxido de
hidrógeno al 3% sobre un portaobjetos,
utilizando una varilla de vidrio estéril Imagen 1. Prueba de la catalasa sobre una colonia de
tomamos una colonia aislada con la punta de Staphylococcus aureus, se observa la formación de
la varilla y rápidamente la frotamos sobre la burbujas.
gota. A partir de si se forma o no el burbujeo

Imagen 2. Prueba de la catalasa sobre una colonia de
Streptococcus pyogenes, no hay presencia de burbujas.
Con base en los resultados registrados, la
colonia de Streptococcus pyogenes es del tipo
catalasa negativa por la ausencia en la
formación de burbujas, por su parte la colonia
de S. aureus es de tipo catalasa positiva, esto
se observa por la formación de burbujas
provocada por la descomposición del peróxido
de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso.
Prueba de Coagulasa
Para la realización de esta prueba,
compararemos los resultados de una colonia
Staphylococcus epidermidis y una colonia de
S. aureus. El procedimiento de esta prueba
consiste en colocar una gota de agua en un
portaobjetos, después usando un asa tomamos
una muestra de una colonia aislada y la
frotamos sobre la superficie de la gota hasta
diluir, se esteriliza el asa y con una pipeta
agregamos una gota de plasma de conejo y
procedemos a agitar, la prueba es positiva si
transcurridos 15 segundos se forma un
precipitado.
Imagen 3. Prueba de la coagulasa sobre una colonia de S.
aureus, se observa la formación del precipitado.
Imagen 4. Prueba de la coagulasa sobre una colonia de S.
epidermidis, no se ha formado el precipitado.
Con base a los resultados obtenidos de la
prueba de la coagulasa, observamos que la S.
aureus es una bacteria coagulasa positiva, esto
debido a la formación de un precipitado sobre
la superficie de la gota que ocurre por la
formación de fibrina a partir de fibrinógeno y
actúa como coagulante, esta enzima coagulasa
se encuentra unida a su pared celular. Por otro
lado la bacteria S. epidermidis es coagulasa
negativa por la ausencia del precipitado, esto
puede ser un falso resultado ya que este
método no detecta la coagulasa libre.
Prueba de Oxidasa
Para la realización de esta prueba, se
comprobaron los resultados de una colonia de
Neisseria lactamica, Klabsiella pneumoniae y
Enterobacter aerogenes. El procedimiento de
esta prueba consiste en tomar un asa estéril y
tomar una muestra de una colonia aislada, el
asa se frota sobre un cuadrante de un reactivo
DrySlide y se espera por la formación o no del
color púrpura. El resultado es positivo si el
reactivo se torna de color púrpura.
Imagen 5. Prueba de la catalasa en las colonias de N.
lactamica, K. pneumoniae y E. aerogenes, en el
cuadrante superior izquierdo se observa la colonia de K.
pneumoniae la cual no forma el complejo de color, la
colonia de N. lactamica si forma el complejo de color
púrpura. Finalmente en el cuadrante inferior izquierdo se
observa la colonia de E. aerogenes que no forma el
complejo púrpura.
Con base a los resultados observados en la
prueba de oxidasa, las colonias de Klabsiella
pneumoniae y Enterobacter aerogenes no
cuentan con la enzima citocromo-oxidasa y
por lo tanto no pueden oxidar el compuesto de
la tira reactiva, es decir son oxidasas
negativas. Por otro lado, la colonia de
Neisseria lactamica si es capaz de formar el
complejo púrpura, signo de que cuenta con la
enzima citocromo-oxidasa y pueden oxidar el
compuesto de dicloruro de N,N-dimetil-1,4-
felinendiamonio en un compuesto de color
púrpura.
Prueba Rápida de Esteptococo tipo A
Para la realización de esta prueba, se
comprobaron los resultados de dos colonias de
estreptococos, principalmente en la
identificación de Streptococcus pyogenes que
cuenta con un grupo antígeno A. El
procedimiento de esta prueba consiste en
limpiar adecuadamente un tubo del casete, el
tubo se le agregan 4 gotas de la solución B del
kit y 4 gotas de la solución A, la solución del
tubo se torna de color verde al mezclarse bien,
usando un hisopo se recolecta la muestra y se
frota dentro del tubo durante 1 minuto, se le
coloca su corcho al tubo y se coloca una gota
del tubo sobre la rendija indicada, después de
5 minutos se observa el resultado, si se forma
una línea rosada o roja ede manera vertical
entonces el resultado es positivo, si por otro
lado no se forma la línea vertical entonces el
resultado es negativo.
Imagen 6. Resultado de la prueba rápida de estreptococo
A, se observa que la muestra es positiva por la formación
de una línea vertical roja en el kit.
Imagen 7. Resultado de la prueba rápida de estreptococo
A, se observa que la muestra es negativa, ya que después
de los 5 minutos no se ha formado la línea roja.
Con base a los resultados obtenidos, podemos
afirmar que la primera muestra contiene una
muestra de S. pyogenes, esto se sabe ya que se
ha formado la línea roja que representa que la
muestra tiene el grupo A mediante este ensayo
inmunológico.
Prueba de Aglutinación de Látex
Para la realización de esta prueba se comparan
los resultados de un control ABC, un control
FG y dos muestras desconocidas, de acuerdo a
la formación de la aglutinación o la ausencia
de estas. El procedimiento de esta prueba es
colocar una gota de cada reactivo (A, B, C, F y
G) en su óvalo correspondiente (1, 2, 3, 4 y 5
respectivamente) a la que se le agrega una gota
del control ABC sobre cada óvalo, se agitó
durante 15 segundos y transcurrido ese tiempo
se observa la aglutinación, al ser un control
solo se aglutinan los reactivos A, B y C; si
repetimos este procedimiento con el control
FG solo se aglutinan los reactivos F y G. Para
identificar las muestras se repite este
procedimiento, en una tira se coloca los
reactivos A, B, C, E y G y se coloca una gota
de la muestra en cada reactivo, se agita por 15
segundos y se observa si en los reactivos se
forma el aglutinamiento.
Imagen 8. Prueba rápida de aglutinación de látex sobre Imagen 10. Resultado de la prueba de Gonochek II, se
una muestra problema, la aglutinación solo se observa en forma un color amarillo en el tubo.
el reactivo A.

Imagen 11. Resultado de la prueba de Gonochek II, no se

Imagen 9. . Prueba rápida de aglutinación de látex sobre ha formado ningún color en el tubo.
una muestra problema, la aglutinación solo se observa en
el reactivo F.

Con base a los resultados obtenidos, podemos

observar que la primera muestra ha
reaccionado únicamente con el reactivo A, lo
que nos indica que la muestra es de S.
Imagen 12. Resultado de la prueba de Gonochek II, se
pyogenes ya que esta es la única especie que forma un color azul en el tubo.
presenta este comportamiento, esta reacción
ocurre por el polisacárido en la pared celular
del microorganismo.

Prueba de Gonochek II

Para la realización de esta prueba, se Imagen 13. Resultado de la prueba de Gonochek II, se
dispondrán de 4 muestras de colonias forma un color rojo en el tubo, fue necesario agitar la
bacterianas, se sabe que pertenecen al género muestra por segunda ocasión desechando la tapa blanca.
Neisseria sin embargo se desconoce la especie
Con base a los resultados obtenidos, podemos
a la que pertenece cada colonia. Para el
observar que en la primera muestra se presenta
procedimiento de esta prueba, se toma un asa y
un color amarillo, se ha determinado que la
se esteriliza siempre antes y después de
especie pertenece a la N. meningitidis que
utilizarse, se toma una colonia aislada de una
produce y-glutamil aminopeptidasa e hidrolisa
muestra y se coloca en uno de los tubos con
y-glutamil-p-nitroanilina, esto produce un
reactivo, se agita y se deja incubar durante 30
compuesto amarillo de p-nitroanilina. La
minutos. Dependiendo de la formación de un
segunda muestra no ha formado ningún color
color, se determina la especie a la que
incluso al agitar el tubo por segunda ocasión,
pertenece la muestra, N. lactamica produce un
por lo que pertenece a la especie M.
color azul, N. meningitidis produce un color
catarrhalis. La tercera muestra presenta un
amarillo, N. gonorrhoeae produce un color
color azul, por lo que se ha determinado que la
rojo mientras que algunas colonias como M.
muestra pertenece a la especie N. lactamica
catarrhalis no produce cambios de color al no
que produce la enzima beta galactosidasa y
contener las enzimas requeridas.
mediante la hidrólisis de una molécula de 5-
bromo-4-cloro-indol-b-D-galactosidasa
produce un compuesto azul. La última muestra
presenta un color rojo después de agitarse por
segunda ocasión, por lo que se determina que
pertenece a la especie N. gonorrhoeae que
produce la enzima hidroxi prolil
aminopeptidasa, esta enzima hidroliza el ácido
b-naftilamino en un producto b-naftilamina
que forma una sal de diazonio de color rojo.
CONCLUSIÓN:
Lowe AM, Bealtie DT, Deresewiccs RL.
Identification of novel staphylococcal
virulence genes by in vivo expression
technology. Mol Microbiol. 1998;27:967-76.
Que YA, Haefliger JA, Franciolli P, Moreillon
P. Expression of Stapylococcus aureus
Clumping Factor in Lactocccus lactis subsp
cremoris using a new shutle vector. Inf
Immunity. 2000;68(6):3516-22.

Una de la tareas fundamentales del laboratorio

de microbiología es la aplicación de una
metodología precisa que permita la
identificación de los microorganismos
implicados en procesos clÌnicos asociados a
infecciones o de aquellos que tienen relación
con el hombre
Con el objetivo de identificar el agente
etiológico responsable del proceso infeccioso
y para conocer las implicaciones
patogénicas/patológicas, la evolución clínica,
y aplicar una terapia antimicrobiana eficaz, un
pilar fundamental en la práctica de la
microbiología clínica lo constituye la
asignación de especie a un aislamiento
microbiano. De manera rutinaria, el
laboratorio de microbiología aplica técnicas
fenotípicas que permiten lograr los objetivos
expuestos.

REFERENCIAS:

Hadju J, Wyss SR, Aebi H. Properties of

human erythrocyte catalases after crosslinking
with bifunctional reagents: symmetry of the
quaternary structure. Eur J Biochem 1977;
80:199-207.

Fita I, Rossman MG. The NADPH binding site

on liver catalase. Proc Nat Acad Sci USA
1985;82:1604-8.

Kirkman HN, Gaetani GF. Catalase: a

tetrameric enzyme with four tightly bound
molecules of NADPH. Proc Nat Acad Sci
USA 1984;81:4343-7.