CROMATOGRAFÍA

•La cromatografía es un conjunto diverso de métodos que permite

separar componentes estrechamente relacionados o mezclas complejas

•En estas separaciones la muestra se desplaza con una fase móvil:

móvil: gas,
líquido o fluido supercrítico

•La fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria con la
que es inmiscible y que se fija a una columna o a una superficie sólida

•Los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre

la fase móvil y estacionaria

•Los componentes que son fuertemente retenidos por la fase

estacionaria se mueven lentamente con el flujo de fase móvil, los que se
unen débilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez

•Los componentes se separan en bandas o zonas que pueden analizarse

cuantitativa o cualitativamente
 CROMATOGRAFÍA
•Los métodos cromatográficos se pueden separar de dos modos
distintos:

1. Forma en que las dos fases (estacionaria y móvil) se ponen en

contacto::
contacto
•En columna: Un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a
través de la que pasa la fase móvil
•En plano: La fase estacionaria se fija a una placa plana o a
los intersticios de un papel y la fase móvil se desplaza por
gravedad o capilaridad

2. Tipo de fase móvil y estacionaria y equilibrios implicados

Sólo la cromatografía de líquidos (fase móvil líquida) puede
llevarse a cabo en plano o columna, para gases (fase móvil
gas) y fluidos supercríticos (fase móvil fluido supercrítico) la
cromatografía siempre es en columna
CLASIFICACIÓ
CLASIFICACIÓN DE LOS MÉ
MÉTODOS CROMATOGRÁ
CROMATOGRÁFICOS EN COLUMNA

Clasificación general Método específico Fase estacionaria Tipo de equilibrio

Líquido-líquido Líquido adsorbido sobre un Distribución entre líquidos
(reparto) sólido inmiscibles
Líquido-fase unida Especies orgánicas Distribución entre el
químicamente enlazadas a una superficie líquido y la superficie
(reparto) sólida enlazada
Cromatografía de líquidos
Líquido-sólido
(LC) Sólido Adsorción
(adsorción)
Fase móvil: líquida
Resina de intercambio
Intercambio iónico Intercambio iónico
iónico

Líquido en los intersticios

Exclusión por tamaño Distribución/Exclusión
de un sólido polimérico

Líquido adsorbido sobre un Distribución entre un gas y

Gas-líquido
sólido un líquido
Cromatografía de gases (GC)
Fase móvil: gas Especies orgánicas
Gas-Fase unida Distribución entre el gas y
enlazadas a una superficie
químicamente la superficie enlazada
sólida
Gas-sólido Sólido Adsorción

Cromatografía de fluidos
Especies orgánicas
supercríticos(SFC) Fluido supercrítico- Fase Distribución entre el SFC y
enlazadas a una superficie
Fase móvil: fluido unida químicamente la superficie enlazada
sólida
supercrítico

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN PLANO

•Cromatografía en capa fina (TLC “Thin layer chromatography” o CCF)
•Cromatografía en papel (PC)
•Electrocromatografía (EC)
Cromatografía de elución en columna
 Cromatografía de elución en columna
• Dilución del analito:
analito:
-El tamaño de la banda que contiene los analitos es notablemente
más pequeño que las dos zonas que llegan al detector, se produce una
dilución de los analitos mientras son separados
-Los detectores empleados deben ser más sensibles que si el proceso
de separación no fuera necesario

• Cromatogramas
-Si un detector se coloca al final de la columna y se registra su señal
en función del tiempo se obtienen una serie de picos, el gráfico se
llama cromatograma
-Los cromatogramas sirven para análisis cualitativo y cuantitativo
-La posición de los picos en el eje tiempo puede servir para
identificar componentes de una muestra
-Las áreas de los picos proporcionan una medida cuantitativa de la
cantidad de cada componente
 Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)
(cuando se emplean partículas de fase estacionaria muy pequeñas y una presión de entrada relativamente alta)
 Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)
• CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
REPARTO::
-Es el tipo de cromatografía de líquidos que más se emplea
-Hay dos tipos: Líquido-líquido (inconveniente solubilidad y no se
puede usar para elución con gradiente) y de fase unida químicamente
• Columnas para cromatografía de fase unida químicamente
-Los soportes se preparan con sílice o composiciones de sílice:
partículas resistentes, porosas y uniformes
-La superficie de la sílice se hidroliza formando grupos silanol
químicamente reactivos

-Los recubrimientos de fase unida químicamente más utilizados son

los siloxanos, que se forman por reacción del silanol con un
organoclorosilosano
 Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)
• CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
REPARTO::
• Rellenos de fase normal e inversa
-Cromatografía en fase normal: Fase estacionaria de alta polaridad y
fase móvil apolar
-Cromatografía en fase inversa: Fase estacionaria no polar y fase
móvil relativamente polar (agua, metanol, acetonitrilo…)
-En cromatografía en fase inversa los componentes polares aparecen
primero
-Los más empleados son los rellenos de fase inversa, el pH no debe
superar 7.5 porque se produce la hidrólisis del siloxano y se destruye
el relleno
 Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)
• CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
REPARTO::
• Aplicaciones
-Fármacos (antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos…)
-Bioquímico (aminoácidos, proteínas, péptidos…)
-Productos de alimentación (edulcorantes artificiales, antioxidantes…)
-Productos de la industria química (aromáticos, tensioactivos,
colorantes…)
-Contaminantes (Pesticidas, herbicidas…)
-Química forense (Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos…)
-Medicina clínica (ácidos biliares, metabolismo de drogas,
estrógenos…)
 Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)
• CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
ADSORCIÓN::

-Las fases estacionarias utilizadas son: sílice y alúmina

-Los componentes adsorbidos avanzan con distinta velocidad, las
sustancias más retenidas por la fase estacionaria avanzarán menos
-La única variable que se puede optimizar para mejorar la resolución de
los picos es la composición de la fase móvil
• Aplicación
-Separación de isómeros en mezclas
 Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)
• CROMATOGRAFÍA IÓNICA O DE INTERCAMBIO IÓNICO
IÓNICO::
-Las fases estacionarias utilizadas son: resinas de intercambio iónico
-Intercambio entre los iones de una disolución y los del mismo signo
que están en la superficie de un sólido
-Antiguamente: Intercambiadores iónicos naturales: Arcillas y zeolitas
-A partir de 1930 resinas de intercambio iónico sintéticas para
disminuir la dureza del agua, desionización de agua y purificación de
disoluciones
-Resinas de intercambio catiónico: -SO3H+, -COO-H+
-Resinas de intercambio aniónico: NCH3+OH-, N(CH3)3OH-
• Aplicaciones
-Variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos: fármacos, sueros,
conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas, azúcares y
preparaciones farmacéuticas
 Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)
• CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
-Las fases estacionarias utilizadas son: pequeñas partículas
poliméricas o de sílice con una red de poros donde difunden soluto y
disolvente
-Las moléculas se atrapan en los poros y se eliminan por el flujo de fase
móvil
-Las moléculas más grandes que el tamaño medio de los poros del
relleno son excluidas, no se retienen, se eluyen las primeras
-Las moléculas pequeñas penetran en el laberinto de poros y se retienen
más tiempo
• Aplicaciones
-Separación de sustancias de alto peso molecular y bajo: proteínas de
aminoácidos y péptidos
-Separación de homólogos y oligómeros: sacarosa (glucosa+fructosa)
 Cromatografía en plano
• CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)
-Se emplea una capa fina y delgada del material que a la vez es soporte
o se recubre una superficie de vidrio (cromatoplacas), plástico (PET) o
metálica (Al), estas placas se llaman cromatofolios
-Tipos de sorbente más utilizados: gel de sílice y alúmina
-Sirve de guía para desarrollo de condiciones óptimas para separación
por cromatografía de líquidos en columna, es un procedimiento rápido y
de bajo coste
-Aplicaciones
-Industria farmacéutica: controles de pureza del producto
-Laboratorios clínicos: estudios bioquímicos y biológicos
-Laboratorios industriales
Cromatografía en plano: Cromatografía en capa fina (TLC)

http://politube.upv.es/play.php?vid=54351
 Cromatografía en plano: Cromatografía en papel
Descendente Ascendente

1: aplicación de la muestra
2: se sumerge el extremo inferior en la fase móvil
3 a 5: la fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo la separación
de los componentes
6: se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa
7: revelado de los componentes ya separados y medida de su avance