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TALLER

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR-TIPOS DE PCR

IBAÑEZ CORDOBA LUIS FELIPE


SÁNCHEZ GUIZADO ESTEFANNY ESTHER

DOCENTE
ANDERSON RAMIREZ

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR


FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
MICROBIOLOGÍA
VALLEDUPAR/CESAR
2020
LA PCR MÚLTIPLE EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
https://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-
clinica-28-articulo-la-pcr-multiple-microbiologia-clinica-13058027
PCR Múltiple
Muestras clínicas de cultivos invitro
Tipo de muestra
Enterococcus sp. y Staphylococcus sp.
enterocócicos vanA y vanB y estafilocócicos femB,
Los genes
ileS-2 y mecA a partir de distintas mezclas.
VAN B 1100Pb
VAN A 720Pb
Fem B 700Pb Tamaño del gen
ileS-2 486Pb
mecA 300Pb

No encontrado Condiciones
No encontrados Primer
Nucleótidos, desoxinucleótidos trifosfato o dNTP,
que se almacenan como una solución stock de
100 mM.
Amortiguador para PCR Estándar 10x, que deberá
contener: 500 mM de KCl, 100 mM de Tris-HCl, pH
ajustado a 8.3 (a 24 °C) y 15 mM de MgCl2. 1
Taq ADN Polimerasa. Reactivos
Aditivos como dimetil sulfóxido o DMSO, albúmina
de suero bovino o BSA y glicerol. 
Cebadores.
ADN Genómico que se recomienda que sea
preparado utilizando un protocolo estandarizado
de dodecil sulfato de sodio / proteinasa K.
Numero Max de bandas 5 mínimo 1 Numero de bandas
M, Marcador de Peso Molecular XIV (Roche
Diagnostics); 1, Enterococcus faecalis V 583
(vanB)/ Staphylococcus aureus 242 (femB, ileS-2 y
mecA); 2, Enterococcus faecium BM 4147
(vanA)/S. aureus 242 (femB, ileS-2 y mecA); 3, E.
faecalis ATCC 29212/ S. aureus
ATCC 29213 (femB); 4, E. faecalis V 583
(vanB)/S. aureus ATCC 29213 (femB); 5, E.
faecium BM 4147 (vanA)/ S. aureus ATCC 29213
(femB); 6, E. faecalis V 583 (vanB)/S. aureus
SEIMC (femB, mecA); 7, E. faecium BM 4147
(vanA)/ S. aureus SEIMC (femB, mecA); 8, E.
faecalis V 583 (vanB)/S. epidermidis (ileS-2,
mecA); 9, E. faecium BM 4147 (vanA)/ S.
epidermidis (ileS-2, mecA); 10, control sin ADN
molde. La electroforesis fue corrida en gel al 2%
de agarosa y, posteriormente, teñido con bromuro
de etidio. Esta figura fue previamente publicada
por Ramos-Trujillo et al28.

Detección de Bartonella bacilliformis usando PCR-RFLP


http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-
46341998000100007
PCR rflp
16 sanguíneas Tipo de muestra
Bartonella bacilliformis Microorganismo a buscar
citrato sintasa Gen
Procedimientos y recticos de
extracción, enzimas de corte
Para la extracción de ADN a partir de sangre y
aislamientos de cultivo in vitro se utilizó el método
fenol/cloroformo6. Brevemente, 200 microlitros de sangre
total o suspensión bacteriana fue centrifugada y el
sedimento es Re suspendido en una solución de lisis
conteniendo proteinasa K e incubado a 65°C por 1 hora.
Las muestras fueron tratadas con fenol-cloroformo y el
ADN del sobrenadante fue
precipitado con etanol y Re suspendido en agua.

Cincuenta nanogramos de ADN purificado es sometido a


PCR, utilizando oligonucleótidos dirigidos al gen del
citrato sintasa de Bartonella (proporcionados por la Dra.
Barbara Ellis) y la ADN Polimerasa termoestable.
una desaturación inicial de 95°C por 10 minutos; 35
ciclos de 95°C por 30 segundos, 45°C por 45 segundos,
72°C por 45 segundos; y una extensión final de 72°C por Condiciones
10 minutos. La amplificación es observada en geles de
poliacrilamida al 10% y teñidos con bromuro de etidio.

Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), sustratos


para polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores o iniciadores
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+),
agregado comúnmente como cloruro de magnesio
(MgCl2), o algún otro catión divalente. Actúan como
cofactores de la polimerasa.
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solución tampón o buffer que mantiene el pH
adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con
temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común
es la polimerasa Taq).
ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a
amplificar.
380pb Tamaño de la amplificación
enzimas de restricción fueron
TaqI y HinfI
usadas
2 Numero de cortes
Carril 1: Marcador de Peso Molecular PhiX174/Hae III; Interpretación de las bandas
Carril 2: Producto de amplificación del gen citrato
sintasa; carril
3: producto de amplificación cortado con TaqI
Carril 4: producto de
amplificación cortado con HinfI.

Pcr convencional
A partir de un cultivo puro en agar trispticasa soya Muestra
Chlamydia trachomatis Microorganismo
C. trachomatis VR885D Gen
Reactivos

95°C/4 min, 40 ciclos (95°C/1 min; 56°C/1 min; Condiciones


72°C/1.5 min) y 72°C/4 min

200Pb tamaño
CtP15'TAGTAACTGCCACTTCATCA-3'
los cebadores
CtP2 5'- TTCCCCTTGTAATTCGTTGC-3
Se pudo de detectar el ADN bacteriano en el carril 13-
Interpretación
14-15-16-17
Validación técnica de una PCR: Reacción en cadena de la polimerasa para
la detección de Chlamydia trachomatis
http://rcientificas.uninorte.edu.co/index.php/salud/article/viewArticle/5668/10386

RT-PCR
Las muestras de sangre han sido obtenidas en la
Unidad de Melanomas del Servicio de Dermatología
del Hospital Clínico San Cecilio de Granada. El grupo Tipo de muestra
de análisis ha estado formado por 28 pacientes con
MM en estadio III
Humanos Organismo
tirosinasa gen
El proceso se realizó mediante un Kit comercial
(Promega) donde cada tubo de reacción contenía un
volumen total de 20 µl, compuesto de: ARN (1 µgr),
tampón de transcriptasa reversa (100 mM Tris-HCl, pH
8,8 a 25oC; 500 mM KCl; Tritón X-100), proteína Reactivos
inhibidora de ARNasa (rRNAsin) (0.4 µmol),
transcriptasa reversa (AMV) (24 U), Poli T (oligo-
dTprimer) (1 mmol), dNTPs (10 mM) y agua hasta 20
µl
la amplificación del gen de la tirosinasa fueron 1 min
para la desnaturalización del ADN a 94oC, 2 min de
acoplamiento entre los cebadores y el ADN diana a Condiciones
58o C, y 3 min de extensión a 72oC. Se realizaron 30
ciclos con una extensión final de 7 min a 72oC.
248 Pb Tamaño del gen
ME-1 (sentido): 5'-TTG GCA GAT TGT CTG TAGCC-
3' y ME-2 (antisentido): 5' AGG CAT TGT GCA
TGCTGCTT-3'La integridad del ARN fue determinada
usando los primers correspondientes al ADNc de ß- Primers
actina: 5' ATC ATG TTT GAG ACC TTC AA 3'
(sentido) y 5' CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA 3'
(antisentido).