Tinciones diferenciales o compuestas

En estos tipos de tinciones se observarán varios colores debido a que se usa más
de un colorante, basándose en el hecho que las celulas tienen distinta composición
químicas.

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Método de tinción compuesto: Gram – Preston Morrel (modificado)

es definida como una tincion diferencial ya que utiliza dos colorantes que clasifica
a las bacterias en dos grupos gram negativas y grant positivas los principios de la
tinción gran están basados en las características de la pared celular de la bacteria
la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo, la pared
celular de las bacterias gram-negativas está compuesta por una capa fina de
peptidoglicano y en la membrana celular externa las bacterias gram-negativas
tienen un tlipopolisacárido en cambio las bacterias gram positivas tienen una capa
más gruesa del peptidoglicano en el cual encontramos el ácido teicoico y el ácido
lipoteico, que son un sistema de anclaje pero la diferencia de éste es que no
cuenta con una membrana celular externa lo cual le diferencia a la hora de la
tinción

Gram negativo: las bacterias que no retienen el colorante cuando se las decolora
con alcohol o acetona. Y para ser observadas se añade una contratación tomando
un color rojo a rosado
Gram positivas: bacterias que si retienen el colorante cuando se las decolora con
alcohol o acetona, quedando de un color azul-violeta.
Clasifica las bacterias como:
• Cocos grampositivos.
• Bacilos grampositivos.
• Cocos gramnegativos.
• Bacilos gramnegativos

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Materiales
• Asa bacteriológica
• Portaobjetos
• Mechero Bunsen con manguera
• Piseta
• Goteros
• Encendedor
• Gradilla
Aparatos y equipo
 • Microscopio
• Cronometro digital
Reactivos
• Solución de cristal violeta
• Solución de yodo
• Solución de alcohol acetona
• Safranina
• Aceite de inmersión
• Agua destilada
• Cepas

Reacciones de las soluciones

Cristal violeta – colorante primario 1 minuto

Se une a la pared bacteriana por su afinidad con el peptidoglicano.

Licor de gram – mordente 3 minutos

Es un mordente, lo cual quiere decir que fija el colorante e impide la salida del cristal violeta así
se aplique un colorante.
Yodo hace que sean insolubles en agua y moderadamente solubles en alcoholes, es la razón
por la cual el yodo se aplica después del colorante.

Alcohol cetona – decolorante

30 segundos
Deshidrata la pared bacteriana
Destruye la membrana externa de las bacterias
Gram negativas debido a que es soluble al alcohol
acetona que es un disolvente orgánico.

Safrinina – colorante de contraste 1 minuto

Funciona como un colorante secundario y sirve para teñir las bacterias que no se pudieron teñir
con el complejo cristal viloeta-lugol.
La safrinina tiñe el citoplasma de las bacterias. Otros: fuscina, pironina o rojo neutro

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I
Procedimiento de la tinción de Gram

Según González et al. (1), los pasos a seguir en la tinción de Gram son los siguientes:
1. Colocación de una microgota de muestra en el portaobjetos (figura 1).
2. Se hace la extensión de la muestra y se la homogeniza con el asa bacteriológica. (figura 2).
3. Fijación del frotis con calor, pasando el portaobjetos de 3 a 4 veces por encima de la llama del mechero de
Bunsen (figura 3),
4. la temperatura del portaobjetos no debe sobrepasarse para esto se lo comprueba poniendo el portaobjetos
en la parte interna de la mano (figura 4).
5. Se añade la solución de cristal violeta y se deja actuar por 1 minuto (figura 5).
6. Posteriormente se lava el portaobjetos (figura 6).
7. Se aplica Lugol en la muestra y se deja actuar durante 3 minutos (figura 7).
8. Se vuelve a lavar el portaobjetos (figura 8).
9. Añadir gotas de alcohol acetona por 30 segundos hasta que se decolore (figura 9).
10. Lavar el portaobjetos usando el chorro de una piseta (figura 10).
11. Aplicación del colorante de contraste de safranina por 1 minuto igualmente (figura 11).
12. Volver a lavar con agua mediante el chorro de una piseta (figura 12), se la deja secar al aire libre.
13. Con los objetivos de 40x y 100x del microscopio se realiza la observación haciendo uso del aceite de
inmersión (figura 13).

Interpretación del método:

• Las bacterias Gram positivas se observarán de color azul-violeta.
• Las bacterias Gram negativas se observarán de color rojo-rosa.
Ziehl- Neelsen

Tinción de Ziehl Neelsen o ácido resistente

La tinción Ziehl Neelsen o de ácido alcohol resistencia, ha demostrado ser una de las tnciones
característcas más útles y signifcatvas para separar los bacilos tuberculosos y los microorganismos
relacionados.
Es una técnica rápida, fácil y de bajo costo, lo que permite que se pueda realizar en casi cualquier
laboratorio clínico.
Esta tinción permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de resistr la
decoloración con alcohol-ácido y aquellos que no lo son. Las muestras clínicas útles para su uso son
múltples, como el líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido sinovial, líquido pericárdico,
biopsias para cultvo.

algunos de los microrganismos que pueden ser teñidos mediante ésta técnica de tinción.
Mycobacterium tuberculosis
Es el principal representante de las microbacterias. Se caracterizan por ser bacilos Gram positvos,
ácido alcohol resistentes, ligeramente curvados, aerobios estrictos, inmóviles, no formadores de
esporas ni cápsulas y de crecimiento lento.
Mycobacterium phlei
Varios bacilos ácido-alcohol resistentes encontrados en las plantas, en el suelo y en el agua, se
cultivan con más rapidez que los bacilos de la tuberculosis.

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Reacciones de las soluciones

Colorante primario – carbolfucsina
5 minutos
Se tiñen de rosa intenso todas las bcaterias

Alcohol acido- decolorante

30 segundos
Baar positivos mantienen color rosa intenso
Baar negativo se decoloran

Azul de metileno – colorante de contraste

1 minuto
Baar positivo mantienen el color rojo intenso
Baar negativo se tiñen de azul

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Procedimiento de la tinción de Ziehl Neelsen.
1. Colocar en el portaobjetos una microgota de agua
2. Realizar una extensión con el material a estudiar y homogeneizar con ayuda del
asa bacteriológica
3. Fijar el frots con calor pasando el portaobjetos de 3 a 4 veces por encima de la
llama del mechero Bunsen, cuidando que no se exceda la temperatura de
exposición al calor, empleando como referencia que el calor del portaobjetos
pueda ser tolerable para la parte interna de la mano.
4. Colocar las gotas necesarias de Carbolfucsina para cubrir la muestra
5. Calentar por 5 min a emisión de vapores del colorante, para permitr la fjación del
colorante primario en las paredes celulares bacterianas. Para esto se debe hacer
uso del mechero y pasar su fama directamente debajo del portaobjetos, retrándolo
de éste cuando se observe el vapor que se desprende de la muestra, pero sin
dejar que hierva.
6. Lavar con agua
7. Decoloración con alcohol ácido; H2SO4 al 3% en etanol a 95% (fgura 81) y lavar
con agua, durante 1 min.
8. Agregar el colorante secundario o de contraste (azul de metleno durante 30 s) y
lavar con agua.
9. Observar al microscopio con objetvos de aumento de 40 y de 100
PREGUNTAS:
1-Que es un atincion diferencial
a) Reacciones diferentemente con diferentes microorganismos
b) Aquella que se usa para diferenciar entre bacterias
c) Aquellas que utilizan más de un colorante
d) Todas son correctas

2-Las bacterias gran negativas son

a) Son aquellas que no contienen reacciones de las soluciones
b) bacterias que no retienen el colorante cuando se las decolora con alcohol
c) Son aquellas que se tiñen de azul violeta
d) Son aquellas que no necesitan colorantes de contraste, alcohol o acetona

3-Las bacterias gran positivas son

a) son aquellas cuyas soluciones no afectan a la bacterias
b) bacterias que no retienen el colorante cuando se las decolora con alcohol
c) bacterias que si retienen el colorante cuando se las decolora con alcohol
d) todas son correctas

4-Para que sirve el método de tinción de gram

a) técnica de coloración de microorganismos para la identificación de patógenos u
hongos
b) para saber si usted tiene una infección bacteriana así también infecciones por
hongos
c) para facilitar la detección del cryptococos neoformans
d) para la identificación de bacterias esporuladas

5-La tinción de gran clasifica a las bacterias como

a) Cocos grampositivos.
b) Bacilos grampositivos.
c) Cocos gramnegativos y bacilos gramnegativos
d) Todas son correctas

6-Como esta compuesta la pared de las bacterias gran negativas

a) Compuesta por bacilos ácido-resistentes como el mycobacterium tuberculosis
b) compuesta por una capa fina de peptidoglicano
c) compuesto por una capa gruesa de peptidoglicano
d) las bacterias gran negativas no poseen pared

7-Como esta compuesta la pared de la bacterias gran positivas

a) Compuesta por Cocos grampositivos.

b) Compuesta por Bacilos grampositivos.
c) Compuesta por Cocos gramnegativos
d) Compuesta por una capa más gruesa del peptidoglicano
8-en la capa mas gruesa de pertidoglicano de las bacetrias gran positiva
encontramos
a) se encuentran microorganismos no patogenos
b) se encuentran ácido teicoico
c) se encuentran ácido lipoteicoico
d) b y c son correctas

9- de que color se tornan las bacterias gran negativas cuando se las decolora con
alcohol o acetona
a) de color azul violeta
b) de color rojo a rosado
c) de color rojo y violeta
d) de color azul y rosado

10- de que color se tornan las bacterias gran positivas cuando se las decolora con
alcohol o acetona
a) no se tiñen de ningún color
b) de un color rojo a rosado
c) de un color azul-violeta
d) a y b son correctas

11- Que es la tinción de Ziehl- Neelsen

a) Es una técnica de laboratorio que consiste en teñir a los bacilos ácido-resistentes

b) Es un examen de microscopía directa de las cápsulas de muchos
microorganismos
c) A y b son correctas
d) Ninguna es correcta

12- Para que sirve la tinción de Ziehl- Neelsen

a) Para separar los bacilos tuberculosos y los microorganismos relacionados
b) Para separar microorganismo patógenos
c) Para detectar infección por hongos
d) Ninguna es correcta

13- la tinción de Ziehl- Neelsen puede separar bacilos tuberculosos?

a) Verdadero
b) Falso

14- esta tinción permite diferenciar a la bacterias en dos grupos y estos son:
a) aquellos que son capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido
b) aquellos que no son capaces de resistr la decoloración con alcohol-ácido
c) ninguna es correcta
d) a y b son correctas

15- como están cubiertos las microbacterias en el método de tinción de Ziehl-

Neelsen
a) Están cubiertos en su exterior por un material acuoso y grueso
 b) están cubiertas por un material grueso y ceroso
c) están cubiertos por un material que resiste la tinción
d) b y c son correctas

16- los microroganismo como el Mycobacterium phlei se encuentran en las plantas,

suelos y el agua?
a) Verdadero
b) Falso

17- los microroganismo como el Mycobacterium tuberculosis son movile,

formadores de esporas y capsulas?
a) Verdadero
b) Falso

18- En la técnica convencional de Ziehl Neelsen se suele utlizar calor?

a) Verdadero
b) falso
19- las celulas bacterianas resisten la decoloración por disolventes orgánicos
fuertes, como el alcohol ácido, debido al ácido micólico que se encuentra presente.
a) Verdadero
b) Falso

20- Estas bacterias se caracterizan por su posesión única de ciertos tpos de ácidos
grasos, alcoholes y carbohidratos
a) Verdadero
b) falso