UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

FITOPATOLOGÍA

INFORME DE PRÁCTICA N° 4

ESTUDIANTE:

Quiroz Malqui, Natalia Fabiola

DOCENTE:

Gil Rivero, Armando Efraín

Ciclo IV
Sección “B”
Trujillo, mayo del 2023
 FITOPATOLOGÍA
INFORME DE PRÁCTICA N° 4
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y CULTIVO DE PATÓGENOS (BACTERIAS)

I. INTRODUCCIÓN
La mayoría de las enfermedades de las plantas se diagnostican al
observarlas a simple vista o mediante el microscopio, lo cual hace
innecesario el aislamiento del patógeno. Sin embargo, hay muchas
enfermedades fungosas en las que es imposible identificar al patógeno que
ya se encuentra mezclado con uno o más contaminantes, porque aún no ha
producido sus cuerpos fructíferos característicos y esporas, debido a que
una misma enfermedad puede deberse ya sea a uno o a varios patógenos
morfológicamente semejantes o tal vez a algún factor del ambiente, o bien
a que la enfermedad es causada por un nuevo patógeno hasta ese momento
desconocido, el cual debe aislarse y estudiarse. Como es habitual, los
patógenos de enfermedades desconocidas deben aislarse de los tejidos
enfermos de una planta a fin de que se pueda llevar a cabo un estudio de
sus características, hábitos, etc.

II. OBJETIVO
- Conocer las técnicas de aislamiento de los patógenos que causan
enfermedades en las plantas.
- Definir medios de cultivo, señalando los diferentes constituyentes básicos
de un medio de cultivo e indicar la función de cada uno de ellos.
- Clasificar los medios de cultivo, según: el estado físico, la naturaleza de
sus constituyentes y los propósitos de uso.

MEDIOS DE CULTIVO
De manera general se denomina “medio de cultivo” a cualquier material que presente
una adecuada combinación de nutrientes para permitir el crecimiento o el incremento
del número de células de una población de microorganismos. (Fig. 53).

Constituyentes básicos de los medios de cultivo

1. Fuentes de energía
1.1 Orgánicas: carbohidratos, proteínas, polisacáridos, grasas, ácidos orgánicos, etc.
1.2 Inorgánicas: Ej. amonio, nitritos, azufre, etc.
1.3 Luz.
2. Componentes estructurales celulares
2.1 Componentes principales: Carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre,
fósforo, potasio, magnesio, calcio, hierro y sodio.
2.2 Elementos trazas: Cobalto, zinc, molibdeno, cobre y manganeso.
2.3 Factores de crecimiento: Se llama así a cualquier compuesto orgánico que un
microorganismo requiere como precursor o constituyente de su material orgánico
celular, pero que no puede sintetizarlo a partir de sus fuentes de carbono más simples,
por lo que se le debe proporcionar como nutriente. Ej. aminoácidos, purinas,
pirimidinas y vitaminas.
3. Agua

Clasificación de los medios de cultivo

1. Según su estado físico
1.1 Líquidos
Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua.
Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej. Caldo
nutritivo.
1.2. Sólidos
Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes
solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el
aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar
nutritivo.
2. Según la naturaleza de sus constituyentes
2.1 Medios naturales o complejos
Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y usualmente
se complementan con el añadido de minerales y otras sustancias. No se conocen todos
los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que están presentes.
Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras.
2.2 Medios sintéticos o químicamente definidos
Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto se puede
conocer exactamente su composición cualitativa y cuantitativa. Por su costo sólo se
emplean en procedimientos especiales.
3.Según sus propósitos de uso
3.1 Medios de enriquecimiento
Se llama enriquecimiento a cualquier cultivo en medio líquido que resulte en un
incremento en el número de un tipo dado de microorganismo en relación con el
número de otros tipos de microorganismos que puedan estar en el inóculo. Un medio
de enriquecimiento puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del
microorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de los otros tipos de
microorganismos presentes. La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está
determinada únicamente por la composición química del medio usado, sino que en un
medio dado puede ser variada significativamente modificando otros factores tales
como: temperatura, pH, fuerza iónica, iluminación, aireación etc.
3.2 Medios selectivos
Son básicamente iguales a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios
sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.
3.3 Medios diferenciales
No contienen sustancias inhibidoras, es decir, permiten el crecimiento de muchos tipos
de microorganismos, pero si contienen indicadores de productos derivados de la
actividad metabólica de los microorganismos sobre algunos de los componentes del
medio. Se utilizan para la identificación de los microorganismos. Ej.: Agar base rojo
fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratos.
 Fig.53. Diferentes medios de cultivo

AISLAMIENTO

Los géneros que se encuentra con relativa frecuencia en la naturaleza, por ejemplo, sobre los
frutos en putrefacción, semillas, forrajes, cueros, maderas, etc. También se lo encuentra
normalmente en el suelo. Para aislarlo se tiene en cuenta su estado natural, procediendo luego
de acuerdo con las técnicas siguientes:

a) POR DILUCIÓN EN AGAR:

Una serie de 4 a 6 tubos de cultivo, cada uno de los cuales contiene 10 ml de un medio de agar
adecuado (Medio de Czapeck, medio de Sabouraud, medio de malta), se calienta en baño de
agua para fundir el agar. Enfriar el contenido de los tubos a 45º C; se añade a cada uno de ellos
una pequeña cantidad del material que contiene el moho agitando cuidadosamente, se lleva
una pequeña porción a un segundo tubo y el resto se vierte asépticamente en una placa de Petri;
se agita el segundo tubo y se separa una pequeña porción para el tercero, vertiendo el resto en
la placa de Petri. Se continúa del mismo modo hasta obtener 4 o 6 muestras, y como el cultivo
se va diluyendo de una a otra, en alguna de ellas habrá ya un cultivo puro.

b) POR SEPARACIÓN DE ESPORAS DE UNA COLONIA.

Una vez seleccionada una colonia que se presume pura, se recogen de la misma unas cuantas
esporas mediante una aguja esterilizada, llevándolas a un tubo que contiene un medio
favorable para el crecimiento. La operación se efectúa con ayuda de una lupa o bien con el
microscopio.

c) MEDIANTE EL MICROMANIPULADOR:
El micromanipulador más conocido es el de Peterfi, construido por la Zeiss; es de tipo
mecánico ya que las agujas, pipetas, ansas y escalpelo se mueven por juegos de tornillos en
todas direcciones. Consta de una camarita en la cual se coloca una gota del material a aislar;
se observa a través del microscopio. Mediante los dispositivos laterales del micromanipulador
se mueven en todo sentido dos microagujas o dos micropipetas que permiten recoger o aspirar
un solo microorganismo de la suspensión.

d) POR GERMINACIÓN DE UNA SOLA ESPORA:

Se hace una dilución de esporas en agua estéril o salina hasta que cada gota contenga solo una
espora, lo que puede comprobarse con auxilio del microscopio. Se ponen entonces varias gotas
sobre la superficie de agar, marcando su posición para poder localizar el cultivo correcto en el
caso de existencia de algún contaminante.
e) POR MODIFICACIÓN DEL MÉTODO DE UNA SOLA ESPORA DE KEITT:
Esta modificación se debe a Ezekial (1930). Con ayuda de una aguja de extremo plano cargada
con el material que contiene las esporas, se hacen varios trazos paralelos sobre la superficie de
un medio agarizado convenientemente, se invierte entonces la placa incubándola durante 16-
24 horas. y observándola a través del fondo con el microscopio (objetivo de 16 mm). Una vez
descubiertas las esporas, se marca con tinta su posición.

f) POR MEDIO DE UNA AGUJA DE PUNTA CILÍNDRICA (que obra como

sacabocado) se corta el cilindro de agar que contiene el esporo. Este cilindro se siembra en
una caja de Petri y se observa para estar seguro de que existe un solo elemento, y luego de
desarrollado se resiembra en un tubo con medio de cultivo apropiado. Se incuba y aparecerá
la colonia de desarrollo monocitogenético.

g) MÉTODO DE HANSEN: En este método (Hansen,1926) se prepara una suspensión

de esporas en agar, que se aspira en tubos capilares de diámetro no mucho mayor que el de las
esporas. Los tubos capilares se observan al microscopio y cuando se descubre una espora
aislada se rompe el tubo de manera que el segmento contenga solo una espora. El cristal se
trata con alcohol y luego se coloca en un medio fresco. La espora se desarrolla dando lugar a
una colonia. Este método resulta eficaz con esporas grandes y coloreadas, en cambio no lo es
con esporas pequeñas.

AISLAMIENTOS MONOESPÓRICOS
Serán obtenidos a partir de un aislamiento multiespórico con una edad del cultivo no superior
a 30 días.
Procedimiento: Una vez esporulado el cultivo original, lo cual se logra entre los 5 a 10 días
siguientes a la siembra en el medio agar-papa y a una temperatura promedio de 25º C, se
procede a obtener una suspensión de esporas con una concentración de 3x105
esporas/ml(Fig.54).

Fig.54. Metodología para obtener cultivos monoespóricos

Previamente, con un marcador se hicieron 6 estrías por el reverso de las cajas de petri
esterilizadas, con el fin de facilitar la lectura al microscopio. Luego de servir una fina capa del
medio de cultivo agar-papa en las cajas de petri, se tomaron 3 ml de la suspensión de esporas
(3x105 esporas/ml) y se depositaron en el extremo superior de la estría. Con un asa en argolla
y sin cambiar el lado del asa que se venía utilizando, se esparció el inóculo. La incubación se
hizo a temperatura ambiente durante 24 horas y se observó la germinación de esporas al
microscopio con el objetivo de 10X. Con un bisturí #3 y una cuchilla #10, debidamente
desinfestados en alcohol y flameados, se cortaron y colocaron las estrías sobre un portaobjeto
estéril, teniendo en cuenta el orden en que fueron cortadas. Se observaron al microscopio y
una vez se ubicó la espora germinada fue demarcada el área con el objetivo de 40X y se cortó
el bloque de agar con el bisturí. Antes de ser transferida al medio agar-papa, se observó de
nuevo el bloque de agar para asegurar el aislamiento de una sola espora y se llevó a incubación
a 25º C en luz constante. Todo este proceso se realiza asépticamente, en cámara de flujo
laminar.

IDENTIFICACIÓN PRELIMINAR DE CULTIVOS DE HONGOS

Para la identificación de un moho se precisa una descripción completa del organismo. Para
estudiar sus características, se prefiere el medio de Czapeck que es un medio satisfactorio y da
muy buenos resultados con fines comparativos.
El examen de los cultivos debe hacerse diariamente, por lo menos durante la primera y segunda
semana de incubación. Las observaciones macroscópicas deben realizarse con la ayuda de una
lupa. En general es posible determinar, por el examen visual, si una colonia de hongos es
filamentosa o levaduriforme. Las colonias de hongos filamentosos tienen un aspecto velloso
o acordonado, mientras que las levaduras producen colonias mantecosas con superficies lisas.
Las colonias individuales desarrolladas en el medio Czapeck, se pueden estudiar a simple
vista, con la lupa y al microscopio con poco aumento. Podemos así deducir lo siguiente:
velocidad y forma de crecimiento, tamaño y color de los cuerpos fructíferos e hifas; elevación
y densidad de las distintas partes de la colonia, presencia o ausencia de peritecios, variaciones
en la forma y tamaño de los núcleos de mohos. Debe observarse la consistencia de la superficie
de la colonia, el plegamiento, la nitidez del borde y la presencia de pigmentos en la superficie
o el reverso o su difusión hacia el medio circundante. Invirtiendo la placa de Petri puede
observarse el color del fondo de la colonia, así como cualquier coloración producida en el
medio.
Estas observaciones son suficientes para indicar la clase u orden a que pertenece el hongo,
pero para identificar el género y la especie es preciso el estudio al microscopio. Con las esporas
se efectúan las observaciones siguientes: forma, tamaño, color, características y colocación.
En las hifas fértiles se examinan: ramas, tabiques, anchura, color, características y naturaleza
de las paredes (lisas, picadas o rugosas). A partir de las observaciones así adquiridas y
complementadas con las técnicas de coloraciones conocidas, puede intentarse la identificación
del moho conociendo la descripción de los géneros.

AISLAMIENTO A PARTIR DE TEJIDO VEGETAL

A partir del tejido vegetal enfermo es posible aislar a los patógenos. Se busca tomar trozos de la
zona de avance para incrementar las oportunidades de aislar al patógeno. Los trozos de tejido
vegetal se someten a una desinfección superficial. En el caso de bacterias es posible macerar un
trozo de tejido afectado y luego sembrar
Fig.55. Trozos de tejido vegetal mostrando la zona de avance del patógeno .Luego estos fueron sembrados en placa
Petri. Se observa el crecimiento de los hongos patógenos (Ver fig. 64).

Aislamiento directo a partir del signo

Fig.56. Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible tomar una pequeña porción del mismo y sembrar en una
placa con medio de cultivo. Se observa crecimiento de hongo patógeno.

Aislamiento a partir del exudado bacteriano

Fig.57. Un trozo de tallo de una planta afectada vascularmente es colocado en agua en recipiente con agua o salina estéril.
En el vaso se observa flujo bacteriano estéril y en la placa Petri un estriado en placa sobre la cual crece bacteria patógena

Inducción del signo

Fig. 58. La aparición de signo puede ser inducida mediante cámara húmeda.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO

Fig. 59. La muestra de suelo (izquierda) se suspende en agua estéril. Se hacen diluciones 10 -1 a
10-10 veces (centro) . De cada dilución se siembran por extensión dos placas con 100 μL (0.1 ml)
en medios de cultivo (dependiendo del tipo de microorganismos que queramos aislar) y luego se
incuban (derecha) . Se aíslan colonias separadas de distinta morfología y se purifican mediante
repiques.

MÉTODO DE EXTENSIÓN EN PLACA

Fig. 60. Para que se pueda contar el número de colonias en la placa debe estar entre 30 y 300.

a. Método de estriado en placa

Fig. 61. Esquema práctico del aislamiento de bacterias por el método de estriado en placa. Se observan las colonias aisladas
(color amarillo) colonias aisladas

b. Método de diluciones seriadas (Fig. 62, 65)

Fig. 62. A partir de una suspensión concentrada de microorganismos se realizan diluciones seriadas.mSe toman 0,1 ml de la
solución, se siembra en superficie y se esparce mediante rastrillo de vidrio .

III. MATERIAL DE PRÁCTICA:

A. Biológico:
● Órganos de plantas enfermas.
● Muestras de suelo de campo de cultivo (1/2 Kg)

B. De laboratorio:

● 01 pliego de papel de filtro*

● 100 ml agua estéril*(ADE)
● 02 Mecheros*
● 01 Estufa
● 01 Escobilla*
● 01 Autoclave
● 01 Baguetas de vidrio*
● 01 Cocina eléctrica*
● 01 litro de alcohol comercial*
● 01 cámara aséptica
● 250 ml de lejía comercial*
● 250 g. agar*
● 01 litro de ron comercial*
● 500 g de detergente*
● 01 paquete de papel de aluminio*
● 06 envases de vidrio (250 ml)*
● 02 Pipetas
● 02 Cajas petri
● 06 Tubos de ensayo
● 02 vasos de precipitación
● 02 probetas
● 02 matraces
*Material que debe traer el alumno

IV. PROCEDIMIENTO:
1. PREPARATIVOS PARA EL AISLAMIENTO
Siempre que se desee aislar un hongo patógeno de los tejidos de una planta enferma, deben
llevarse a cabo los siguientes procedimientos preliminares:

a. Esterilización del material de cristalería, que incluye cajas petri, tubos de ensayo,
pipetas, etc., mediante calor seco (de 150 a 160º C durante una hora o más) o autoclave, o bien
sumergiendo ese material durante un minuto más en una solución de ácido sulfúrico-dicromato
de potasio, en cloruro mercúrico 1:1000, en formalina al 5% o en alcohol etílico al 95%. Todo
el material de cristalería que se trate químicamente debe enjuagarse por lo menos tres veces
en agua estéril (esterilizada en autoclave o mediante ebullición).

b. Preparación de soluciones para tratar la superficie del tejido infectado o infestado,

con el fin de eliminar o reducir notablemente los contaminantes de superficie que pudieran
interferir con el aislamiento del patógeno. Ello es:

● Hipoclorito de sodio (lejía) al 2.0 %

● Alcohol etílico al 70%
● Cloruro mercúrico 1:1000

c. Preparación de medios de cultivo en los que se desarrollarán los hongos. Puede

utilizarse un número casi infinito de medios de cultivo para cultivar hongos fitopatógenos.
Los medios de cultivo que con mayor frecuencia se utilizarán son papa-dextrosa-agar
(PDA), el cual es bueno para la mayoría de los hongos (pero no para todos). El agar-agua o
agar-glucosa (de 1 a 3% de glucosa en agar- agua) que se utiliza para separar algunos
hongos (Phythium y Fusarium) de bacterias. (Fig. 55) (Ver medios sintéticos y naturales).

BACTERIAS
Aislamiento y Purificación
De las muestras foliares recolectadas, que presentaban síntomas de pudriciones húmedas y
manchas foliares, se procede a lavarlos con abundante agua con el fin de eliminar la mayor
cantidad de contaminantes que pudieran tener. Posteriormente en un ambiente aséptico se cortan
trozos de tejido de 3 a 4 mm aproximadamente, que incluyan el área próxima a la sección que se
encuentra afectada, luego se colocan en agua destilada estéril (ADE), para permitir que las
bacterias fluyeran al líquido, una vez verificada la presencia de flujo bacteriano, se procedió a
realizar los aislamientos en Agar Nutritivo (AN) por el método de agotamiento en cajas de petri.
Estas se incubaron a temperaturas de 26 a 28º C de 24 a 48 horas; transcurrido el tiempo de
incubación, las colonias desarrolladas después de 24 horas, se repicaron individualmente en cajas
de petri con AN, para obtener cultivos puros.
HONGOS
Aislamiento y Purificación
Las muestras traídas de campo con evidentes signos de enfermedad, se lavan con abundante agua
y jabón, se someten a un proceso de desinfección superficial sumergiendo las muestras en
hipoclorito (2%) por un minuto luego en ADE, se cortan en trozos de un tamaño de 3-4 mm, se
dejan secar en una toalla absorbente estéril y con una pinza estéril se ponen en agar-papa-dextrosa
(PDA) la incubación se hizo por un período de 8 días aproximadamente a una temperatura de
25ºC. (Fig. 56).
Inducción de la Esporulación
Para inducir a la esporulación de algunos hongos se realizaba un repique en medio V8 (Ver medios
sintéticos y naturales). Por otra parte, se preparan cámaras húmedas consistentes en cajas de petri
estériles, toallas o papel absorbente humedecidos con ADE, donde se depositan los trozos de
aproximadamente 2-3 cm del material vegetal afectado con el propósito de mantenerlos y
favorecer la esporulación, para la posterior identificación gracias a las características
morfológicas tenidas en cuenta en la clave de Barnett (1972) para identificación de hongos.
Las muestras se dejan en cámaras húmedas por un tiempo entre 48 y 72 horas, se revisan
periódicamente con el fin de evidenciar las características micro y macroscópicas de los hongos
resultantes; si posterior al tiempo de incubación no se observaba esporulación alguna se
descartaba que el problema fuera de origen fungoso.

Fig. 63.

Preparación de medios de cultivo nutritivos

Fig. 64. Aislamiento de patógenos a partir de hojas enfermas

Fig. 65. El método de dilución seriada: Un recuento en placa es una medida directa y
proporciona un recuento de viables. En primer lugar, la muestra se diluye seriadamente,
transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se mezclan adecuadamente. Este
proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10-5).
Posteriormente se añade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en la
superficie de la misma (método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método
de vertido en placa). Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan.
Debido a razones estadísticas, las placas deben contener entre 30 y 300 colonias. En este
ejemplo, la placa tiene 225 colonias.
Fig.

Preparación de medio PDA (agar papa dextrosa)

V. CUESTIONARIO:

1. Organizar la secuencia de preparación de medio de cultivo llevado a cabo en

su práctica aislamiento y siembra de patógeno. Cada imagen debe tener una
breve descripción. El organizador debe ser una infografía.
IV. CONCLUSIÓN

- En síntesis, se logró reconocer las técnicas de aislamiento de los patógenos

que causan enfermedades en las plantas. Asimismo, definir medios de
cultivo, señalando los diferentes constituyentes básicos de un medio de
cultivo e indicar la función de cada uno de ellos; incluso clasificar los
medios de cultivo, según: el estado físico, la naturaleza de sus
constituyentes y los propósitos de uso.

V. DISCUSIÓN
Actualmente es relevante para un biólogo reconocer y realizar técnicas de
aislamiento y cultivo de patógenos como las bacterias, así se podría encontrar
alguna cura o tratamiento para disminuir o eliminar la enfermedad que esta
alterando al suelo y que podría contagiar a las plantas, algo que beneficiaría a
muchos agricultores, pues esto evita que se generen grandes pérdidas de
cosechas.

Por ello, la importancia del aislamiento de microorganismos en diferentes

ambientes como en tierra, se realiza con el principal fin observar e identificar
especies especificas existentes en una población de microorganismos que se
sabe habitan en aquel suelo a través de un cultivo que lo permita, los cuales
son imposibles de observar e identificar a simple vista.
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
Agrios, G. N. (2005). Fitopatología. (2ª ed.). Editorial Limusa.

Beltrán, P. (2023). Los 20 principales medios de cultivo para

bacterias(características y aplicaciones). Medicoplus.

https://medicoplus.com/ciencia/medios-cultivo-bacterias

Cuervo, Y., Espadas, M. y Zita, G. (2010). Fitopatología (Manual de Prácticas

de Ingeniería Agrícola). Universidad Nacional Autónoma de México.

Facultad de estudios superiores de

Cuautitlán.https://portal.cuautitlan.unam.mx/manuales/Fitopatologia.pdf

López, Z. (9 de julio de 2013). Métodos de esterilización. Material de apoyo a la

docencia asignatura esterilización y bioseguridad primer año.

http://uvsfajardo.sld.cu/tema-7-metodos-de-esterilizacion

Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentación. (s.f.).

Producción segura y efectiva de cultivos.

https://www.fao.org/3/v5290s/v5290s33.htm

Órgano Internacional de Difusión de la Sociedad Mexicana de Fitopatología.

(2019). Revista Mexicana de Fitopatología, 37(19).

https://www.smf.org.mx/rmf/suplemento/docs/Volumen372019/S372019

.pdf

Reyes, A., Cristobal, J., Ruiz, E. y Tun, J. (2012). Inhibición del crecimiento in

vitro de Fusarium sp. aislado de chile habanero (Capsicum chinensis) con

hongos antagonistas. Fitosanidad 16(3):161-165

Salgado, A. y Rojas Gracia, P. (2006). Incidencia de las enfermedades en uchuva

Physalis peruviana l. por estado fenológico y de acuerdo con la ubicación

en los diferentes estratos de la planta, en el departamento de

Cundinamarca. Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana. p. 32-

35