XI CONGRESO NACIONAL DE BIOTECNOLOGA Y BIOINGENIERA

EL IMPACTO DEL BIOPROCESO SOBRE EL PERFIL DE N-GLICOSILACION DE

ERITROPOYETINA HUMANA RECOMBINANTE.
Jaime M. Uribe#, Laura A. Palomares*, Adrin Delgado#, Marisol Hernndez#, Paula Servn#, Jessica Prez#, Lizbeth
Lecea#, Vanessa Hernndez*, Norberto Cruz# y Octavio Tonatiuh Ramrez#*
#
Probiomed S.A. de C.V. San Esteban 88 Mxico, D.F., C.P. 02020 Fax: (55)53527651. *Instituto de Biotecnologa.
UNAM. Correo electrnico: tonatiuh@ibt.unam.mx
Palabras clave: Protena recombinante, N-glicosilacin, modo de cultivo, purificacin.

Metodologa. La EPO se produjo a partir del cultivo de

clulas CHO recombinantes. Para la produccin se utilizaron
2 medios de cultivo libres de suero fetal y un medio
conteniendo suero fetal bovino. Se realiz el cultivo en
suspensin o en cama empacada. Se tomaron muestras a
diferentes tiempos de cultivo. Para la purificacin de EPO se
utilizaron diferentes condiciones de cromatografa lquida de
intercambio inico y fase reversa. El anlisis de Nglicosilacin se realiz a partir de los azcares obtenidos por
digestin de la EPO con PNGasa F. Los azcares obtenidos
se marcaron con 2-aminobenzamida y fueros separados por
HPLC en fase normal (2). Los glicanos fueron identificados
de acuerdo a su migracin en unidades de glucosa, a tablas
de la literatura y a digestin con exoglicosidasas.
Resultados y discusin. No se observ diferencia en el
contenido relativo de glicanos producidos en cultivos con o
sin suero fetal bovino (fig. 1) o en la ocupacin de sitios
potenciales de N-glicosilacin. Sin embargo, los cultivos en
medio sin suero mostraron consistentemente un aumento en
la cantidad de estructuras tetraantenarias a expensas de las
estructuras triantenarias. Asimismo, los cultivos en medio
sin suero mostraron un porcentaje mayor de estructuras tri y
tetraantenarias en comparacin con los cultivos con suero.
Este aumento estuvo acompaado por una disminucin de
las estructuras bisialidadas, pero no monosialidadas. No
hubo diferencias significativas entre el perfil de glicosilacin
obtenido de cultivos en suspensin o en camas empacadas.
Un cultivo esttico en el que se realiz una perfusin
simulada mostr una disminucin de estructuras
tetrasialidadas. El uso de un reactor instrumentado y el

cultivo en perfusin increment el contenido de formas tri y

tetra antenarias y tri y tetrasialidadas.
La purificacin por intercambio inico y fase reversa
permiti separar las diferentes isoformas de EPO, y de esta
forma fue posible obtener EPO con un patrn de
glicosilacin homogneo independientemente de diferencias
derivadas de la fase de cultivo celular.
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Cama empacada, medio con suero
Cama empacada, medio sin suero

Abundancia relativa, %

Introduccin. El perfil de N-glicosilacin de protenas con

aplicaciones teraputicas define en muchos casos sus
propiedades farmacocinticas y farmacodinmicas. La
glicosilacin es un proceso complejo que requiere de varias
actividades enzimticas y de varios azcares precursores,
cuya disponibilidad depende del estado energtico de la
clula (1). Existen varios parmetros de cultivo que pueden
influir el patrn de glicosilacin. Asimismo, diferentes
estrategias de purificacin pueden seleccionar distintas
glicoformas.
En este trabajo se evalu el efecto de distintas condiciones
de cultivo y purificacin en el patrn de glicosilacin de
eritropoyetina (EPO) humana recombinante, una de las
glicoprotenas teraputicas de mayor importancia comercial.

Simulacin de perfusin, medio sin suero

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Medio sin suero, cultivo en susepensin

Medio sin suero, reactor instrumentadoo

10

0
25

24

21

23

20

17

Fig. 1. Glicoformas mayoritarias presentes en la EPO producida

en distintos medios y formas de cultivo. Cuadro. Nacetilglucosamina, crculo vaco, manosa, rombo, fucosa, crculo
lleno, galactosa,; tringulo, cido silico.

Conclusiones. El modo de cultivo impact de forma

importante el contenido de cido silico de EPO. El utilizar
medio libre de suero increment la sialidacin. No hubo
diferencias en cultivos en camas empacadas o en suspensin.
Sin embargo, el uso de frascos T disminuy la presencia de
cido silico, mientras que el cultivo en biorreactores
instrumendatos la increment. Es muy posible que estas
deferencias se deban a mejores condiciones energticas de la
clula.
Bibliografa.
1. Palomares, L.A., Estrada-Mondaca, S., Ramrez, O.T. (2004) En:
Recombinant Gene Expression. Balbs, P., Lorence, A. 2 ed.
Humana Press, E.U.A.. 15-51.
2. Serrato, J.A., Palomares, L.A., Meneses-Acosta, A., y Ramrez,
O.T. (2004) Heterogeneous conditions in dissolved oxygen affect
N-glycosylation but not productivity of a monoclonal antibody in
hybridoma cultures. Biotechnol. Bioeng. 88 (2) 176-188.