WO2018011805A9-90-125 Es

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WO 2018/011805 PCT/IL2017/050790
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análisis MTT estándar; imágenes de fase adquiridas de las células tratadas, y análisis
Hoechst para el ADN total. Para identificar los aciertos funcionales de proliferación, se
integran los incrementos positivos de MTT y ADN en función del valor p.
Las sustancias químicas que producen éxitos funcionales de proliferación se
combinaron en un
5con el objetivo de identificar combinaciones funcionales mínimas que produzcan el
mayor aumento de la proliferación. Basándose en informes anteriores (7), el presente
inventor esperaba que se identificaran de 2 a 3 moléculas pequeñas en cada cribado. Por
ejemplo, recientemente se demostró que el NSC- 228155 es un agonista del EGF-R
(16). Una vez identificados los cócteles de moléculas pequeñas, el presente inventor
intentó volver a añadir factores de crecimiento en
10 concentraciones más bajas para ver si se puede conseguir un mayor aumento de la
proliferación de forma rentable.
EJEMPLO 3
DESARROLLO DE PEQUEÑAS MOLÉCULAS BASADAS EN LA
DIFERENCIACIÓN DE
15 CÉLULAS MUSCULARES DE POLLO
La expansión de los miocitos suele limitarse a 15 duplicaciones de la población,
lo que produce un tejido de 16 gramos de cada aislado. Sin embargo, los miocitos
pueden diferenciarse a partir de células madre pluripotentes en un proceso de varios
pasos que imita la miogénesis (17). Alternativamente, los fibroblastos pueden
convertirse en miocitos mediante la expresión de MyoD (18) o un cóctel de
20 moléculas pequeñas (8).
Las células madre pluripotentes se duplican cada 44*13 horas y su medio sin
suero cuesta unos 540 $/litro. En cambio, los fibroblastos se duplican cada 21*3 horas y
su medio sin suero cuesta unos 272 $/litro. Esto significa que, utilizando las técnicas
actuales, las células madre pluripotentes producirán 1 kg de tejido al cabo de 39 días, a
100.000 dólares/kg, mientras que
25 f i b r o b l a s t o s lo harán al cabo de 18 días, a 50.000 dólares/kg. Por lo tanto, el
enfoque del presente inventor se centró principalmente en la diferenciación genética y
química de fibroblastos a miocitos, con células madre pluripotentes estudiadas para
mitigar el riesgo.
3.1 Generación de fibroblastos de pollo que expresan M yoD dependientes de
tetraciclina
La doxiciclina (Dox) es un análogo de la tetraciclina que puede utilizarse para
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tratar rápidamente
30 activan la expresión génica mediante la unión de un transactivador avanzado controlado
por tetraciclina inversa (rtTA2S -M2) que actúa sobre un elemento sensible a la
tetraciclina (TRE). La Dox no muestra toxicidad aparente, es barata y puede eliminarse
fácilmente de las células.
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tras la activación. Se ha demostrado que el sistema funciona de forma fiable en
embriones de pollo (19).
El presente inventor ha generado una línea estable de fibroblastos de pollo
que expresan MyoD de pollo inducible por Dox, introduciendo pCAGGS-rtTA2S -M2
y
5 plásmidos pTRE-MyoD bajo selección con puromicina. Los fibroblastos de pollo se
expusieron a
0,5 ng/q1 de Dox durante 48 horas y la expresión de MyoD se evaluó mediante
qRT-PCR. La conversión a miocitos se evaluó 7 y 12 días después de la inducción
de Dox mediante tinción para cadena pesada de miosina (MyHC) y titina (18). Las
células musculares inducidas por Dox sirvieron como control positivo y como
alternativa genéticamente modificada ( GE) a la inducción por moléculas pequeñas.
10 indujo la conversión de fibroblastos en miocitos.
3.2 Identificación de un cóctel de moléculas pequeñas para la conversión de
miocitos Recientemente ratón
fibroblastswereconvertido alos cardiomiocitospor
combinación de dos pasos de pequeñas moléculas que promueven la
reprogramación; incluyendo CHIR9902, RepSox, Forskolin, y VPA seguido por 2i
(CHIR99021 y PD0325901) condiciones
15 que promueven el desarrollo del miocardio, como CHIR99021, PD0325901 y UF (9).
Los fibroblastos humanos se convirtieron de forma similar utilizando una combinación
de factores de reprogramación e inductores de diferenciación CHIR99021, A83-01,
BIX01294, AS8351, SC1, Y27632, OAC2, SU16F y JNJ10198409 (8). La
conversión fue lenta, tardando entre 20 y 30 días y produciendo aproximadamente
un 6% de cardiomiocitos.
20 En un cribado de células de pez cebra, ratón y humanas, Xu (Xu et a1.
Cell 155, 909-921, 2013) y sus colegas identificaron 6 pequeñas moléculas que
expandían los progenitores musculares, incluido el activador de la adenilil ciclasa, la
forskolina. Una combinación de bFGF, forskolina y el inhibidor de GSK3b BIO indujo
la diferenciación muscular esquelética de células madre pluripotentes inducidas
humanas (21). En otro estudio, un grupo identificó
25 SMI1 y SMI2 para inducir de forma robusta la diferenciación del músculo esquelético
a partir de células madre pluripotentes, mientras que otros demostraron que la 5-
azacitidina puede promover de forma similar la miogénesis (22). Estos resultados
sugieren que un procedimiento de dos pasos para transdiferenciar el músculo
esquelético utilizando un cóctel de reprogramación (6), seguido de factores que
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promueven la miogénesis del músculo esquelético en células madre pluripotentes,
puede producir resultados prometedores.
30El enfoque del presente inventor consistió en transfectar de forma estable
fibroblastos de pollo con un reportero EGFP para MyHC con el fin de realizar un
cribado de alto rendimiento (8). Las células se expusieron a distintos cócteles de los
factores de reprogramación y miogénicos comentados anteriormente, así como a los
factores miógenos.
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las identificadas en el ejemplo 2.2. Las células se evaluaron en función de la
fluorescencia EGFP y la morfología de las miofibras tras 20 días de inducción. Para
identificar los aciertos funcionales, el presente inventor integró los aciertos positivos
de MyHC y morfología basándose en el valor p.
3.3. Desarrollo de la diferenciación directa de células madre pluripotentes de
pollo
5 El embrión aviar pasa sólo 20 horas en el útero mientras desciende por el oviducto. En
el momento de la puesta del huevo, el epiblasto es una sola capa compuesta por
20.000-50.000 células. Las células madre embrionarias de pollo derivan de este
blastodisco y pueden perpetuarse en cultivo, produciendo todos los linajes somáticos
pero no la línea germinal (3). Al igual que las células madre embrionarias de ratón,
necesitan UF para permanecer indiferenciadas. El medio de cultivo incluye bFGF,
10 IGF-1, SCF e IL-11, además de UF (23).
Recientemente se han publicado protocolos sin suero para la diferenciación
de fibras musculares en células madre pluripotentes humanas y de ratón (17). Las
células madre de ratón se indujeron hacia un fenotipo mesodermo en medio N2B27
que contenía 10 ng/ml de BMP4 durante 2 días, medio DMEM que contenía 15% de
suero knockout, 0,5% de DMSO, 0,1 qM
15 LDN193189, y 1 qM CHIR99021 durante 4 días. A continuación, las células
mesodérmicas se diferenciaron a músculo esquelético en medio DMEM con un 15%
de suero knockout, 10 ng/ml de HGF, 2 ng/ml de IGF-1, 20 ng/ml de bFGF y 0,1 qM
de LDN193189 durante 8 días. El protocolo es robusto, generando un 30-60% de
células musculares en 14 días.
Como ya se ha señalado, otros grupos identificaron otras moléculas pequeñas que
impulsan la
20 diferenciación de células madre pluripotentes hacia células musculares esqueléticas.
Entre ellas se incluyen la combinación de bFGF, forskolina y BIO (21), SMI1 y
SMI2 (24) y, por último, 5- azacitidina (22).
El enfoque del presente inventor consistió en trasladar los protocolos
existentes para ratones sin suero a las células madre embrionarias de pollo, teniendo
en cuenta las diferencias en las características aviares.
25 vías de desarrollo (25). Se utilizaron pequeñas moléculas identificadas en estudios
anteriores para aumentar la diferenciación e incrementar la densidad de las fibras
musculares.
EJEMPLO 4
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ESTABLECIMIENTO DE UN CIRCUITO DE PERFUSIÓN EN BUCLE CERRADO
PARA EL CRECIMIENTO Y LA
30 DIFERENCIACIÓN DEL MÚSCULO DE POLLO
El tejido muscular es un cúmulo de miofibras altamente empaquetado y
nutrido por capilares endoteliales. El colágeno fibrilar, secretado por el mesénquima,
desempeña un papel importante en la formación del tejido muscular.
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consistencia del tejido. El enfoque del presente inventor consistió en cultivar una
alta densidad de fibroblastos de pollo y células endoteliales en un andamio
biodegradable contenido en un circuito de perfusión de bucle cerrado optimizado en el
ejemplo 1. Las fuerzas de cizallamiento ayudaron a alinear las fibras de colágeno
depositadas por los fibroblastos en crecimiento. Las fuerzas de cizallamiento ayudaron
a alinear las fibras de colágeno depositadas por los fibroblastos en crecimiento. Una
vez alcanzada una masa suficiente, se
5 se introdujeron en el medio de diferenciación convirtiendo los fibroblastos en células
musculares esqueléticas (ejemplo 3) y permitiendo que la miofibra se alineara a lo
largo de las fibras alineadas por cizallamiento.
La perfusión en circuito cerrado incluía una unidad de diálisis que permitía la
adición fisiológica de nutrientes y la eliminación de toxinas, en lugar de la
sustitución completa del medio. Los principales
10 ventaja de la diálisis era que la albúmina, con un peso molecular de 66,5 kDa, quedaba
retenida en el circuito principal de perfusión. La albúmina tiene una vida media de 20
días y es una proteína portadora de factores de crecimiento y ácidos grasos. La
albúmina y los factores de crecimiento son los principales factores de coste del medio
de cultivo.
4.1 Circuito de perfusión de bucle cerrado
15 Aquí se utilizó el sistema de perfusión que se optimizó en el ejemplo 1.1. Brevemente,
el circuito primario incluía un perfusato de medio de cultivo que se recirculaba
mediante una bomba peristáltica a través de una cámara de crecimiento de tejido
enchaquetada, un oxigenador de membrana (80% Oz, 5% CO2 y 15% N2), un
intercambiador de calor (37°C) y un colector de burbujas. Una fracción del perfusato
se desvió a un dializador de fibra hueca con un diámetro de 2200 cm2
20 de membrana y un corte de peso molecular de 30 kDa a una velocidad de 3
mL/min/gramo de tejido. El circuito secundario dializaba el perfusato mediante
exposición en contracorriente a dializado libre de proteínas y recirculaba a través de un
filtro de carbono utilizando una segunda bomba peristáltica.
4.2 Células modelo y crecimiento tisular
Aquí se utilizó la siembra celular que se optimizó en el ejemplo 1.2. El
experimento
25 utilizó una mezcla de fibroblastos de pollo Dox-MyoD desarrollada en el ejemplo 3.1 y
células endoteliales en proporción 10:1. Brevemente, las células se suspendieron en
0,1 ml de matriz de hidrogel compuesta de polipéptidos sintéticos libres de animales
con un tamaño de poro de 50 a 200 nm (Beaver Labs). La suspensión de células de
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hidrogel se inyectó en un andamio de polímero biodegradable con un tamaño de poro
de 50 a 1000 qm, y se colocó en la cámara de crecimiento tisular con gato. Mientras
30 l o s polipéptidos del hidrogel se sustituyeron por matriz extracelular nativa en 5-7
días, el andamio polimérico soportó el tejido en crecimiento durante 14 días hasta
que alcanzó una masa significativa y las células no pudieron lavarse. El andamiaje se
retiró a los 5 y
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10 días fijados y seccionados para su análisis. El presente inventor realizó tinciones
para determinar la deposición y la alineación del colágeno de tipo I, y analizó la
densidad y la salud del tejido conjuntivo mediante tinción de H&E.
El presente inventor introdujo 0,5 ng/q1 de Dox durante 4 días, induciendo la
conversión
5 de fibroblastos a células musculares. Después se lavó Dox durante 4 días y se sustituyó
por IFG- 1 para promover la fusión celular a fibras musculares. El tejido se extrajo
en los días 14 y 18, se fijó y se realizaron secciones para su análisis. El presente
inventor realizó tinciones para MyHC, desmina y titina, y analizó la densidad y la
salud del tejido muscular resultante mediante tinción H&E. La comparación de células
positivas para desmina y MyHC, así como la qRT-PCR evaluaron el grado de
músculo
10 de formación.
4.3 Optimización del crecimiento
Se optimizó el crecimiento de los tejidos para ajustar los parámetros de
alimentación a las células en crecimiento y al método de diferenciación utilizado. Se
analizaron las tasas de absorción tisular de glucosa, glutamina, ácidos grasos y
albúmina con el objetivo de mantener constantes las consternaciones.
15 El perfusato y el dializado se muestrearon automáticamente mediante una centralita de
microfluidos cada 4 horas para controlar el contenido de glucosa, lactato, glutamina,
ácidos grasos y albúmina.
(12). El contenido de oxígeno se midió dinámicamente mediante sensores ópticos
(13). Los datos se utilizaron para determinar la tasa y el volumen de suplementación
de medio en función de la tasa de crecimiento del tejido.
20Las tasas de crecimiento tisular se cuantificaron utilizando AlamarBlue
(Thermo Fisher Sci.), un indicador de viabilidad celular no tóxico y secretado. Por
último, se evaluó la ausencia de necrosis o apoptosis mediante tinción de H&E y
TUNEL tras 6, 12 y 18 días de crecimiento.
4.4 Enfoque celular específico
Algunas realizaciones de la presente intención son alcanzar 150 gramos de pollo
25 de tejido muscular en cada circuito, equivalente a un muslo grande o a una pechuga de
pollo. Esto representa una masa de 3x10'0 células conseguidas en unas 18
duplicaciones de población.
Para los fibroblastos, representa de 16 a 18 días de crecimiento. La conversión
inducida por MyoD es rápida (18), lo que permite cultivar fibroblastos durante 10
días y diferenciarlos durante 8 días en cultivo. Por el contrario, los enfoques de
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reprogramación basados en moléculas pequeñas (8) (9) son
30 tarda entre 24 y 30 días, al menos en el caso de los cardiomiocitos. Mientras que la
diferenciación del músculo esquelético, más sencilla desde el punto de vista del
desarrollo, será sin duda más corta,
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Las conclusiones del ejemplo 3.2 desempeñaron un papel fundamental a la hora de
decidir las densidades de siembra iniciales y el momento de la conversión.
Es importante destacar que esta densidad celular representa de 33 a 35 días
de crecimiento para las células madre embrionarias. El protocolo actual de
diferenciación sin suero (17) sólo requiere 14 días de
5 diferenciación. Por lo tanto, las células madre embrionarias de pollo pueden sembrarse
a densidades más altas y cultivarse en medio de pluripotencia durante 19 días. El
principal reto para el crecimiento de células madre embrionarias es que el tejido no
puede endotelizarse, ya que las células endoteliales promoverían la diferenciación.
Esto significa que los grupos individuales de células madre embrionarias deben tener
un diámetro inferior a 0,5 mm o sufrir necrosis en el núcleo. Un
10 solución fue sembrar células madre embrionarias en micropartículas de alginato
biodegradable (Quad Technologies) permitiendo que la suspensión creciera por
separado dentro de la cámara de crecimiento tisular. El presente inventor ha tenido
éxito anteriormente en el cultivo de células madre embrionarias humanas en una
suspensión similar de alta densidad (26).
15 EJEMPLO 5
CARNE DE POLLO CULTIVADA EN LABORATORIO: GENERACIÓN DE
UNA LÍNEA CELULAR DE FIBROBLASTOS DE POLLO ESPONTÁNEAMENTE
INMORTALIZADA
El siguiente ejemplo ilustra células no limitadas que pueden utilizarse para el
cultivo de carne in vitro.
20 Expansión de alta densidad de células de pollo sin animales - Para el cultivo
de carne in vitro pueden utilizarse diversas fuentes celulares independientes.
(1) Se aislaron fibroblastos embrionarios de pollo y se expandieron hasta que se
produjo la inmortalización espontánea.
(2) Se genera una línea iPSC de pollo inmortal utilizando vectores no integradores
o
25 pequeñas moléculas a partir de las cuales se pueden obtener fibroblastos mediante
diferenciación rutinaria.
(3) Pueden utilizarse varias líneas celulares ATCC establecidas. Entre ellas
se incluyen DF1 (pollo), QM7 (codorniz) y DE (pato).
(4) Se utilizan vectores integradores para establecer líneas iPSC de pollo
tal y como se describe en la bibliografía (Intarapat & Stern 2013).
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Derivación de una línea espontáneamente inmortalizada de fibroblastos
embrionarios de pollo
Métodos experimentales - Los huevos fertilizados de pollo de engorde se
cultivaron a 38,5°C durante 10-12 días en una incubadora humidificada. Los huevos se
abrieron entre los días 10 y 12 y
Se extrajeron 5 embriones. Se retiraron las cabezas, las extremidades y los órganos internos,
y las células se extrajeron mecánicamente y se sembraron en plástico tratado para
cultivo de tejidos en medio DMEM/F12 suplementado con 15% de FBS (suero bovino
fetal), y 2 mM de L-Analil-L- Glutamina.
Resultados experimentales - En estas condiciones, en ausencia de cualquier otra
10 factores de crecimiento, los fibroblastos superan el cultivo dando lugar a poblaciones
homogéneas de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF) primarios (Figuras 2A-B). Se
aislaron aproximadamente 2x107 células por embrión, con múltiples poblaciones
cultivadas en paralelo. La morfología inicial de los CEF era alargada, haciéndose más
compacta a medida que aumentaba el número de pases (Figura 2B y datos no
mostrados). La mayoría de los cultivos de CEF se volvieron senescentes en la
población
15 duplicación (PD) 30-40 (datos no mostrados); 2-3 colonias sobrevivieron a la crisis y se
convirtieron en fibroblastos de pollo espontáneamente inmortalizados (CSIF; Figura
2C). Los CSIF muestran una morfología fibroblástica y un tiempo de duplicación de
18*2 horas en PD 90 (Figura 2E).
EJEMPLO 6
20 CARNE DE POLLO CULTIVADA EN LABORATORIO: IDENTIFICACIÓN
DE UN MEDIO SIN SUERO PARA PROPAGAR ESPONTÁNEAMENTE
LÍNEA CELULAR INMORTALIZADA DE FIBROBLASTOS DE
POLLO
Desarrollo de un medio sin suero para la propagación de las CSIF - Las CSIF
25 crecen fácilmente en plástico de cultivo tisular en medio DMEM/F12 suplementado con
15% de FBS, y 2 mM de L-Analil-L-Glutamina (Figura 2D). Existen varias
formulaciones de medio sin suero para el crecimiento de fibroblastos humanos y de
ratón, incluyendo PCS- 201-040 (ATCC) y TheraPEAK (Lonza), ambos no soportaron
la proliferación de CEF primarios o de la nueva línea CSIF obtenida por el presente
inventor (Figuras 2D, 2E
30 y datos no mostrados).
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Para desarrollar un medio libre de suero que soporte el cultivo de CEF y CSIF,
el presente inventor formuló un medio mínimo compuesto de DMEM/F12
suplementado con
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con 0,1 qM de dexametasona, 10 qg/ml de insulina, 5,5 qg/ml de transferrina y 5
ng/ml de selenio (ITS), 12 qM de ácido linoleico y 12 qM de ácido oleico, y 2 mM
de L-analil-L-glutamina. Las células se sembraron en un medio que contenía FBS y
se transfirieron a un medio mínimo tras una noche de fijación. El medio basal se
complementó con crecimiento
5 factores y hormonas mostrando que mientras la heparina y la T3 tenían poco efecto de
CSIF
crecimiento (datos no mostrados), la adición de Factor de Crecimiento de
Fibroblastos básico (bFGF, 10 ng/ml) fue esencial (Figuras 3C y 3F), mostrando un
tiempo de duplicación de 20*2 horas (datos no mostrados). Además, el Factor de
Crecimiento Epidérmico (EGF, 5 ng/ml), la Prostaglandina E2 (PGE2, 0,01 qM) y la
Hormona del Crecimiento (GH, 10 ng/ml) favorecieron la proliferación de
10 CEF y CSIF (Figuras 3D, 3E, 3F y datos no mostrados).
El medio de crecimiento óptimo probado por el presente inventor estaba
compuesto por DMEM/F12 suplementado con dexametasona (0,1 qM), 1X ITS+3
(Sigma, I2771), bFGF (10 ng/ml), EGF (5 ng/ml), y PGE2 (0,01 qM) dando lugar a
tasas de crecimiento similares a un medio de cultivo que contenía 15% de FBS.
15 En algunas condiciones, la insulina podría sustituirse por IGF-1 (5 ng/ml), o la
IGF-1 estabilizado Long R3 [Sigma (5 ng/ml)]. El EGF puede sustituirse por el
agonista EGF-R [NSC-228155 (Sakanyan et a1. Sci. Reports. 2014] a una
concentración de 5-50 ng/ml. De forma similar, el FGF puede sustituirse por una
molécula pequeña o un agonista sintético como C19-jun (Ballinger et a1. Nature.
Biotech. 1999) a una concentración de 10-20 ng/ml.
20 Se lleva a cabo un cribado de pequeñas moléculas esencialmente como se
describe en el Ejemplo 2 anterior. El primer cribado de moléculas pequeñas intenta
identificar moléculas que puedan sustituir a los factores de crecimiento y hormonas
en el medio de cultivo (por ejemplo, insulina, FGF, EGF, TGF§). Así, se realiza una
eliminación secuencial de un factor de crecimiento u hormona cada vez, con el
objetivo de alcanzar la misma tasa de crecimiento con una pequeña molécula de
sustitución.
25El co-cultivo de células endoteliales con los fibroblastos permite al
presente inventor eliminar algunos factores de crecimiento que son producidos
naturalmente por el endotelio.
Adicional o alternativamente, las células se diseñan para producir
específicamente estos factores de crecimiento, reduciendo así el coste total.
Cabe señalar que la falta de factores de fijación (por ejemplo, vitronectina, 30
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fibronectina) en el medio libre de suero dificulta el pasaje en serie de CEF o CSIF.
Dado que deben evitarse las proteínas de matriz extracelular derivadas de animales o
humanos, otras
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naturales, proteínas recombinantes y/o polímeros sintéticos como la Poli-D-Lisina
pueden utilizarse para propagar células en ausencia de suero.
EJEMPLO 7
5 CARNE DE POLLO CULTIVADA EN LABORATORIO: CONVERSIÓN DE
UNA LÍNEA CELULAR DE FIBROBLASTOS DE POLLO
ESPONTÁNEAMENTE INMORTALIZADA
EN ADIPOCITOS EN UN MEDIO SIN SUERO
Conversión de CSIF en adipocitos en medio libre de suero - En especies de
mamíferos, los preadipocitos pueden diferenciarse fácilmente en adipocitos utilizando
3-isobutil-1-
10 metilxantina (IBMX) en presencia de insulina y cortisona (por ejemplo, dexametasona).
Los preadipocitos se siembran al 70% de confluencia en un medio que contiene suero
suplementado con 0,5 mM de IBMX, 0,1 PM de dexametasona y 10 kg/ml de insulina
durante 3 días, seguido de un tratamiento de 3 días con insulina sola, que se retira el día
6 para finalizar la diferenciación. El protocolo funciona en líneas celulares primarias de
preadipocitos y preadipocitos
15 como 3T3-L1 y 3T3-F442A, pero no en fibroblastos. En trabajos recientes se han
identificado múltiples moléculas pequeñas que pueden potenciar la diferenciación de
preadipocitos a adipocitos en medio con suero, entre ellas activadores de PPARg:
fenamil, GW7845, RG14620 o Harmine (Park et al. J. Lipid Research. 2010; Waki et
al. Cell Met. 2007). Fármacos clínicamente aprobados de la familia de las
tiazolidinedionas (es decir, rosiglitazona, pioglitazona,
20 lobeglitazona) dirigidas contra PPARg podrían tener efectos similares en los preadipocitos.
Aún no se han identificado los preadipocitos de pollo, lo que ha llevado a la
mayoría de los grupos a utilizar células estromales vasculares derivadas de tejidos
adiposos de pollo (Matsubara et al. Comp. Bio. & Phys 2008). Sin embargo, el IBMX y
la dexametasona no afectan a estos
25 preadipocitos de pollo, mientras que la exposición a 200-400 qM de ácido oleico induce su
diferenciación a adipocitos en presencia de suero (Zhouchun et al. Biosci. Rep. 2014;
Matsubara et al. Comp. Bio. & Phys 2008).
Los esfuerzos para diferenciar CEF primarias a adipocitos mostraron que la
exposición a 400 PM de ácido oleico y 20% de suero indujo la acumulación de lípidos
en las células primarias alargadas
30 ( Liu et al. Comp. Bio. & Phys 2009). La tesis de maestría de Aishlin Elizabeth Lee (Ohio
State U. 2013) mostró un efecto similar en respuesta a 100-300 kg/I de selenio y 2% de
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suero. Ambos trabajos utilizaron células primarias de pollo, cultivadas en presencia de
suero.
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Para desarrollar un protocolo de conversión de los fibroblastos de pollo
espontáneamente inmortalizados (línea CSIF) en condiciones libres de suero, el presente
inventor sembró los CSIF al 70% de confluencia en el medio optimizado DMEM/F12
libre de suero suplementado con dexametasona (0,1 qM), 1X ITS+3 (Sigma, I2771), y
bFGF (10
5 ng/ml). Las células CSIF se trataron durante 4 o 7 días con 200 a 400 qM de á c i d o
o l e i c o solo, o en combinación con 0,5 mM de IBMX, o 10 qM de la pequeña
molécula Rosiglitazona, aprobada por la FDA. Aunque todos los tratamientos con ácido
oleico aumentaron la acumulación de lípidos, sólo la adición de IBMX o Rosiglitazona
favoreció un fenotipo adipogénico redondeado (Figuras 4A-D).
10 Estimulación de la proliferación de mitocondrias en los miocitos - Adicional o
alternativamente, se utiliza un agonista dual-PPARo/y como la naringenina (Goldwasser
et al. PLoS One 2010) para estimular la proliferación de mitocondrias en los miocitos,
ampliando su contenido proteico, y la diferenciación adipogénica de los fibroblastos
restantes a grasa.
15 EJEMPLO 8
CARNE DE POLLO CULTIVADA EN LABORATORIO: CONVERSIÓN DE
UNA LÍNEA CELULAR DE FIBROBLASTOS DE POLLO
ESPONTÁNEAMENTE INMORTALIZADOS EN MIOCITOS
Generación de vectores MyoD1 y PPAR y inducibles por Dox - Dox-inducible
20 Se generaron vectores MyoD1 y PPARy. Estos vectores son capaces de transformar
fibroblastos de pollo (primarios o inmortalizados) en miocitos y adipocitos con alta
eficiencia, respectivamente (datos no mostrados).
Trabajos anteriores demostraron que la expresión del gen MyoD1 es suficiente
para inducir la miogénesis de fibroblastos humanos y de ratón. Una miogénesis paralela
pero conectada
25 vía pasa por la miogenina (MYOG) en los mamíferos.
Resultados experimentales
Conversión genética de CSIF en miocitos - Para examinar si es posible una
conversión similar de células de pollo en miocitos, el presente inventor generó varias
construcciones de ácido nucleico (vectores) como se ilustra esquemáticamente en las
Figuras 6-8 y 12. La primera
30 constructo [Figura 6, "pInducer-VP64-cMyoD1", SEQ ID NO:3] incluía el gen MyoD1 de
pollo (SEQ ID NO:5) clonado en un vector lentiviral inducible por Dox (pInducer20)
fusionado al activador transcripcional VP64 (SEQ ID NO: 6) que se ha demostrado que
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para mejorar la diferenciación inducida por MyoD1 en células de ratón (Kabadi et al.
ACS Synthetic Biolog y. 2015). Se creó un segundo vector lentiviral (SEQ ID NO:2,
Figura 7) para la expresión de MYOG de pollo inducible por Dox que incluía la
secuencia codificante de la cMiogenina (SEQ ID NO: 7) bajo el control del promotor
CMV mínimo (SEQ ID NO: 8). A
Se creó un tercer vector lentiviral (SEQ ID NO:1, Figura 12) para la expresión de MYOD1
de pollo inducible por Dox que incluía la secuencia codificante de cMyoDl (SEQ ID
NO: 5) bajo el control del promotor CMV mínimo (SEQ ID NO: 8). Se secuenciaron los
tres vectores y se comprobó que no presentaban mutaciones (datos no mostrados).
Para detectar rápidamente la miogénesis en cultivo, el presente inventor creó una
GFP
10 constructo r e p o r t e r o (constructo reportero lentiviral; SEQ ID NO: 4, Figura 8)
para el potenciador-promotor de la cadena ligera de miosina-3 de rata (rMLC3-GFP),
incluyendo el potenciador MLC3 de rata (SEQ ID NO: 10; secuencia potenciadora de
1,5 kb del gen MLC3 de rata), el promotor MLC3 de rata (SEQ ID NO: 11; secuencia
promotora de 628 pb) y la secuencia codificante COP-GFP (SEQ ID NO: 12). En esta
construcción lentiviral reportera, la rata MCL3
15 potenciador y promotor que impulsan la expresión de la COP-GFP. Este reportero ha
demostrado ser específico y eficaz en embriones y células de pollo (McGrew et al. BMC
Developmental Biolog y 2010). Los distintos constructos se introdujeron en células
293T para generar lentivirus.
Las líneas primarias CEF y CSIF se infectaron 3 veces con los vectores lentivirus
20 y se dividieron un día después. Las células se cultivaron en medio DMEM/F12 estándar
con un 15% de suero. Los cultivos CEF y CSIF se indujeron con doxiciclina y se
siguieron durante 30 días. Mientras que l o s cultivos no inducidos fueron negativos
para GFP (Datos no mostrados), tanto CEF como CSIF muestran una fuerte expresión
de MLC3 en el día 11 de cultivo con células que forman fibras distintas mantenidas
hasta el día 30 de cultivo ( Figuras 5B y 5C).
25 El análisis de inmunofluorescencia mostró la organización de la actina F y la formación de
fibras multinucleadas (sincitios) (Figura 5D). La tinción mostró una clara inducción de
actina muscular ml-esquelética (ACTAI) y la troponina T muestra un claro fenotipo
muscular ya en el día 7 de inducción (Figura 5E).
Como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3, una pequeña molécula de
cribado con el objetivo de
30 p a r a identificar pequeñas moléculas que puedan transdiferenciar fibroblastos a
células musculares en ausencia de MyoD1 inducible por Dox se lleva a cabo utilizando
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un constructo reportero GFP (constructo reportero lentiviral) para el potenciador-
promotor de la cadena ligera de miosina-3 de rata (Figura
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8). Así, el presente inventor utiliza variantes de cócteles de moléculas pequeñas que
han demostrado recientemente que transdiferencian fibroblastos humanos y de ratón a
cardiomiocitos (Cao et a1 2016; Fu et a1. 2015). Un reportero MLC ligado a GFP
asegura una rápida detección de la conversión exitosa como se muestra en las
Figuras 5B-C.
5 Hay que tener en cuenta que el uso de algunas moléculas pequeñas que
pueden afectar a la estructura del ADN en la fase de reprogramación suscita
preocupación en el ámbito normativo. Las agencias reguladoras ya están estudiando
esta cuestión para la medicina regenerativa humana, mientras que otros grupos están
produciendo rápidamente pequeñas moléculas alternativas para la conversión. En
contraste con los enfoques de medicina regenerativa, el sistema de perfusión de
algunas realizaciones de la
10 invención puede lavar rápidamente el sistema y eliminar cualquier molécula pequeña
residual antes de que finalice el proceso. Adicional o alternativamente, puede usarse
un método de diferenciación inducible por Dox como se muestra en las Figuras 5A-
E.
Se lleva a cabo un análisis metabolómico del perfusato y del tejido a lo largo
del tiempo para identificar qué nutrientes limitan la tasa (es decir, faltan). Un modelo
de equilibrio del flujo metabólico
15 d e l t e j i d o (como se describe en Levy et a1. 2016), lo que permite ver los flujos
cambiantes y determinar los requisitos metabólicos de las células. Los factores de
crecimiento se introducen en el acceso y su eliminación se determina mediante
análisis de matrices de proteínas, ya que pequeñas moléculas van a sustituirlos. El
análisis metabólico mediante sensores metabólicos de Jobst Technologies (Friburgo,
Alemania) y un sensor de oxígeno, mostró la proliferación de CSIF
20 consumen oxígeno a un ritmo de 2,4 nmol/min/106 células, consumen glucosa a un
ritmo de 1,8 nmol/min/106 células y producen lactato a un ritmo de 198
pmol/min/106 células durante la fase de crecimiento.
EJEMPLO 9
25 GENERACIÓN DE UN HÍBRIDO DE PRODUCTO SUSTITUTIVO DE
LA CARNE DE ORIGEN VEGETAL CON GRASA
CULTIVADA EN LABORATORIO
Un análogo de la carne, también llamado sustituto de la carne, se aproxima a
ciertas cualidades estéticas (principalmente textura, sabor y apariencia) o
características químicas de tipos específicos de carne. Muchos análogos se basan en
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cereales, gluten o legumbres como
30 soja o guisante. El mercado mundial de sustitutos de la carne fue de 3.300 millones de
dólares en 2014, y crece a una TCAC del 7,5%, incluyendo productos como
hamburguesas vegetarianas, perritos calientes de soja y nuggets de pollo. Sin
embargo, estos productos no consiguen emular el sabor y el aroma de la carne animal.
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Trabajos recientes sobre sustitutos de la carne de origen vegetal identificaron la
leghemoglobina fermentada (también llamada "(también leghaemoglobina o
legoglobina") como fuente de un sabor metálico parecido al de la sangre. Utilizando
herramientas de gastronomía molecular, empresas como Impossible Foods y Beyond
Meat produjeron hamburguesas molidas similares a la carne con textura y aroma de
5 carne de vacuno. Sin embargo, la cocción de la grasa saturada ligada a las proteínas
produce el sabor característico de la carne. Los productos actuales utilizan aceite de
coco o de palma como fuente de palmitato (16:0), que es sólido a temperatura ambiente,
pero se funde rápidamente a 62,9°C. El resultado es un producto aceitoso y goteante,
distinto de la carne de vacuno real. El resultado es un producto aceitoso y goteante,
distinto de la auténtica carne de vacuno. Del mismo modo, varias empresas como
Beyond Meat extruyen proteínas de leguminosas en capas para crear la textura y la
sensación en boca del pollo.
10 tiras. La falta similar de grasa animal da como resultado una sensación de sequedad en
la boca distinta a la del pollo real. Para producir g r a s a animal, las CSIF se
cultivan en un medio sin suero compuesto de
DMEM/F12 suplementado con dexametasona (0,1 qM), bFGF (10 ng/ml), IGF-1 largo
(Sigma I1271) (5 ng/ml), 12 qM de ácido linoleico y 2 mM de L-analil-L-glutamina.
Las células se cultivan en biorreactores de alimentación por lotes, biorreactores de
perfusión o bucle cerrado.
15 perfusión descrita anteriormente hasta una densidad de 10x106 células/ml. Medio
suplementado con 400 qM de ácido oleico y 10 qM de rosiglitazona. Las células
adquieren gotas de lípidos y alcanzan una densidad de 100x106 células/ml. El lodo de
adipocitos se concentra y se añade como materia prima a la matriz vegetal compuesta de
aislado proteico a base de cereales o leguminosas, como el polvo orgánico de proteína
de guisante (Now Sports). Materia prima
20 densidad del material se modifica en función del producto final deseado. Las tiras de pollo
requieren entre un 5 y un 10% de adipocitos cultivados en laboratorio, lo que da como
resultado unas 1,5x10 c é l u l a s e n e l p r o d u c t o f i n a l . Las hamburguesas
requieren entre un 10 y un 20% de adipocitos cultivados en laboratorio, lo que da como
resultado unas 3x10 c é l u l a s e n e l p r o d u c t o f i n a l .
25 EJEMPLO 10
GENERACIÓN DE UNA HAMBURGUESA O NUGGET DE POLLO EN UN
BIORREACTOR AGITADO
Cultivo de fibroblastos de pollo en un biorreactor agitado - Los fibroblastos de
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pollo pueden cultivarse en un biorreactor agitado (BioFlo320 ) en pequeños
recipientes de un solo uso de 250-
30400 mL de volumen.
Las células se agregan en pequeños microgrupos y se cultivan en suspensión sin
microesferas portadoras. Esto permite el crecimiento en alta densidad de células que
alcanzan 4-
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6x106 células/mL. Una vez alcanzada esta densidad, se prepara una hamburguesa o
nugget de pollo con una densidad de 200x106 células/gramo para su degustación pública.
Alternativamente, los fibroblastos pueden cultivarse en microesferas portadoras
recubiertas de colágeno (por ejemplo, So1oHi11 Engineering) como se ha descrito
previamente (Ang & Ma Sha 2015).
5 EJEMPLO 11
ESTABLECIMIENTO Y AISLAMIENTO DE CÉLULAS ENDOTELIALES
EMBRIONARIAS DE POLLO
Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) de pollo en
células endoteliales - Utilizando fibroblastos de pollo (no inmortalizados) el presente
inventor
10 generaron células madre pluripotentes inducidas de pollo (iPSCs) esencialmente según lo
descrito por Vodyanik et al. 2010. A continuación, las iPSC de pollo se utilizan para la
diferenciación de células endoteliales de pollo de forma similar a las células derivadas
de humanos y ratones (Giacomelli et al. Development 2017). Las células endoteliales de
pollo derivadas de iPS se pueden utilizar tal cual con una duplicación de población
limitada (hasta 20) o se pueden utilizar para generar
15 células endoteliales espontáneamente inmortalizadas como se describe a continuación.
Inmortalización espontánea de células endoteliales de pollo - Células
endoteliales microvasculares de pollo obtenidas de una fuente comercial (Charles River
Labs) o aisladas de pollos jóvenes según protocolos establecidos (Twal & Leach In
Vitro Cell. Dev. Biol. Animal 1996).
20 cultivándose sobre 50 qg/ml de colágeno tipo I o 0,2% de gelatina en un medio de cultivo
estándar, como EGM2mv (Lonza, Suiza) o una formulación sin suero (por ejemplo,
ThermoFisher #11111044) que contenga bFGF (20 ng/ml), EGF (10 ng/ml) y
fibronectina plasmática humana (10 qg/ml) hasta que se produzca una inmortalización
espontánea, con el fin de obtener una línea celular endotelial de pollo que no esté
modificada genéticamente.
25Se observa que el presente inventor pudo obtener una célula endotelial
espontáneamente inmortalizada a partir de células endoteliales microvasculares
cardíacas de rata compradas a Vec Technologies (Rensselaer, NY), alcanzando al menos
la duplicación de población 120 (datos no mostrados), demostrando así que es factible
una inmortalización espontánea de células endoteliales.
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EJEMPLO 12
GENERACIÓN DE MÚSCULO DE POLLO MEDIANTE ESPONJAS
Generación de tejido muscular de pollo por cocultivo de fibroblastos
espontáneamente inmortalizados y células endoteliales espontáneamente
inmortalizadas en esponjas
5 (andamios) - El presente inventor ha diseñado la generación de músculo de pollo
sembrando mezclas de fibroblastos de pollo espontáneamente inmortalizados y células
endoteliales de rata espontáneamente inmortalizadas en una esponja biodegradable de
poros grandes, como un hidrogel de colágeno, que permite una rápida vascularización y
una distribución uniforme de nutrientes. El microtejido se caracteriza mediante
microscopía confocal y electrónica.
10Otras esponjas (andamios) adecuadas incluyen, entre otras, esponjas de ácido
poliláctico, ácido poliglicólico o poli(ácido láctico-co-glicólico), esponjas de ácido
poliglicólico, variotisT^ (Biometic, AU) o CelluspongeT " (hidroxipropilcelulosa. Catálogo
Bio-Byblos nº Z741057).
Cabe señalar que una posible forma de evitar la pérdida de células por la perfusión
15 sistema, consiste en incrustar primero las células en una matriz polipeptídica de hidrogel
inyectable que luego se inyecta en la esponja biodegradable.
El andamiaje de microtejidos se cultiva en perfusión y se realiza un seguimiento
de la proliferación celular y la absorción metabólica de nutrientes y factores de
crecimiento, como se muestra en la Tabla 2. La absorción no específica por el sistema se
monitoriza, incluso en ausencia de células,
20 ya que esto podría provocar la pérdida de péptidos y lípidos.
Cuadro 2
Flujo metabólico Medición
Tasa de consumo de oxígeno 2,4 nmol/min/10 células

Tasa de absorción de glucosa 1, 8nmol/min/10 células
Tasa de producción de lactato 198 pmol/min/10 células
Las tasas de crecimiento y los parámetros metabólicos se reintroducen en el

modelo y
Se ajustan los parámetros de 25 sistemas.
El crecimiento celular y la densidad celular máxima se determinan en ausencia de
diálisis.
Tras la demostración satisfactoria del crecimiento celular bajo perfusión, la
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organización del tejido y la conectividad y distribución vascular adecuadas se
caracterizan como
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que se muestran en las Figuras 11A-C. Los fibroblastos de pollo espontáneamente
inmortalizados (CSIF) y las células endoteliales microvasculares de rata
espontáneamente inmortalizadas (RCEC) se suspendieron a una densidad de 150x106
CSIF/ml y 15x106 RCEC/ml en un andamio de colágeno de tipo 1 y se sembraron
para su evaluación al microscopio y perfusión. Tejido de alta densidad formado
durante la noche
5 y compactaron el andamiaje de colágeno. Como muestra la tinción con sulforhodamina
B, las células cultivadas revelaron un alto contenido en proteínas (Figura 11A). El
tejido sembrado en el biorreactor se selló y perfundió en medio libre de suero, sin
antibióticos durante 11 días. No se observó pérdida de masa celular. El análisis
confocal mostró una clara organización de las estructuras vasculares y del tejido
asociado.
10Se utilizan factores de crecimiento y citocinas para definir la
maduración vascular. El ensamblaje y el crecimiento del tejido se
caracterizan mediante imágenes en vivo y evaluación microscópica de los
puntos finales. Una vez que la densidad celular supera la absorción de nutrientes, se
aumenta la velocidad de perfusión a través del circuito de diálisis anidado para
eliminar rápidamente las toxinas y añadir al mismo tiempo un suministro estable de
nutrientes al tejido en crecimiento. El modelo descrito anteriormente demuestra que
la mínima
15 La velocidad de perfusión necesaria para mantener el crecimiento celular aumenta
exponencialmente con el tiempo o linealmente con la masa tisular para abastecer las
tasas de consumo de oxígeno de las células. Se necesita una velocidad de perfusión
mínima de 36,9 ml/s para mantener 1 kg de tejido en un ambiente con un 21% de
oxígeno, pero sólo se necesitan 8,2 ml/s si la presión parcial de oxígeno se eleva al
95% en el oxigenador. La velocidad de perfusión mínima puede disminuir
aumentando la presión parcial de oxígeno.
20 capacidad de t r a n s p o r t e del medio utilizando un portador de oxígeno como la
emulsión de perfluorocarbono (por ejemplo, Fluosol) o la hemoglobina modificada
(por ejemplo, Hemopure). Hemopure es un portador de oxígeno a base de
hemoglobina fabricado por HbO2 Therapeutics LLC que tiene una capacidad de
transporte de oxígeno de 1,39 ml 02/g Hb, lo que significa que si añadimos 3,55 qg
de Hemopure por ml de medio duplicamos el contenido de oxígeno, disminuyendo en 2
la perfusión.
25 necesaria para perfundir una gran cantidad de tejido.
El modelo también sugiere que la glucosa no es un factor limitante para la
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perfusión, ya que caudales inferiores a 0,4 ml/seg pueden suministrar glucosa
suficiente a más de 1 kg de células. Sin embargo, como la glucosa no se repone, 1 kg
de tejido consumirá toda la glucosa del sistema en 48 minutos. Se requiere un total de
140 gramos de glucosa para el tejido
30 c r e c i m i e n t o . La glucosa sólo se convierte en limitante cuando el tejido
supera los 24 gramos de masa, y será necesario añadirla a intervalos de una hora en
los dos últimos días de crecimiento.
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Como alternativa, se explora el crecimiento de tejidos en cartuchos de fibra
hueca comestible, donde el suministro de nutrientes se distribuye homogéneamente en
ausencia de una red vascular integrada. Aquí, las fibras del cartucho están hechas de
polímeros naturales o sintéticos comestibles, como la celulosa (FiberCell, #C3008), y
las células forman una masa que rodea a
5 las fibras. La celulosa está aprobada por la FDA como GRAS, y se utiliza para controlar la
humedad y estabilizar el queso rallado, el pan y diversas salsas.
EJEMPLO 13
Se ha diseñado un prototipo de sistema, según algunas realizaciones de la
10 presente invención. El sistema prototipo se ilustra esquemáticamente en la FIG. 9, y se basa
en un biorreactor de diálisis de circuito cerrado. El circuito central es un biorreactor de
perfusión recirculante, de 1 a 5 litros de volumen, que cultiva tejido muscular de 20 mg a
1000 gramos, y que retiene células utilizando un cartucho de fibra hueca, un diseño de
lecho empaquetado, o una configuración de tejido embebido vascularizado. Un
porcentaje creciente del biorreactor
15 flujo de salida se hace circular a través de una diálisis de contracorriente, cuyos poros están
diseñados para excluir la albúmina, alrededor de 30 kDa de peso molecular de corte.
Como las células no están presentes durante este paso de filtración, puede producirse a
altas presiones. Este diseño retiene la albúmina y con ella los factores de crecimiento y
lípidos se transporta en el medio. Otra perfusión hace circular el dializado a través de un
filtro que elimina el amoníaco y las toxinas (por ejemplo, Zeolita
20 tamiz molecular). Este diseño puede alcanzar la relación volumen/masa de los animales,
nominalmente 100 ml por kg de masa. Se estima que se pueden utilizar unos 2 litros de
medio por cada 5 litros de volumen del biorreactor. Este diseño puede producir 2,5 kg de
masa cada 10 días, consumiendo sólo 2 litros de medio, ya que no requiere un tren de
siembra. Esto se traduce en 4 dólares por kg de masa sólo en costes de medio.
25También se tienen en cuenta los costes de capital. La estimación actual
de la lista de piezas utilizando componentes disponibles en el mercado es de unos 7.000
dólares, lo que sugiere unos costes de fabricación de unos 300 dólares para un sistema
con una cámara de biorreactor de 5 litros. Una instalación de producción con 5.000
sistemas de este tipo puede costar alrededor de 1,5 millones de dólares, lo que supone
una estimación de unos 5 millones de dólares para toda la instalación. Suponiendo los
mismos costes anuales de depreciación y mantenimiento del 10%, un
30 se obtiene una capacidad de producción de unos 450.000 kg/año con unos costes anuales de
mantenimiento de unos 500.000 dólares. Esto se traduce en un coste de capital de solo
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unos 1,1 dólares por kg de masa producida.
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El sistema prototipo se compone de un circuito primario de perfusión tisular y
un circuito secundario de diálisis para el intercambio de nutrientes y toxinas. El
circuito primario incluye perfusato de medio de cultivo que se recircula mediante una
bomba peristáltica a través de una cámara de crecimiento tisular enchaquetada, un
oxigenador, un intercambiador de calor y un colector de burbujas. El
5 oxigenador se gasea con una mezcla de 95% Oz, 5% COz y 15% Nz manteniendo el pH
constante.
Una fracción del perfusato se desvía a un circuito secundario a través de un
dializador de fibra hueca, como el de Spectrum Labs (Rancho Dominguez, CA) con
una superficie de membrana de hasta 790 cm2 y un corte de peso molecular de 30 kDa
(la superficie total de filtración en
10 un riñón humano es de sólo 516,1 cm2 ). Una ventaja particular de la diálisis de las
presentes realizaciones es que la albúmina, con un peso molecular de 66,5 kDa, se
retiene en el circuito de perfusión principal, como se detalla más adelante.
El circuito secundario dializa el perfusato utilizando contracorriente para
maximizar la difusión, contra un dializado libre de proteínas, recirculado a través de
un filtro de amoníaco utilizando
15 otra bomba peristáltica. Los filtros de amoníaco, como las zeolitas, atrapan el amoníaco
de la solución. La temperatura dentro del biorreactor se optimiza entre 38°C y
40,5°C imitando la temperatura corporal normal de los pollos.
También se tienen en cuenta las tasas de perfusión y de consumo de
nutrientes. En condiciones ambientales, una presión parcial del 21% (160 mmHg) de
oxígeno da lugar a una concentración de
20 220 nmol Ould medio. Utilizando un Bioanalizador SeaHorse, el Inventor demostró que
Amin/106
los fibroblastos embrionarios de pollo consumen 2,4 nmol O células.
Considerando que 1 g de tejido contiene aproximadamente 200v106 células, una
velocidad de perfusión de unos 36,9 ml/s es
suficiente para mantener 1 kg de tejido en incubadoras con presiones de gas estándar.
Si la presión parcial de oxígeno se eleva al 95%, es suficiente una velocidad de
perfusión de unos 8,2 ml/s.
25 Además, se tiene en cuenta el consumo de glucosa. Utilizando sensores en
línea, se midió una tasa de captación de glucosa de 1,8 nmol/min/106 células, y una
tasa de producción de lactato de 198 pmol/min/106 células en fibroblastos
embrionarios de pollo. Teniendo en cuenta que el medio DMEM/F12 contiene 3,15
g/L de glucosa, la velocidad de perfusión necesaria para mantener 1 kg de tejido sería
de 0,36 ml/seg. Por lo tanto, la glucosa no es un factor limitante para la perfusión del
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medio.
30 Sin embargo, se prefiere la adición continua de glucosa, opcionalmente a intervalos
estrechos, durante el cultivo en fase tardía, ya que a este ritmo 1 kg de tejido
consume la glucosa en 1 litro de medio en unos 48 min.
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Las FIGs. 10A y 10B son gráficos que muestran la masa de producto y las
tasas de perfusión aplicadas (FIG. 10A), y el consumo acumulado de glucosa (FIG.
10B). En este ejemplo, se ha empleado una tasa de crecimiento exponencial
caracterizada por una constante de tiempo de duplicación de 20 horas. A esta tasa de
crecimiento, se prefiere añadir glucosa a partir del día 13, de modo que
5 para satisfacer la demanda de glucosa.
Las bombas peristálticas se seleccionan para proporcionar una velocidad de
perfusión de al menos 36 ml/s, especialmente hacia los últimos días del ciclo (por
ejemplo, a principios del día 13). Sin embargo, esta tasa puede disminuirse utilizando
diferentes estrategias como transportadores de oxígeno para aumentar el nivel basal
de Oz en el medio. Por ejemplo, Hemopure es un transportador de oxígeno a base de
hemoglobina
10 fabricado por HbOz Therapeutics LLC que tiene una capacidad de transporte de oxígeno
de
1,39 ml OnlyHb, lo que significa que añadiendo 3,55 qg de Hemopure por ml de
medio se puede duplicar el contenido de oxígeno y disminuir la velocidad de
perfusión en un factor de 2.
En la Tabla 3 se comparan el proceso de alimentación por lotes, el proceso de
perfusión concentrada y la técnica según las realizaciones ejemplares.
15 de la invención.
Cuadro 3
Circulando
Parámetro Fed-Batch La técnica inventiva
Perfusión
Carrera de 20L
20L, 80L, durante 10
Tren de semillas Ninguno
400L, 2000L días; 6
volúmenes de
reactor
Reactor de 10,000 L 1,000 L 5L
producción
Densidad celular 25x10 100x10' 100x10'
Fase de crecimiento 19 días 30 días 10 días
Consumo de medios 12,500 L 2,120 L 2L
de comunicación
Coste de los medios $20/L $5/L $5/L
de comunicación
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Gastos de consumo +$200/kg +$21/kg +$4/kg
Coste de las $50M $30M $5M *

instalaciones
Carga de capital $5M $3M $0.5M
Capacidad de 24.000 kg/año 6.000 kg/año 450.000 kg/año
producción
Costes de capital +$200/kg +$500/kg +$1 8
* 5.000 pequeños biorreactores de 5L en una fábrica
Aunque la invención se ha descrito en conjunción con realizaciones específicas

de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán
evidentes para los expertos en la materia. En consecuencia, se pretende abarcar todas las
5 tales alternativas, modificaciones y variaciones que entren dentro del espíritu y el amplio
alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta
especificación se incorporan en su totalidad por referencia a la especificación, en la
misma medida que si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera
específica y
10 individualmente indicadas para ser incorporadas aquí por referencia. Además, la cita o
identificación de cualquier referencia en esta solicitud no se interpretará como una
admisión de que dicha referencia está disponible como estado de la técnica anterior a la
presente invención. En la medida en que se utilicen encabezamientos de sección, no
deberán interpretarse como necesariamente limitativos.
Será evidente para los expertos en la materia que la invención no se limita a la
15 detalles de las anteriores realizaciones ilustradas y que la presente invención puede
realizarse en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o de los atributos
esenciales de la misma. Por lo tanto, las presentes realizaciones deben considerarse en
todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas, indicándose el alcance de la
invención mediante las reivindicaciones adjuntas y no mediante la descripción
precedente, y todos los cambios que se produzcan en la presente invención deben
considerarse como ilustrativos y no restrictivos, y todos los cambios que se produzcan en
la presente invención deben considerarse como ilustrativos y no restrictivos.
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20 dentro del significado y rango de equivalencia de las reivindicaciones, por lo que se
pretende que queden comprendidas las
mismas.
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125
REFERENCIAS
(Las referencias adicionales se citan en el texto)
1. Cultivo y expansión a largo plazo de hepatocitos humanos primarios. G. Levy, D.
Bomze,
S. Heinz, S. D. Ramachandran, A. Noerenberg, M. Cohen, O. Shibolet, E. Sklan, J.
Braspenning, Y. Nahmias. 2015, Nature biotechnology, pp. 1264-1271.
2. Una trampa de burbujas activa y un depurador para sistemas microfluídicos. A. M.
Skelley, J. Voldmana. 2008, The Royal Society of Chemistry, pp. 1733-1737.
3. La monitorización en tiempo real de la función metabólica en microdispositivos
liver-on-chip rastrea la dinámica de la disfunción mitocondrial. D. Bavli, S. Prill, E.
Ezra, G. Levy, M. Cohen,
M. Vinken, J. Vanfleteren, M. Jaeger, Y. Nahmias. E2231-E2240, s.1. : PNAS, 2016.
4. Células madre de pollo: avances actuales y perspectivas de futuro. S. Intarapat, C.
D. Stern. 2013, Stem cell research, pp. 1378-1392.
5. Células madre pluripotentes inducidas aviar derivadas utilizando factores de
reprogramación humanos. Y. Lu, F.D. West, B.J. Jordan, J.L. Mumaw, E.T. Jordan, A.
Gallegos-Cardenas, R.B. Beckstead, S.L. Stice. s.1. : Stem Cells Dev., 2012, Vols. 394-
403.
6. Genes de mamíferos inducen células madre pluripotentes parcialmente reprogramadas
en especies de vertebrados e invertebrados no mamíferos. R. A. Rossello, C. C. Chen,
R. Dai, J.
T. Howard, U. Hochgeschwender, E. D. Jarvis. 2013, eLife 2.
7. Células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas de ratón
mediante compuestos de moléculas pequeñas. P. Hou, Y. Li, X. Zhang, C. Liu, J. Guan,
H. Li, T. Zhao, J. Ye, W. Yang,
K. Liu, J. Ge, J. Xu, Q. Zhang, Y. Zhao, H. Deng. 2013, Science, pp. 651-654.
8. Identificación de pequeñas moléculas para la expansión de hepatocitos humanos y
la diferenciación iPS. J. Shan, R. E. Schwartz, N. T. Ross, D. J. Logan, D. Thomas, S.
A. Duncan, T. E. North, W. Goessling, A. E. Carpenter, S. N. Bhatia. 2013, Nature
chemical biology, pp. 514-520.
9. Conversión de fibroblastos humanos en cardiomiocitos funcionales mediante pequeñas
moléculas.
N. Cao, Y. Huang, J. Zheng, C. I. Spencer, Y. Zhang, J. D. Fu, B. Nie, M. Xie, M.
Zhang, H. Wang, T. Ma, T. Xu, G. Shi, D. Srivastava, S. Ding. 2016, Science.
10. Reprogramación directa de fibroblastos de ratón en cardiomiocitos con cócteles
químicos. Y. Fu, C. Huang, X. Xu, H. Gu, Y. Ye, C. Jiang, Z. Qiu, X. Xie. 2015, Cell
WO 2018/011805 PCT/IL2017/050790
126
research, pp. 1013-1024.
WO 2018/011805 PCT/IL2017/050790
127
11. Reclutamiento de hepatocitos mediado por el endotelio en el establecimiento de
tejido similar al hígado in vitro. Y. Nahmias, R. E. Schwartz, W. S. Hu, C. M.
Verfaillie, D. J. Odde. 2006, Tissue engineering, pp. 1627-1638.
12. Recuperación de injertos hepáticos isquémicos calientes de rata mediante
perfusión extracorpórea normotérmica. H. Tolboom, R. E. Pouw, M. L. Izamis, J. M.
Milwid, N. Sharma, A. Soto-Gutiérrez, Y. Nahmias, K. Uygun, F. Berthiaume, M. L.
Yarmush. 2009, Transplantation, pp. 170-177.
13. La monitorización en tiempo real de la función metabólica en microdispositivos
liver-on-chip rastrea la dinámica de la disfunción mitocondrial. D. Bavli, S. Prill, E.
Ezra, G. Levy, M. Cohen,
M. Vinken, J. Vanfleteren, M. Jaeger, Y. Nahmias. 2016, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, pp. E2231-2240.
14. La monitorización en tiempo real de la captación de oxígeno en el biorreactor
hepático muestra la toxicidad mitocondrial independiente del CYP450 del paracetamol
y la amiodarona. S. Prill, D. Bavli, G. Levy, E. Ezra, E. Schmalzlin, M. S. Jaeger, M.
Schwarz, C. Duschl, M. Cohen, Y. Nahmias. 2016, Archivos de toxicología, pp. 1181-
1191.
15. Cocultivo de fibroblastos y queratinocitos humanos primarios sin suero. S. Mujaj,
K. Manton, Z. Upton, S. Richards. 2010, Tissue engineering, pp. 1407-1420.
16. El factor de crecimiento similar a la insulina I estimula la expansión de los
mioblastos y el desarrollo de miofibras en las extremidades. P. J. Mitchell, S. E.
Johnson, K. Hannon. 2002, Developmental dynamics : an official publication of the
American Association of Anatomists, pp. 12- 23.
17. Cribado y descubrimiento de compuestos de nitro-benzoxadiazol que activan el
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en células cancerosas. V.
Sakanyan, M. Angelini, M. Le Bechec, M. F. Lecocq, F. Benaiteau, B. Rousseau, A.
Gyulkhandanyan, L. Gyulkhandanyan, C. Loge, E. Reiter, C. Roussakis, F. Fleury.
2014, Informes científicos,
p. 3977.
18. Diferenciación de células madre pluripotentes a fibra muscular para modelar la
distrofia muscular de Duchenne. J. Cha1, M. Oginuma, Z. Al Tanoury, B. Gobert, O.
Sumara, A. Hick, F. Bousson, Y. Zidouni, C. Mursch, P. Moncuquet, O. Tassy, S.
Vincent, A. Miyanari, A. Bera, J. M. Garnier, G. Guevara, M. Hestin, L. Kennedy, S.
Hayashi, B. Drayton, T. Cherrier, B. Gayra. 2015, Nature biotechnology, pp. 962-969.
WO 2018/011805 PCT/IL2017/050790
128
19. M yoD convierte fibroblastos dérmicos primarios, condroblastos, músculo liso y
células epiteliales pigmentadas de la retina en mioblastos estriados mononucleados y
miotubos multinucleados. J. Choi, M. L. Costa, C. S. Mermelstein, C. Chagas, S.
Holtzer, H. Holtzer. 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, pp. 7988-7992.
20. El sistema reducible Tet-on combinado con la electroporación in ovo disecciona
múltiples funciones de los genes en la somitogénesis de embriones de pollo. T.
Watanabe, D. Saito, K. Tanabe,
R. Suetsugu, Y. Nakaya, S. Nakagawa, Y. Takahashi. 2007, Biología del desarrollo, pp.
625-636.
21. Selección eficaz de transfectantes de alta expresión con un nuevo vector eucariota.
H. Niwa, K. Yamamura, J. Miyazaki. 1991, Gene, pp. 193-199.
22. Un sistema de cultivo de embriones de pez cebra define los factores que promueven
la miogénesis de vertebrados en todas las especies. C. Xu, M. Tabebordbar, S. lovino,
C. Ciarlo, J. Liu, A. Castiglioni, E. Price, M. Liu, E. R. Barton, C. R. Kahn, A. J.
Wagers, L. I. Zon. 2013, Cell, pp. 909-921.
23. Miogénesis esquelética por células madre embrionarias humanas. J. K. Zheng, Y.
Wang, A. Karandikar, Q. Wang, H. Gai, A. L. Liu, C. Peng, H. Z. Sheng. 2006, Cell
research, pp. 713-722.
24. Cultivo in vitro a largo plazo y caracterización de células madre embrionarias
aviares con múltiples potencialidades morfogenéticas. B. Pain, M. E. Clark, M. Shen,
H. Nakazawa, M. Sakurai, J. Samarut, R. J. Etches. 1996, Development, pp. 2339-2348.
25. Identificación de pequeñas moléculas que inducen la diferenciación del músculo
esquelético en células madre embrionarias a través de la activación de la vía Writ y la
inhibición de las vías Smad2/3 y Sonic Hedgehog. H. Lee, C. Haller, C. Manneville, T.
Doll, I. Fruh, C. G. Keller, S.
M. Richards, Y. Ibig-Rehm, M. Patoor, M. Goette, L. C. Bouchez, M. Mueller. 2016,
Células madre, pp. 299-310.
26. Construyendo músculo: regulación molecular de la miogénesis. C. F. Bentzinger,
Y. X. Wang, M. A. Rudnicki. 2012, Cold Spring Harbor perspectives in biology.
27. Los cambios en la acetil-CoA y la acetilación de histonas mediados por la
glucólisis controlan la diferenciación temprana de las células madre embrionarias. A.
Moussaieff, M. Rouleau, D. Kitsberg,
M. Cohen, G. Levy, D. Barasch, A. Nemirovski, S. Shen-Orr, I. Laevsky, M. Amit, D.
WO 2018/011805 PCT/IL2017/050790
129
Bomze, B. Elena-Herrmann, T. Scherf, M. Nissim-Rafinia, S. Kempa, J. Itskovitz-
Eldor, E. Meshorer, D. Aberdam, Y. Nahmias. 2015, Cell metabolism, pp. 392-402.
28. Roxarsona, arsénico inorgánico y otras especies de arsénico en el pollo: una
muestra de la cesta de la compra de EE.UU. K. E. Nachman, P. A. Baron, Ci. Raber, K.
A. Francesconi, A. Navas-Acien, D. C. Love. 2013, Environmental health perspectives,
pp. 818-824.
29. Staphylococcus aureus multirresistente en la carne y las aves de corral
estadounidenses. A. E. Waters,
T. Contente-Cuomo, J. Buchhagen, C. M. Liu, L. Watson, K. Pearce, J. T. Foster, J.
Bowers, E. M. Driebe, D. M. Engelthaler, P. S. Keim, L. B. Price. 2011, Clinical
infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of
America, pp. 1227-1230.
30. Micropatterning of living cells by laser-guided direct writing: application to
fabrication of hepatic-endothelial sinusoid-like structures. Y. Nahmias, D. J. Odde.
2006, Nature protocols, pp. 2288-2296.
31. Integración de tecnologías para la ingeniería de tejidos hepáticos. Y. Nahmias, F.
Berthiaume, M. L. Yarmush. 2007, Advances in biochemical
engineering/biotechnology, pp. 309-329.
32. Hígado humano vascularizado y funcional a partir de un trasplante de yema de
órgano derivado de iPSC. T. Takebe, K. Sekine, M. Enomura, H. Koike, M. Kimura, T.
Ogaeri, R. R. Zhang, Y. Ueno, Y. W. Zheng, N. Koike, S. Aoyama, Y. Adachi, H.
Taniguchi. 2013, Nature, pp. 481-484.
33. Una nueva formulación de matriz transportadora de oxígeno mejora la función
específica hepática de hepatocélulas cultivadas. Y. Nahmias, Y. Kramvis, L. Barbe, M.
Casali, F. Berthiaume, M.
L. Yarmush. 2531-2533, s.1. : FASEB, 2006.
WO 2018/011805 PCT/IL2017/050790
130
LO QUE SE RECLAMA ES:
1. Un sistema para cultivar células, el sistema

comprende: una cámara biorreactora para cultivar las
células;
un sistema de suministro configurado para suministrar una solución de perfusión
a la cámara del biorreactor para la perfusión de dicha solución de perfusión a través de
las células a una velocidad de perfusión;
un sistema de diálisis que tenga un dializador y un dializado para realizar una
diálisis y un filtro para reducir el contenido de amoníaco en dicho dializado; y
un controlador configurado para hacer circular dicha solución de perfusión fuera
de dicha cámara de biorreactor a través de dicho dializador y de vuelta a dicha cámara
de biorreactor, y para hacer circular dicho dializado fuera de dicho dializador a través de
dicho filtro y de vuelta a dicho dializador.
2. Un método de cultivo de células, el método

comprende: cultivar las células en una cámara
biorreactora;
suministrar una solución de perfusión a dicha cámara del biorreactor para la
perfusión de dicha solución de perfusión a través de las células;
hacer circular dicha solución de perfusión fuera de dicha cámara biorreactora a
través de un dializador que tenga un dializador en su interior y de vuelta a dicha cámara
biorreactora; y
hacer circular dicho dializado fuera de dicho dializador, a través de un filtro
seleccionado para reducir el contenido de amoníaco en dicho dializado, y de vuelta a
dicho dializador.
3. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el

que al menos el 90% de un volumen de dicha solución de perfusión que sale de dicha
cámara biorreactora circula de vuelta a dicha cámara biorreactora durante todo un
periodo de crecimiento de dichas células.
4. Un sistema para cultivar células, el sistema

comprende: una cámara biorreactora para cultivar las
células;
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131
a dicha cámara del biorreactor para la perfusión de dicha solución de perfusión a través
de las células a una velocidad de perfusión;
un sistema de diálisis que tenga un dializador para realizar una diálisis; y
un controlador configurado para aumentar dicha velocidad de perfusión con el
tiempo, y para hacer circular dicha solución de perfusión fuera de dicha cámara del
biorreactor, por separado a través de dicho dializador y dicho sistema de suministro, y
de vuelta a dicha cámara del biorreactor;
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132
en el que al menos el 90% de un volumen de dicha solución de perfusión que
sale de dicha cámara biorreactora se hace circular de vuelta a dicha cámara biorreactora
durante todo un periodo de crecimiento de dichas células.
5. Un método de cultivo de células, el método

comprende: cultivar las células en una cámara
biorreactora;
suministrar mediante un sistema de suministro una solución de perfusión a dicha
cámara del biorreactor para la perfusión de dicha solución de perfusión a través de las
células a una velocidad de perfusión que aumenta con el tiempo; y
hacer circular dicha solución de perfusión fuera de dicha cámara biorreactora por
separado a través de un dializador y dicho sistema de suministro, y de vuelta a dicha
cámara biorreactora;
en la que al menos el 90% de un volumen de dicha solución de perfusión que
sale de dicha cámara biorreactora se hace circular de vuelta a dicha cámara biorreactora
durante todo un periodo de crecimiento de dichas células.
6. El sistema o método según la reivindicación 1, en el que dichas células

forman una
tejido.
7. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el

que dichas células forman un tejido.
8. El sistema o método según la reivindicación 1, en el que dichas células

forman un producto cárnico cultivado.

que dichas células forman un producto cárnico cultivado.
10. Un sistema para hacer crecer un cultivo celular en suspensión, el

sistema comprende: una cámara biorreactora para hacer crecer el cultivo
celular en suspensión;
a dicha cámara del biorreactor para la perfusión de dicha solución de perfusión a través
del cultivo de células en suspensión a una velocidad de perfusión;
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133
un sistema de diálisis que tenga un dializador para realizar una diálisis; y
un controlador configurado para hacer circular dicha solución de perfusión
fuera de dicha cámara biorreactora a través de dicho dializador y de vuelta a dicha
cámara biorreactora, manteniendo al menos el 95% de las células que forman dicho
cultivo celular en suspensión en dicha cámara biorreactora durante dicha circulación.
11. Un método para cultivar un cultivo celular en suspensión, que

comprende: cultivar el cultivo celular en suspensión en una cámara
biorreactora;
suministrar una solución de perfusión a dicha cámara del biorreactor para la
perfusión de dicha solución de perfusión a través del cultivo de células en
suspensión; y
hacer circular dicha solución de perfusión fuera de dicha cámara biorreactora
a través de un dializador y de vuelta a dicha cámara biorreactora, manteniendo al
menos el 95% de las células que forman dicho cultivo celular en suspensión en dicha
cámara biorreactora durante dicha circulación.
12. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11,

en el que dicho dializador comprende un filtro seleccionado para reducir el contenido
de amoníaco de dicha solución de perfusión.
13. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 10

y 11, en el que dicha velocidad de perfusión aumenta con el tiempo.
14. El sistema o método según la reivindicación 13, en el que dicho

incremento es exponencial.
15. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 5,

6, 10 y 11, en el que hay una pluralidad de cámaras de biorreactor, estando todas en
comunicación fluida con el mismo dializador, y en el que dicho dializador aplica
dicha diálisis a las soluciones de perfusión que circulan fuera de cada una de dichas
cámaras de biorreactor.
16. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, 8 y

12-14, en el que hay una pluralidad de cámaras de biorreactor, estando todas en
comunicación fluida
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134
con el mismo d i a l i z a d o r , y en el que dicho dializador aplica dicha diálisis a las
soluciones de perfusión que circulan fuera de cada una de dichas cámaras del biorreactor.
17. El sistema según la reivindicación 1, en el que dicho dializador está

configurado para asegurar que al menos una proteína que sale de dicha cámara
biorreactora con dicha solución de perfusión circula de nuevo hacia dicha cámara
biorreactora.

que dicho dializador está configurado para asegurar que al menos una proteína que sale
de dicha cámara biorreactora con dicha solución de perfusión circula de vuelta a dicha
cámara biorreactora.
19. El sistema según la reivindicación 17, en el que dicha al menos una

proteína es albúmina.
20. El sistema o método según la reivindicación 18, en el que dicha al menos

una proteína es albúmina.
21. El sistema según la reivindicación 1, en el que hay desde

aproximadamente 0,1 litros hasta aproximadamente 10 litros de dicha solución de
perfusión por un kilogramo de células en dicha cámara de biorreactor.

que hay de aproximadamente 0,1 litros a aproximadamente un litro de dicha solución de
perfusión por un kilogramo de células en dicha cámara de biorreactor.

que dicho suministro de dicha solución de perfusión es a través de un circuito fluídico
constituido para enriquecer dicha solución de perfusión con un medio de cultivo y
oxígeno.
24. El sistema o método según la reivindicación 23, en el que dicho circuito

fluídico está constituido para enriquecer dicha solución de perfusión también por
dióxido de carbono.
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25. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 23 y 24, en
el que dicho circuito fluídico está constituido para atrapar o eliminar burbujas presentes
en dicha solución de perfusión.

que dicho circuito fluídico está constituido para calentar dicha solución de perfusión.
27. El sistema según la reivindicación 1, en el que dicha entrega y dicha

circulación es sin descartar dicha solución de perfusión a lo largo de dicho crecimiento
celular.

que dicho suministro y dicha circulación se realizan sin desechar dicha solución de
perfusión a lo largo de dicho crecimiento celular.
29. El sistema o método según la reivindicación 1, en el que las células

forman un producto cárnico cultivado y en el que dicha cámara del biorreactor tiene un
volumen máximo de 5 litros.

que dicha cámara del biorreactor tiene un volumen máximo de 5 litros.
31. Un método in vitro para generar una célula adipocitaria a partir de un

fibroblasto, que comprende cultivar un fibroblasto espontáneamente inmortalizado en un
medio libre de suero que comprende ácido oleico y un agonista o activador PPAR-
gamma, generando así la célula adipocitaria.
32. El método de la reivindicación 31, en el que dicho fibroblasto es un

fibroblasto aviar.
33. El método de la reivindicación 32, en el que dicha ave se selecciona del

grupo que consiste en: pollo, pato, ganso y codorniz.
34. El método de la reivindicación 31 o 32, en el que dicho fibroblasto es un

fibroblasto embrionario de pollo.
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136
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 31-34, en el que dicho
fibroblasto espontáneamente inmortalizado no está modificado genéticamente.

agonista o activador de PPAR-gamma es una molécula pequeña.
37. El método de la reivindicación 36, en el que dicha molécula pequeña se

selecciona del grupo que consiste en Tiazolidinediona, 3-Isobuti1-1-metilxantina
(IBMX), fenamilo, GW7845, RG14620 y Harmina.
38. El método de la reivindicación 36, en el que dicha molécula pequeña es

rosiglitazona.

medio libre de suero está desprovisto de contaminantes animales.

medio libre de suero está desprovisto de contaminantes humanos.
41. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 -40. en el que 'ai'i

suero-árbol inerlium comprende insulina o un sustituto de la misma, y factor básico de
crecimiento de fibroblastos (bFGF) o un sustituto de la misma, y al menos un agente
adicional seleccionado del grupo que consiste en dexametasona, transferrina, selenio,
EGF o un sustituto de la misma, y PGE2.
42. ", el método de la reivindicación 41, en el que el sustituto de dicha

insulina comprende IGF-1 o un IGF-1 R3 largo estabilizado.
43. El método de la reivindicación 41, en el que dicho sustituto de dicho EGF

comprende un agonista de EGF-R.
44. El método de la reivindicación 43, en el que dicho agonista del EGF-R

comprende NSC- 228155 a una concentración de 5-50 ng/ml.
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137
45. El método de la reivindicación 41, en el que dicho sustituto de dicho
bFGF es una molécula pequeña o un agonista sintético de la vía de señalización del
FGF.
46. El método de la reivindicación 45, en el que dicho agonista sintético es

C19-jun a una concentración de 10-20 ng/ml.
47. El método de la reivindicación 41. wliert en dicha dexametasona se

proporciona en un rango de concentración de 0,01 nM - 10 qM.
48. El método de la reivindicación 41, en el que dicho bFGF esproporcionado

enun rango de concentración de 0,1-30 ng/ml.
49. El método de la reivindicación 41, en el que dicho EGF se proporciona

en un intervalo de concentración de 0,1-30 ng/ml.
50. El método de la reivindicación 41, en el que dicha PGE2 esproporcionada

enun rango de concentración de 0,01 nM - 10 qM.
5I. Un adipocito obtainalale acentuando al inet1io'es de cualquiera de las

reivindicaciones.
31-50.
52. Un método para generar una grasa cultivada sobre una matriz proteica,
que comprende generar la célula adipocito a partir del fibroblasto según el método de
una cualquiera de las reivindicaciones 31-51, en el que dicho cultivo se realiza sobre una
matriz proteica de origen vegetal, generando así la grasa cultivada sobre la matriz
proteica.
53. El método de la reivindicación 52, en el que dicha matriz proteica de

origen vegetal es d e l a f a m i l i a d e las leguminosas (Fabaceae), de la familia de los
cereales o de la familia de los pseudocereales.
54. El método de la reivindicación 53, en el que dicha matriz proteica de

origen vegetal comprende una proteína de soja o una proteína de guisante.
WO 2018/011805 PCT/IL2017/050790
138
55. Una grasa cultivada en una matriz proteínica de origen vegetal.
56. La grasa cultivada de la reivindicación 55, obtenible por el método de

cualquiera de las reivindicaciones 52-54.
fi7. min in-rime rnethod of generating a injocjte front a fibrolalast, corri{ risiiig
iipregtilating cxpressiC'1J \x'1thin a spontaneotisly imincnlalizcd fibroblast of a polypcptitlc
selected from the p-roup consisting 'ot niyoD l an'i niyogeiiin.
SS. El rnetliod de claiin 57, wherein dijo u}'regu1alion es de dicho inyoDl

anti myogeliili polypcptides.
59. "El método de la reivindicación *7 o 58, en el que dicho polipéptido mioDl

de pollo está codificado por un p' linticlcotitJe que comprende la secuencia de ácidos
nocltícos establecida por SEQ
GO. El método según las reivindicaciones 57 o 55, en el que el polipéptido de

inyo3enina de pollo s-aire1 está codificado por un poliluclcótido que comprende el
conjunto de secuencias de ácido nucleico
torth por SEq m No:7.
GI. La rnethorl r f reivindicación 57 r r 55, en la que 'ai'i pollo inyr D1

polypeplide está codificado por la construcción de ácido nucleico establecida por SE()
lD NO. 1 o 3.
62. "el método de la reivindicación 57 o 58, en el que dicho polipéptido de

niop-enina de pollo está codificado por la construcción acitl nticlt ic establecida fcnlh
por .SEQ ID NO: 2.
63. Un miocito obtenible según los métodos o una minúscula de las

reivindicaciones 57-.
62.
64. Ñ1J ici-rte/ D lTlethod eff scrct nin¿c para un pequeño molccule capaz c'f
producir un inyocyte. c'omprîsing:
WO 2018/011805 PCT/IL2017/050790
139
(a) lransicionar un fibroblasto espontáneamente iniiriortaJizerl con un acitJ
nucleico COllStfiict que comprende una secuencia de ácido llucleico que codifica un
polipéptido reportero ulider un conlrol transcripcional de un }'rornoter 'peciItcamente
activo en m yr cytes,
(b) poner en contacto un fibroblasto transfectado resultante de la etapa (a)
con al menos una molécula pequeña de una pluralidad de moléculas pequeñas, y
(c) detectar la actividad de dicho polipéptido informador por encima de un
umbral predeterminado en dicho fibroblasto transfectado tras el paso (b), en el que la
presencia de dicha actividad por encima de dicho umbral predeterminado es indicativa
de que dicha al menos una molécula pequeña es capaz de con'-ertar dicho fibroblasto S
Olâtaneously inunortalizado en el rn yocyle.
65. El método de la reivindicación 64, en el que dicho fibroblasto es un

fibroblasto aviar.
66. El método de la reivindicación 64, en el que dicha ave se selecciona del

grupo que consiste en: pollo, pato, ganso y codorniz.
67. Un iii -vilr ' rnelhorl o1' generando un edit le irieat. comprendiendo el cultivo:
(a) un fibroblasto espontáneamente inmortalizado en un medio libre de suero
en condiciones adecuadas para convertir dicho fibroblasto en un adipocito. anti/o
'h) un fibroblasto espontáneamente inmortalizado en un medio libre de suero
en condiciones adecuadas para convertir dicho fibroblasto en un miocito,
therelay generando la carne comestible.
68. Un método in-ri/ro de p-eneratinp una carne comestible. que comprende el

cultivo:
(a) un fibroblasto espontáneamente inmortalizado en un medio libre de suero
en condiciones adecuadas para convertir dicho fibroblasto en un adipocito, anal/r r
(b) un fibroblasto espontáneamente inmortalizado en un medio libre de suero
en condiciones adecuadas para convertir dicho fibroblasto en un miocito.
(c) una célula endotelial.
así @t1âtrati1Jg el int comestible en.
WO 2018/011805 PCT/IL2017/050790
140
69. El método de la reivindicación 67 o 68, en el que dicho inerlio libre de
semen comprende ácido oleico y un agonista PPAR-gamma.
70. El método de la reivindicación 69, en el que dicha célula endotelial es

una célula endotelial espontáneamente inmortalizada.
71. El método de cualquiera de las reivindicaciones 68-70, en el que dicha

célula endotelial no está modificada genéticamente.
72. El método de la reivindicación 67 o 68, en el que la etapa (a) y la etapa

(b) se efectúan simultáneamente en el mismo sistema de cultivo.
73. El método de la reivindicación 67 o 68, en el que la etapa (a) y la etapa

(b) se efectúan en dos sistemas de cultivo distintos.
74. El método de la reivindicación 68, en el que las etapas (a), (b) y (c) se
efectúan simultáneamente en el mismo sistema de cultivo.

cultivo se realiza en un andamio.

cultivo se realiza en un sistema de perfusión.

cultivo se realiza en un cartucho de fibra hueca comestible.

cultivo se realiza sobre una matriz de origen vegetal.
79. El método de la reivindicación 78, en el que dicha matriz derivada de

vegetales es de la familia de los cereales, de la familia de las leguminosas (Fabaceae) o
de la familia de los pseudocereales.
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80. El método de la reivindicación 79, en el que dicha legumbre es soja o
guisante.

cultivo se realiza en un cultivo en suspensión desprovisto de adherencia al sustrato.
82. Carne comestible obtenida por el método de cualquiera de las

reivindicaciones 67-81.
83. La carne comestible de la reivindicación 82, en forma de hamburguesa

o pepita con una densidad de aproximadamente 200x106 células/gramo.
84. Un método para generar un fibroblasto espontáneamente

inmortalizado, que comprende:
(a) cultivar células de embrión aviar en presencia de un medio que
contenga suero en condiciones de cultivo adherente para obtener así fibroblastos de
embrión de pollo,
(b) pasaje de dichos fibroblastos embrionarios aviares durante al menos
10-12 pasajes en dicho medio que contiene suero en dichas condiciones de
adherencia hasta el colapso del cultivo, en el que dicho colapso del cultivo se
caracteriza por la senescencia y/o muerte de al menos el 90% de dichos fibroblastos
embrionarios aviares,
(c) aislar al menos una colonia que haya sobrevivido a dicho colapso del
cultivo en dicho medio que contiene suero durante al menos 20 pases adicionales,
generando así el fibroblasto espontáneamente inmortalizado.
85. El método de la reivindicación 84, en el que dicho medio que contiene

suero es un medio basado en DMEM/F12.

suero en dicho medio comprende aproximadamente un 15% de suero bovino fetal
(FBS).

embrión de pollo se obtiene de un huevo de pollo de engorde fecundado cultivado
durante 10-12 días.
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88. Un fibroblasto de pollo espontáneamente inmortalizado obtenible por el
método de cualquiera de las reivindicaciones 84-87.
89. El fibroblasto de pollo espontáneamente inmortalizado de la

reivindicación 88, siendo capaz de un pasaje continuo durante al menos 30 pasajes.
90. El fibroblasto de pollo espontáneamente inmortalizado de la

reivindicación 88, capaz de al menos 90 duplicaciones de población.

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Tasa de consumo de oxígeno 2,4 nmol/min/10 células

Las tasas de crecimiento y los parámetros metabólicos se reintroducen en el

Coste de las $50M $30M $5M *

Aunque la invención se ha descrito en conjunción con realizaciones específicas

1. Un sistema para cultivar células, el sistema

2. Un método de cultivo de células, el método

3. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el

4. Un sistema para cultivar células, el sistema

5. Un método de cultivo de células, el método

6. El sistema o método según la reivindicación 1, en el que dichas células

7. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el

8. El sistema o método según la reivindicación 1, en el que dichas células

9. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en el

10. Un sistema para hacer crecer un cultivo celular en suspensión, el

11. Un método para cultivar un cultivo celular en suspensión, que

12. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11,

13. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 10

14. El sistema o método según la reivindicación 13, en el que dicho

15. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 5,

16. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, 8 y

17. El sistema según la reivindicación 1, en el que dicho dializador está

18. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 2-14, en el

19. El sistema según la reivindicación 17, en el que dicha al menos una

20. El sistema o método según la reivindicación 18, en el que dicha al menos

21. El sistema según la reivindicación 1, en el que hay desde

22. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 2-19, en el

23. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en el

24. El sistema o método según la reivindicación 23, en el que dicho circuito

26. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 23-25, en el

27. El sistema según la reivindicación 1, en el que dicha entrega y dicha

28. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 2-26, en el

29. El sistema o método según la reivindicación 1, en el que las células

30. El sistema o método según cualquiera de las reivindicaciones 1-28, en el

31. Un método in vitro para generar una célula adipocitaria a partir de un

32. El método de la reivindicación 31, en el que dicho fibroblasto es un

33. El método de la reivindicación 32, en el que dicha ave se selecciona del

34. El método de la reivindicación 31 o 32, en el que dicho fibroblasto es un

36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 31-35, en el que dicho

37. El método de la reivindicación 36, en el que dicha molécula pequeña se

38. El método de la reivindicación 36, en el que dicha molécula pequeña es

39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 31-38, en el que dicho

40. El método de cualquiera de las reivindicaciones 31-39, en el que dicho

41. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 -40. en el que 'ai'i

42. ", el método de la reivindicación 41, en el que el sustituto de dicha

43. El método de la reivindicación 41, en el que dicho sustituto de dicho EGF

44. El método de la reivindicación 43, en el que dicho agonista del EGF-R

46. El método de la reivindicación 45, en el que dicho agonista sintético es

47. El método de la reivindicación 41. wliert en dicha dexametasona se

48. El método de la reivindicación 41, en el que dicho bFGF esproporcionado

49. El método de la reivindicación 41, en el que dicho EGF se proporciona

50. El método de la reivindicación 41, en el que dicha PGE2 esproporcionada

5I. Un adipocito obtainalale acentuando al inet1io'es de cualquiera de las

53. El método de la reivindicación 52, en el que dicha matriz proteica de

54. El método de la reivindicación 53, en el que dicha matriz proteica de

56. La grasa cultivada de la reivindicación 55, obtenible por el método de

SS. El rnetliod de claiin 57, wherein dijo u}'regu1alion es de dicho inyoDl

59. "El método de la reivindicación *7 o 58, en el que dicho polipéptido mioDl

GO. El método según las reivindicaciones 57 o 55, en el que el polipéptido de

GI. La rnethorl r f reivindicación 57 r r 55, en la que 'ai'i pollo inyr D1

62. "el método de la reivindicación 57 o 58, en el que dicho polipéptido de

63. Un miocito obtenible según los métodos o una minúscula de las