En clases previas habíamos visto qué es y extraído DNA plasmídico de E. coli.

El objetivo
de este tp, es transformar bacterias insertando este mismo DNA plasmídico.

Ahora bien ¿qué es transformar una bacteria?

Las bacterias no tienen reproducción sexual, por lo tanto para generar variabilidad, el
intercambio genético entre individuos (de la misma o distintas especies) se da mediante
mecanismos de transformación, conjugación y transducción.

Transformación: Es la adquisición de DNA desnudo proveniente del medio extracelular.

Para que una bacteria pueda captar DNA desnudo del medio, tiene que estar en un estado
de competencia - un cambio en las propiedades de la membrana y pared celular, que se da
naturalmente, pero lo vamos a generar de manera artificial en el laboratorio (vamos a partir
de bacterias ya competentes preparadas por los docentes) para poder transformarlas con
DNA plasmídico.

Dibujar plásmido
El plásmido a utilizar tiene que tener un origen de replicación y un gen de selección, para
poder diferenciar las bacterias que no tienen el plásmido, de las que sí lo tienen (resistencia
a antibióticos, la capacidad de degradar alguna fuente de carbono en particular, alguna
actividad enzimática que permita distinguirlas por color, como alfa amilasa).

1) incubación en hielo de las bacterias competentes junto con el DNA plasmídico y CaCl 2
(20 minutos).
● El Ca2+ neutraliza las cargas negativas del DNA y de los fosfatos de los fosfolípidos
de la membrana disminuyendo la repulsión, y ayudando a “pegar” los fragmentos de
ADN a las bacterias.
● Las bajas temperaturas disminuyen la fluidez de la membrana.

2) shock térmico a 42°C (90s).

● La combinación de Ca2+ y la alta temperatura genera poros en la membrana de las
células que permiten el ingreso del DNA plasmídico. Para maximizar la eficiencia del
proceso, es importante que el pasaje del tubo del hielo al baño de 42°C sea
inmediato, y generar un "shock térmico".
● El tiempo es estricto para no comprometer la viabilidad de las bacterias, y luego de
este proceso los tubos deben ser llevados a un baño de agua con hielo para que se
enfríen rápidamente.

3) Recuperación con LB sin antibiótico a 37°C (30min).

● Para que las células se estabilicen y comiencen a expresar el gen de resistencia al
antibiótico (beta-lactamasa, degrada a la ampicilina) que se usa para seleccionar.

4) siembra en placas de petri con LB-agar + ampicilina

● Para sembrar primero necesitamos concentrar a nuestras bacterias en un volumen
más pequeño. Para ello vamos a centrifugar a velocidad baja y resuspender el pellet
en medio LB para finalmente tomar 100 ul y sembrar en placas con ampicilina.
● Se deja crecer en una estufa a 37° toda la noche y se recuentan las UFC.

¿Por qué hablamos de selección?

 ● No todas las bacterias sometidas a este proceso van a incorporar el DNA, por lo que
vamos a tener que seleccionar cuales son las que sí lo incorporaron. Para ello el
medio de selección va a tener un antibiótico, ampicilina (cuyo gen de resistencia está
en el plásmido). Las bacterias que no lo incorporen, no van a poder crecer.

Voy a partir de 3 tubos eppendorf con bacterias competentes, uno lo voy a transformar con
agua, otro con dna plasmídico preparado por los docentes y otro con el obtenido en el tp.
Los primeros dos son controles.

¿Para qué me sirven los controles?

Una parte importante del diseño de cualquier experimento consiste en hacer controles que
nos permitan determinar que no hay factores externos que expliquen nuestros resultados.
Son tan pero tan importantes, que si los controles no me dan lo que yo espero que
me den, el experimento no sirve, los datos no serían confiables.

Control de viabilidad: quiero ver si el procedimiento no me mató las células.

● Plaquear células transformadas, después de todo el procedimiento en LB-agar sin
antibiótico (por lo tanto sin que exista una presión de selección), para determinar si
las células son viables (espero ver un césped).

Control negativo: quiero ver si las células no tienen incorporada la resistencia a antibióticos
previo a la transformación.
● Transformamos las células con agua estéril y plaqueamos en un medio con
antibiótico. No esperamos ver placas.

Control positivo: quiero ver si las bacterias pueden ser transformadas, con un plásmido que
conozco y sé que funciona.
● Transformamos células con una masa conocida de un plásmido conocido. Este DNA
ya está testeado, no está degradado, no tiene alta concentración de sales que
dificulten el proceso.
● Por otro lado, conocer la concentración me va a permitir calcular la eficiencia de
transformación de las bacterias que estoy usando, al calcular las UFC/µg.

Si llegamos:
Contamos 200 UFC, luego de transformar con 5µL de ADN con concentración de 2ng/µL.
Son 10ng de ADN en total, por lo que en µg serían 0,01µg de ADN.
Ef=200UFC/0,01µg=2.104UFC/µg

Conociendo la eficiencia de transformación, puedo calcular la concentración de DNA

plasmídico.

Por ejemplo, si cuento 110 colonias:

2.104UFC_______________1 µg
110 UFC______________x=5,5.10-3µg=5,5ng

Cosas que me tengo que acordar antes del TP:

● Siempre recordar rotular cada placa en la base y cada tubo para no mezclar.
 ● Hay que tratar las bacterias con mucho cuidado ya que son muy sensibles, no hay
que golpearlas, hay que pipetear con suavidad para que no se formen burbujas.
● Tenemos que trabajar en condiciones de esterilidad bajo mechero (bajo mechero
NUNCA usamos guantes) y de manera inclinada para minimizar lo que puede caer.

Fallas en los controles:

Si falla el control negativo:
★ Las bacterias ya tenían resistencia a la ampicilina
★ La ampicilina no funcionó
Si falla el control de viabilidad:
★ Si no obtenemos nada, matamos las bacterias.
★ Si obtenemos placas es que nos equivocamos en el medio que usamos, y usamos
un medio con ampicilina.
Si falla el control positivo
★ Las bacterias no eran competentes

Si no obtengo resultados del experimento en si, concluimos que el dna plasmídico que
teníamos no estaban muy buen estado

Otras técnicas de transformación:

● Shock eléctrico de bacterias en agua pura
● Lipofección, un agregado lipídico para favorecer la fusión con la membrana celular.

¿Cómo se prepararon las bacterias competentes? Para obtener el estado de competencia

las bacterias son crecidas en un medio de cultivo (LB líquido), colectadas durante la fase
log, y resuspendidas en una solución de CaCl2 con glicerol (para que no se congelen
cuando son conservadas a -80°C).