Clase aplicaciones biotec.

jueves, 30 de noviembre de 2023 19:00

Tecnología del ADN recombinante en biotecnología animal y vegetal

• Biotec moderna surge alrededor de 1980, permite modificar genéticamente
ratones
○ Ej. Ratones se agrega factor de crecimiento humano: aumenta tamaño
frente a ratón control
○ Ej. Planta: se agrega enzima que produce luz en luciernagas, tenemos
planta luminosa
○ Avanico de posibilidad
Adn recombinante: técnica, en qué se basa? En la introducción de adn en un
organismo.
• Ej. Un gen que codifica para una proteína, anular o reemplazar genes.
• El mecanismo básico siempre son plásmidos (elementos genéticos móviles que
tienen las bacterias, confieren ciertas ventajas, no se mueren sin los plásmidos
pero les conviene tenerlos ej. Resistencia antibiótico).
• Chicos, fáciles de manipular. Se corta, copy-paste, hay enzimas conocidas como
enzimas de restricción (herramienta molecular) cortan adn en secuencias
específicas. Una vez recortado puedo pegar en el medio el que me interesa. Se
pega con la ligasa
• Puedo clonar, al ligar se circulariza con el gen que a mi me interesa
Vectores
• Plásmido como delivery. Usados tan ampliamente que vienen comerciales,
tienen todo lo necesario para poder clonar un gen, transferirlo a un organismo, e
inducir la transcripción de ese gen en ese organismo
• Plásmidos comerciales con componentes
• Desventaja: lleva más tiempo porque hay mas que transcribir. Las que no lo
tienen le ganarían al poder reproducirse más rápido, ganarían en competencia. Si
lo cultivo a la larga pierdo la bacteria transformada, necesito que represente una
ventaja ej. Codificar resistencia a un antibiotico = marcador de selección como a
ampicilina. Sobreviven solo las que tienen el plásmido, presenta una ventaja
sobre el resto en un mismo cultivo (es un tipo de marcador común, hay otros).
Básicamente el marcador asegura que la bacteria que sobrevive tiene el plásmido
• Para que no se pierda el plásmido cuando se duplica la bacteria tiene que tener si
o si (agregar): un origen de replicación. Ahí si se va a copiar a las bacterias hijas.
Sino tengo origen de replicación no va a pasar. Y también para que lo pueda
hacer en eucariotas
• Enz. de restricción son endonucleasas que cortan secuencias específicas del adn,
cantidad muy grande. Se elige con cual de esas enzimas cortar para poder cortar
el plásmido con las mismas y poner el inserto en el plásmido y que la ligasa los
uno. Se conoce como sitio de clonado múltiple (el plásmido tiene secuencias de
reconocimiento para un montón de enzimas de restricción diferentes. Se va a
cortar con algunas). Ahí va a ir mi transgen, el gen que yo quiero estudiar
• Y si yo quisiera expresar mi transgen en eucariotas tengo que agregarle un
promotor fuerte y una cola de poliA.
Enzimas de restricción
• Cortan las 2 hebras en sitios específicos
○ En gral. Son secuencias palindrómicas (se leen igual en un sentido como en
el otro). Actúan como homodímeros
• Pueden cortarlo de 2 formas diferentes: romos (corte lineal o simétrico, no
queda ningun nucleótido desparaeado), borde cohesivo (dejo algunos
nucleótidos simple cadena, que no se aparean)
○ Lo que yo voy a unir tiene que tener la secuencia complementaria
• Son los mecanismos de defensa que tienen las bacterias: restringen el ingreso de
adn foráneo a la bacteria. Cuando ingresa las enzimas lo reconocen y van a ir a
cortarlo ej. El adn de un bacteriófago = lo inactivan
○ Genoma de E.coli: secuencias protegidas para que no vaya y corte su
propio genoma
Detalle del sitio de clonado múltiple (polylinker, donde va a ir el transgen) Que decia de la orientación y el promotor?*
• Se puede elegir la orientación: como es una secuencia palindrómica mi transgen
se puede pegar de formas diferentes. Si yo pongo sitios de restricción diferentes
una enz que me deje bordes largos y otra corto asi voy a elegir como se orienta
Corte y confección del ADN
1. Tengo un plásmido.
2. Corto con una endonucleasa de restricción que surgió como un mecanismo de
defensa en bacterias
3. Se puede insertar el gen que uno quiere y transferir esa construcción a una
bacteria
4. Pongo a la bacteria a sintetizar lo que a mi me interesa (el promotor va a ser
fuerte para que me de mucho mARN y proteína. Obvio que puedo poner uno
débil si a mi no me interesa que se sobreexprese. Al transgen lo pongo rio abajo
del promotor)
Ejemplo: Insulina. Era cara al obtenerse de cerdos, habia que matarlos, despues habia
que purificar. Ahora: agarramos un plásmido, se clona el gen de la insulina, se vuelve a
meter en la bacteria, y produce insulina. Obtengo gran cantidad fácil de purificar sin
matar a los cerdos, rápido y barato.
Clonación
• Se puede clonar un organismo entero más allá de un gen, ej. Vaca y también se
pueden obtener células embrionarias con fines terapéuticos (son no
diferenciadas)
• Ejemplos: arg bastante pionera
○ Vaca pampita que además de ser una vaca clonada es una vaca transgénica
que produce la hormona del crecimiento humana en la leche, que es muy
fácil de purificar después

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 fácil de purificar después
○ Ñandubay Bicentenario caballo se hizo una fusión de varios (7) embriones
tempranos y así aumentó la eficiencia para producir un clon (otro invento
argentino)
Purificación de enzimas
• Producirla en cantidades industriales y antes para purificar necesitaba meses
(precipito, cambio pH, etc). Ahora hay 2 estategias al agregarle un tag
○ Agregarle un tag: colita secuencia que va a permitir luego la purificación de
alguna manera ej. Cromatografía. Partículas chiquitas que tienen en su
superficie esto que me va a permitir aislar la proteína. Corro la mezcla y la
proteína va a quedar agarrada ej. Con anticuerpos. Ahí desp aumento
fuerza iónica o puedo diluir y así en un par de horas la obtengo.
○ Puedo purificar no solo la que quiero sino las que interactuan con con la
misma, es una forma de estudiar cuales estan asociadas (mirar lo del
glutatión se pega porque le agregue el tag)
Bibliotecas genómicas
• Plásmidos donde cada inserto representa una parte del genoma de un
organismo. Una colección
○ Ej. Aislar sistema de transporte: cepa mutante en secreción de proteínas.
En esa mutante ensaye toda una biblioteca hasta que encontre que tenia
un plasmido que complementaba la secrecion. En esa region genomica se
codifica para la secrecion de proteinas. A ese plasmido lo aisle. Tenia una
bacteria que tenia una mutación que le impedía liberar proteínas al medio
extracelular. A esta bacteria le ensaye toda una colección de plásmidos de
una biblioteca genómica y encontre que uno de los plásmidos restauraba la
secreción: ese plásmido codifica para un sistema de transporte que es lo
que yo buscaba. Eso yo lo voy a insertar en su genoma
Doble híbrido de levaduras
• Otra forma de estudiar la interacción entre proteínas
○ Recomponer activador transcripcional cuando mi proteína que quiero
saber con que se une se encuentra con la proteina a la que se une: pescar
proteínas que interactúan entre si. Ahí va a haber transcripción
PCR
• El objetivo es clonar un gen. Para hacerlo en un tubo de ensayo debería agregarle
ADN pol, dNTPs, primer para que funcione ADN pol, magnesio como factor de la
polimersa, helicasa ó aumentar calor para separar las hebras (romper ptes. H)
95°. Después tengo que volver a bajar la temperatura para permitir que se
peguen los primers, sino no empieza la síntesis 55°. Después cambiar a la
temperatura a la que trabaje la ADNpol, humanos 37°. Con cada aumento de
temp tendría* que agregar enzimas porque se desnaturalizan. Se encontró en las
termas una bacteria extremófila que tiene Taqpol que no desnaturaliza a 95°C y
trabaja óptima a 72°C. conservar biodiversidad, entonces hago 95 (separar) - 55
(union primers, se llama annealing) - 72 (funcione enzima). Dentro de un
termociclador en un lapso de horas tengo muchísimas copias. Se aumenta de
manera exponencial en cada ciclo
------------------------------------------------ post recreo
Knock Outs, Knock Ins, OGMs y terapia genética
• 3 maneras de alterar el genoma: Podemos hacer reemplazo de genes, anularlo
(inactivarlo, la clásica es sacarlo otra opción es poner un gen truncado), adición
○ Lo hago en mi plásmido de reconstrucción para modificar al genoma
• Cómo hacemos un org. Modificado genéticamente (OGMs)
○ Tomar cel embrionarias de un animal, transformar las celulas
totipotenciales al hacer la modificacion correspondiente del gen con mi
construcción, seleccionar las celulas que tienen mi construccion (con un
marcador de selección ej. Un antibiótico).
▪ Puedo transferir estas células a un embrión de un ratón ej. Blanco
(transforme la de un ratón marrón) => ratón mosaico (de los 2
colores, voy a tener células de ambos que dan origen a los distintos
tejidos)
▪ Una vez que tengo mis quimeras tengo que tener la suerte de que los
organos sexuales de estas quimeras también sean quimeras
entonces cruzo a dos hermanos y selecciono a los que son todos
marrones (todas sus células están modificadas, justo hay un óvulo y
un espermatozoide marrón)
○ Ej. Knock out veo envejecimiento prematuro, GFP
Edición génica de última generación
• Siempre dependemos del mecanismo de daño y reparación del ADN. Si tengo
suerte repara el daño metiendo el gen que yo quiero. 2 mecanismos de
recombinación homóloga inducida artificialmente
○ Se pega el ADN, sin importar si en el medio hubieron Inserciones o
deleciones. Puedo tener una mutación en un gen pero siempre es mejor
que tener un promosoma* partido
○ Antes de entregar los extremos del ADN digo yo tengo otro alelo y puedo
chequear si la info esta completa, me sobra, o qué pasa. Se lee la secuencia
en el otro alelo y se une corrigiendo el error que haya (ventaja diploides).
Ligasa y toda la maquinaria de reparación. Osea si un alelo se rompió, la
maquinaria puede recurrir al otro alelo para corroborar que es lo que hay
que corregir siendo como un molde
▪ Estoy dependiendo de que el daño ocurra en el gen que yo quiero. Si
en lugar de agregar el otro alelo yo agrego mi plásmido, agregar
reconstrucción que tenga zonas homólogas a los circulitos (ver foto,
en el medio lo que yo quiero) y ahí meto un inserto. Pero seguimos
dependiendo de ver cuándo se rompe justo donde yo quiero el ADN
▪ Aparece CRISPR/Cas9 clustered regularly interspaced short
palyndromic repeats
▪ Mecanismos sensan que estan siendo atacadas, hay enz parecidas a

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 ▪ Mecanismos sensan que estan siendo atacadas, hay enz parecidas a
la de restriccion que cortan adn del bacteriofago pero no queda ahí
que lo cortan y lo inactivan como hacian las enz de restriccion, sino
que este fragmento se va a ir a insertar al adn de la bacteria rio abajo
de sec corta repetitiva palindromica: quedan rastros de la infección
en su adn que se utiliza como mecanismo de defensa.
□ Se transcribe ese mARN y se cliva. Genera fragmentos de
cirsprARN que cada uno va a reconocer una secuencia del
bacteriofago. Cada fragmento con repeticiones palindromicas
se va a montar sobre este arn adpatador que se llama track
rna. Union complejo cas9 de track arn con crARN que cada vez
que entre el bacteriofago lo va a reconocer y lo va a cortar ya
que cas es una endonucleasa. Queda como de memoria.
□ Si yo en vez de usar lo del bacteriofago le pongo algo que yo
quiero tengo una tijera molecular: va a cortar donde yo quiero.
Ya no estamos dependiendo del azar, dirigir. Surgieron muchas
posibilidades.
 Se han hecho otras pero mas caras, ej dedos de zinc que
reconocen especificas para dirigir al gen, ej. Se arma una
endonucleasa con dist dominios de reconocimiento para
terminar armandola, mucho mas caro y rebuscado.
Crispr es barato y rapido, pero su problema es que tiene
muchos offtargets:
◊ Reconoce sec especifica, y la va a cortar, pero
puede haber mismatch y cas9 va a cortar igual
incluso si no es 100%, ej. Se detecto en embriones
modificados
◊ Se logro sacar el gen de HIV del genoma de un
ratón* y se curó
Biotecnología animal animales transgénicos
• Los cerdos salvajes no eran afectados por un virus mientras que los domésticos
si, se les insertó su gen y no tuvieron más esa enfermedad.
• Muchas variantes posibles en la edición del ADN. Trasplantes cerdos a personas
histocompatibles, knock out, ej. Vacas resistentes a tuberculosis, sin cuernos,
cerdos y perros más masa muscular
○ Alimentos: más masa muscular, resistir enfermedades
○ Trasplantes
○ Fines ornamentales: peces que brillan
○ Fármacos:
○ Patiologías humanas
• Salmones uno con hormona de crecimiento humana vs uno sin, aumenta mas del
doble en el mismo tiempo
• Capacidad de producción de proteínas recombinantes en la leche de dist
especies
○ Ej. Factor 9 darle a una cantidad grande de la población, coagulación
Terapia génica
• Se usan virus: caso. No maduraban los linfocitos T. se extrajeron sus linfocitos y
fuera del organismo se modificaron y se volvieron a inyectar en el paciente
"exvivo"
Plantas transgénicas
• Genoma muy complejo, muy compleja modificación. 2 técnicas
○ Bombardeo génico. En los meristemas hay células no diferenciadas, se
termina absorbiendo dentro de la planta
○ Agrobacterium tumefaciens es una bacteria que provoca recombinación
en el genoma. Tiene plásmido "ti" que se inserta en el genoma. La región
en la que se inserta naturalmente tiene la síntesis de azúcares que
normalmente le gusta consumir, lo inyecta y obtiene comida.
▪ Región de virulencia: sist. De transporte por donde pasa ADN. En
este caso codifica para la maquinaria de transferencia del ADN
(origen de replicación, etc.) y me sirve la región T, pero podría usar 2
plásmidos.
▪ Región t: dos bordes con genes de producción de hormonas y de
azúcares, y sintesís de opinas
▪ Se transfiere y se inserta en el genoma. Si nosotros le sacamos esos y
le ponemos genes que nos interesen vamos a tener una planta
transgénica.
▪ Del tallo formado con cel no diferenciadas selecciono las que tienen
mis genes, a partir de ahí puedo regenerar una planta completa
(desdiferenciadas!!)
• Transformación de cloroplastos: fácil de dispersar ej. Polen. Estrategia es
transformar cloroplastos, si en el óvulo pero no espera (polen). Forma de evitar
la dispersión de las mutaciones en el ambiente. Hay que tener en cuenta que es
un genoma bacteriano, voy a tener que usar shine dalgrano, etc.
Alimentos funcionales
Beta caroteno importante para la vision en el retinal ej maiz transgenico
Café descafeinado

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