MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DEL LABORATORIO DE TERAPIA GÉNICA

Transformación genética de Escherichia coli DH5α

CONFIDENCIAL

Transformación genética de Escherichia coli DH5α

INTRODUCCIÓN

La transformación fue el primer proceso de transferencia genética que se describió en

los procariotas. La transformación es el mecanismo por el cual ciertas bacterias, son
capaces de incorporar DNA exógeno proveniente de otras bacterias, o que está libre
en el medio. A la capacidad de las bacterias para conservarlo en forma estable e
interaccionar con él, se le denomina competencia, fenómeno que depende de la
presencia de un sistema de captación de DNA específico asociado a la membrana.
Algunas bacterias con competencia natural son Haemophilus influenza, Neisseria sp.,
Streptococcus pneumoniae y ciertas especies de Bacillus. Es importante mencionar que
la mayoría de las bacterias no presentan competencia natural, sin embargo, es posible
inducir en el laboratorio la competencia, lo cual se logra generando distorsiones o
cambios en la membrana celular, por ejemplo con pulsos eléctricos (electroporación) o
con cambios osmóticos y térmicos. Estos procedimientos son muy usados para
introducir experimentalmente DNA exógeno en una bacteria, por ejemplo un
plásmido, y así transformarla para que adquiera un fenotipo de interés.

OBJETIVO

 Conocer, comprender y aplicar el método de transformación genética.

MATERIAL

Cepa

 Cultivo en placa o tubo de Escherichia coli DH5α.

Medios de cultivo y soluciones

 Medio Luria líquido sin antibiótico

o Bacto tiptona o peptona de caseína 10.0 g
o NaCl 10.0 g
o Extracto de levadura 5.0 g
o NaOH 2M 2.0 mL
o Agua destilada c.b.p 1000 mL
Esterilizar por autoclave.

 Medio Luria sólido sin antibiótico

o A los componentes del medio Luria líquido agregar 15.0 g de Agar- agar
por cada 1000 mL de medio Luria líquido preparado.
Esterilizar por autoclave.

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 Medio Luria líquido y sólido con antibiótico

o Se prepara el medio de cultivo y se esteriliza por autoclave. Enfriar el
medio de cultivo y agregar (en cuestiones de esterilidad) el antibiótico
en las siguientes concentraciones:
 Ampicilina: 50 mg/L
 Kanamicina: 60 mg/L

 CaCl2 0.1 M.
Esterilizar por autoclave.

 DNA plasmídico
o pSV-β-Gal (resistencia a ampicilina)
o pIRES-2-EGFP (resistencia a kanamicina)
o pPEPCK-hGH (resistencia a ampicilina)

Insumos de laboratorio y equipo

 Asa bacteriológica
 Tubos de 18 x 150 mm con tapón metálico estériles
 Matraz Erlenmeyer estéril
 Tubo cónico de 50 mL estéril
 Probeta de 100 mL estéril
 Puntas para micropipeta estériles de 100 y 1000 µL
 Microtubos de 1.5 mL estériles
 Cajas Petri estériles (con medio Luria sólido con y sin antibiótico)
 Pipetas de vidrio estériles

 Micropipetas
 Incubadora de 37°C
 Baño maría con agitación
 Centrifuga Sorval
 Termoblock a 42°C
 Microcentrífuga Thermo

PROCEDIMIENTO

Preinóculo

1. Inocular la bacteria de interés en 3 mL de medio Luria líquido sin antibiótico.

2. Incubar 12 h a 370C.

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Células competentes

1. Colocar todo el preinóculo en 30 mL de medio Luria líquido sin antibiótico.

2. Incubar a 370C hasta alcanzar 45 unidades klett (~4-5 h).
3. Centrifugar a 4000 g por 10 min y desechar sobrenadante.
4. Resuspender las células en 15mL de solución CaCl2 0.1 M.
5. Incubar 20 min a 40C
6. Centrifugar a 2000 g por 5 min y eliminar el sobrenadante.
7. Resuspender el paquete celular en 2mL de solución de CaCl2 0.1 M.
8. Proseguir con el proceso de transformación, de lo contrario se pueden guardar
24 h a 40C.

Transformación genética

1. Tomar 200 µL de las células competentes en CaCl2 0.1 M.

2. Adicionar 1 µg de DNA plasmídico diluido en un volumen final de 100µL de
CaCl2 0.1 M.
3. Incubar 40 min en hielo o a 4°C.
4. Dar pulso térmico a 42oC durante 90 seg.
5. Dejar reposar a temperatura ambiente 10 min.
6. Adicionar 1 mL de medio Luria líquido lentamente.
7. Dejar reposar 10 min a 370C.
8. Centrifugar a 4000 g por 5 min y eliminar sobrenadante.
9. Resuspender el paquete celular en 200 µL de medio Luria líquido.
10. Sembrar con espátula una alícuota en cajas Petri con medio Luria sólido con y
sin antibiótico.
11. Incubar 24 h a 370C.
12. Analizar presencia de transformantes.

REFERENCIAS

 L. Betancor, M. Gadea, K. Flores “Genética microbiana”.

http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/GeneticaBacteriana.pdf

 Recombinación. Transformación
http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/17transforma.htm#_Toc64553420

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