PRACTICA 9.

EXTRACCIÓN CASERA DEL ADN

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 PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

LICENCIATURA DE MÉDICO CIRUJANO

DRA. EN C. CLAUDIA CERVANTES REBOLLEDO

PRÁCTICA NO. 9: EXTRACCIÓN CASERA DEL ÁCIDO

DESOXIRRIBONUCLEICO

OBJETIVOS:
 Aplicar una técnica sencilla para obtener ADN de células vegetales.
 Comprender el proceso necesario para la extracción del ADN.

INTRODUCCIÓN:

Las células eucariotas presentan un contenido en ADN mucho mayor que las células
procariotas. Las moléculas de DNA en eucariotas se combinan con proteínas y se
organizan en fibras de cromatina en el núcleo.

Las principales funciones del DNA son:

- Almacenar la información genética completa, necesaria para determinar la
estructura de todas las proteínas y RNAs de cada especie.
- Programar en el tiempo y espacio ordenadamente la biosíntesis de las células y
los componentes de los tejidos.
- Determinar las actividades de un organismo a través de su ciclo de vida.
- Determinar la individualidad de un organismo dado.

Hay diferentes técnicas que permiten obtener al ADN con alto grado de pureza. Las más
utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugación en gradientes de CaCl o una
cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio no
necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas (laboriosas y/o caras)
en los protocolos de purificación.

Las etapas del procedimiento que se realizan son las siguientes:

• Desintegración del tejido y solubilización y homogenización de los componentes

celulares.
• Precipitación de los ácidos nucleicos y disolución en un buffer adecuado.

- Homogenización de la muestra: El método para desintegrar el tejido debe estar

adaptado a las características de éste. Para grandes volúmenes de tejidos blandos,
suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domésticas. Para
volúmenes menores, en general es suficiente un homogeneizador, el cual consiste en un
tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistón (de vidrio o de teflón). La rotación del pistón
dentro del tubo (propulsión manual o por un motor), disgrega la muestra. Tejidos más

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resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos mecánicos

especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por
ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de
los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y,
manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de desintegrar la
muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento,
con lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el material
de interés.

Como puede deducirse de los párrafos anteriores, se han descrito diversos métodos
particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de células
bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradación de la
pared celular. Para facilitar a la solubilización de los componentes celulares, y a la ruptura
de membranas y complejos proteicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico
(dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las
membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis contiene además el agente
quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas
(dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las
ribonucleasas. Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra,
así como en otros pasos siguientes de la purificación de ácidos nucleicos, las moléculas
de gran tamaño (como por ejemplo las moléculas de ADN genómico presentes en los
cromosomas, cuyo tamaño es del orden de millones de pares de bases) es fragmentado
mecánicamente en forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamaño mucho
menor (típicamente entre 20 y 200 kb). El grado de fragmentación dependerá,
obviamente, de los métodos utilizados para la homogeneización y purificación. Los
métodos más vigorosos por lo general permiten mayores rendimientos, al maximizar el
número de células lisadas, pero por la misma razón llevan a una mayor fragmentación del
ADN.

Los ácidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de sus
grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro
orgánico no polar, los ácidos nucleicos tenderán a permanecer en la fase acuosa, en tanto
que los lípidos y gran parte de las proteínas desnaturalizadas se encontrarán en la fase
orgánica.
En la preparación de ácidos nucleicos, los solventes que se usan más frecuentemente
para la extracción de proteínas y lípidos son el fenol y el cloroformo.

La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa

en la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales), y
deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol
o isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible
(mediante la disolución en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la
desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los
mismos.

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MATERIALES

- Material vegetal, preferiblemente fresas, kiwi o espinaca

- 1 mortero
- Bisturí o cuchillo
- Recipiente pequeño para picar
- Baño de María (37ºC)
- Ablandador de carne
- Algodón
- 1 probeta de 100 ml o taza para medir.
- 5 vasos de precipitados de 100 mL
- 1 vasos de precipitados de 200 mL
- Tubo de ensayo de 13 X100
- Gradilla para tubos de 13 X 100
- Agua destilada
- Detergente lavaplatos
- Cloruro de sodio (NaCl)
- Papel de filtro
- Embudo
- Etanol o alcohol isopropílico con una concentración mayor a 70%, frío (5ºC).
- Varilla de vidrio
- Pipeta de 5 mL
- Perilla

METODO:

Paso 1: preparación de solución salina-jabonosa.

Prepara una solución salina-jabonosa compuesta con 100 ml de agua destilada, 10 ml de

detergente lavaplatos y 13 gr de NaCl.

Paso 2: preparación de las frutas.

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Las frutas deben estar sin cascara, sin tallos y lavadas. Se cortarán en cubos pequeños y
se triturarán en un mortero.

Paso 3: adición de la solución de sal y detergente a la fruta.

En el mortero con la fruta triturada vertemos la solución salina-jabonosa y continuamos el

proceso de romper las frutas. El macerado se coloca en un vaso de precipitado se le
agrega un poco de ablandador de carne e incubar en un baño de María a 37ºC durante 15
minutos para facilitar la extracción.

Paso 4: separación del material sólido, proteínas y lípidos.

Colocamos el papel de filtro sobre un embudo y se filtra el macerado para retirar el grueso
de la sopa de fruta y luego, a través del algodón, hasta obtener 5 ml del líquido filtrado en
un tubo de ensayo.

El jugo de fruta salado-jabonoso se cuela y se filtra para quitarle los sólidos, proteínas y
lípidos a la solución acuosa del ADN.

Paso 5: precipitación del ADN por acción del alcohol.

Sobre el jugo de fruta, vertemos lentamente por las paredes del tubo de ensayo etanol o
isopropanol frío. Dejamos reposar unos minutos. Debe aparecer una capa blanquecina
gelatinosa.

Si introducimos una varilla de vidrio o un palito de madera, con movimientos circulares

podremos recuperar el ADN enrollado en la varilla.

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es la importancia de la manipulación genética en la medicina?

En medicina podemos decir que la manipulación genética es de gran importancia ya que podemos
conocer y modificar la información genética de un ser vivo. Principalmente en el área médica nos
es de gran ayuda para diagnosticar y predecir enfermedades; como cáncer, así mismo para
generar terapias y tratamientos, para la producción de medicamentos, vacunas, hormonas y
proteínas. Es importante reconocer que existe una gran variedad de técnicas de manipulación
genéticas, con ayuda de estas podemos obtener detección de enfermedades genéticas, mapeos
de genoma, pruebas de paternidad, pruebas forenses o criminalísticas y filiación humana.
2. ¿Qué importancia tiene la obtención de material genético con una gran pureza?
La obtención de DNA en buena cantidad y alta pureza es de suma importancia en la amplificación
por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para su aplicación en estudios de
identificación y filiación genética.

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3. ¿Cuál es la constitución de los ácidos nucleicos y la diferencia entre ellos?

Los ácidos nucleicos constituyen el material genético de los organismos y son necesarios para el
almacenamiento y la expresión de la información genética. Existen dos tipos de ácidos nucleicos
química y estructuralmente distintos: el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico
(ARN); ambos se encuentran en todas las células procariotas, eucariotas y virus. El ADN funciona
como el almacén de la información genética y se localiza en los cromosomas del núcleo, las
mitocondrias y los cloroplastos de las células eucariotas. En las células procariotas el ADN se
encuentra en su único cromosoma y, de manera extracromosómica, en forma de plásmidos. El
ARN interviene en la transferencia de la información contenida en el ADN hacia los
compartimientos celulares. Se encuentra en el núcleo, el citoplasma, la matriz mitocondrial y el
estroma de cloroplastos de células eucariotas y en el citosol de células procariotas.

Composición de los ácidos nucleicos

La unidad básica de los ácidos
nucleicos es el nucleótido, una
molécula orgánica compuesta por
tres componentes:
Base nitrogenada, una purina o
pirimidina.
Pentosa, una ribosa o
desoxirribosa según el ácido
nucleico.
Grupo fosfato, causante de las
cargas negativas de los ácidos
nucleicos y que le brinda características ácidas

4. Explica la función que tiene el detergente, NaCl y el etanol en la extracción delADN:

El detergente disuelve las grasas o lípidos, que es el componente principal de la membrana
plasmática y nuclear de las células (es el mismo principio por el que el gel limpia la grasa de
nuestra piel). Al romperse las membranas celulares se permite la salida del ADN al exterior.
NaCl en la solución de extracción: La molécula de DNA es soluble en agua y por tanto invisible,
pero si se pone en contacto DNA que haya estado en un medio salado y alcohol frío el DNA se
vuelve insoluble y precipita. Por lo tanto el agua salada ayuda a la precipitación en el alcohol.

5. ¿Cuál es la diferencia entre la electroforesis en agarosa o poliacrilamida para los ácidos

nucleicos?
Los geles de agarosa tienen un poder de resolución mucho menor que los de poliacrilamida,
porque no permiten separar moléculas de ADN que difieren en tamaño menos de unas 50 pb.

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Conclusión:
Al realizar el procedimiento correctamente paso a paso para la extracción del ADN vegetal; desde
picar y moler finamente nuestros vegetales, preparar nuestra solución de agua, detergente líquido
y ablandador de carnes, hasta purificar nuestra muestra con el papel filtro y algodón y por ultimo
agregarle el alcohol, pudimos observar al manipularon poco con un palillo de madera unos finos
filamentos de material genético.

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:
 C. ALONSO BEDATE, Biologia Moleci~lar y Trasferencia del ADN, en Labor Hospitalaria, 21 (1989),
págs. 255-260; E. BROVEDANI, Le applicazioni dell'lngegrzeria Generica. Dalla Biotecnologia alla
Terapia Genica Umana, en "Aggiornamenti sociali" 37 (1986) págs. 605-619.
 PRESIDENT'S COMMISSION FOR THE STUDY OF ETHICAL PROBLEMS ON MEDICINE AND
BIOMEDICAL AND BEHAVIORAL RESEARCH, Splicing Life: A Report on the Social and Ethical
Issues of Genetic Engineering with H~~man Beings, Washington 1982.
 ACIDOS NUCLEICOS [Internet]. ACCESSMEDICINA. 2020 [citado 2 abril 2022]. Disponible en:
https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1473&sectionid=102742479#1118678
473.
 EXTRACCION DE ADN [Internet]. SCIELO. 2019 [citado 2 abril 2022]. Disponible en:
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-893X2019000100058.

MECANISMO DE EVALUACIÓN:

EVALUACIÓN DE LA PRACTICA

Rubro Porcentaje Obtenido

Desempeño en la práctica 30 %

Reporte de la práctica 50 %

Cuestionario de la práctica 20 %

Porcentaje total 100 %