Genética Bacteriana

Gloria Levicán
2009
Desarrollo de mutantes resistentes a antibióticos dentro de la zona de inhibición.

Mutantes
 MUTACIONES
• Cambios heredables en la secuencia
nucleotídica del DNA
• Dan cuenta de la evolución
 TIPOS DE MUTACIONES Y
SUS EFECTOS
• Genotipo
• Fenotipo

• Las mutaciones cambian el genotipo y no

necesariamente se reflejan en el fenotipo
Los cambios heredables del DNA se pueden originar por:

- Mutaciones (cambios puntuales)

- Pérdida / adquisición de genes

 MUTACIÓN PUNTUAL
• cambio de una base
• cambia un codón en el mRNA
• puede o no cambiar el aminoácido en la
proteína
Mutaciones puntuales: Posibilidades
Tyrosine
Inserciones o deleciones generan un cambio de fase en el gen (Desfase).
 Dos tipos de mutaciones
• No seleccionable: Ej. pérdida de color en una cepa
pigmentada
– no tienen ventajas ni desventajas frente a la cepa
silvestre
– estas cepas se deben detectar analizando grandes
poblaciones (screening)
• Seleccionable: Ej. resistencia a un antibiótico
– la mutación le confiere cierta ventaja bajo condiciones
específicas, de modo que el crecimiento de la mutante
en esas condiciones es mejor que el de la cepa silvestre
– estas cepas se detectan por selección
 Mutantes nutricionales
• Mutantes que requieren aminoácidos o factores de crecimiento:
se enriquecen mediante el método de selección con penicilina,
es un método de selección negativa o contra-selección

• se detectan por réplica en placa

• auxótrofo
• protótrofo
Selección de mutantes auxótrofos
 Mutantes nutricionales

+ leucina - leucina
Las mutaciones pueden revertir y el fenotipo silvestre puede restaurarse

Revertiente: cepa en la que se restaura el fenotipo silvestre

1. Revertiente verdaderas:

2. Revertientes supresoras:
Ej. Recuperación del marco de lectura en el gen
 MUTACIONES ESPONTÁNEAS
• Son eventos al azar, no se puede predecir cuándo
ocurrirán ni qué genes afectará
• Ocurren con una frecuencia de 10-7 a 10-11, por par
de bases durante un ciclo replicativo
• Un gen típico de 1000 bases tiene una frecuencia
de mutación de 10-4 a 10-8 por generación
• En un cultivo con 108 células por mL habrá un
número de mutantes por cada mL de cultivo
• Mutaciones sin sentido: 10-6 a 10-8
 MUTACIONES INDUCIDAS
• Producidas por agentes mutágenos que
aumentan la velocidad de mutación
• Los mutágenos químicos actúan a nivel
molecular y pueden ser:
– análogos de bases:
– agentes alquilantes:
– agentes deaminantes
– derivados de acridina
 Sustituciones AT a GC

Complementa con G

Sustituciones AT a GC

Complementa con C
 Radiación como mutágeno
• Ultravioleta:
– Afecta sólo la piel por su baja energía de penetración, pero
tiene un gran efecto sobre los microorganismos.
– Produce dímeros de 2 pirimidinas adyacentes, 2T, 2C 1T1C.
Se produce un espacio que no se aparea con la hebra
complementaria, deteniéndose la transcripción
• Rayos X y γ :
– tienen más energía, rompen fácilmente enlaces químicos,
produciendo radicales libres que pueden atacar el DNA
 Generación de dímeros de timina por la radiación UV

El efecto de la luz UV puede ser aprovechado para la obtención de mutantes

en el laboratorio.
 Reparación del DNA dañado
• Fotoreactivación:
– se reparan los dímeros. La enzima se activa
con la luz.
• Reparación en la oscuridad:
– una endonucleasa corta el DNA dañado
– la DNA pol sintetiza el DNA nuevo
– una exonucleasa remueve el segmento dañado
– una ligasa los une
Mecanismos de respuesta SOS
 Estudio de las mutaciones

• Espontáneo o inducido por un compuesto?

 Test de fluctuación
• Diseñado por Salvador
Luria y Max Delbruck
en 1943 (Luria and
Delbruck. 1943.
Genetics 28: 491-511)

Usaron E. coli que se hacía

resistente al fago T1
 Test de fluctuación
• Hipótesis primaria: si las mutaciones que
confieren resistencia ocurren
espontáneamente y al azar, se esperaría
encontrar una gran fluctuación en el
número de m.o. resistentes por cultivo entre
un gran número de cultivos. Esto debería
ocurrir sin importar la presencia de la
sustancia a la cual se hacen resistentes
 Test de fluctuación

• Hipótesis secundaria: Mutaciones que

confieren resistencia ocurren solo en la
presencia de la sustancia. De modo que
los cultivos con la sustancia tendrían un
número igual de m.o. resistentes, mientras
los cultivos sin la sustancia no tendrían
m.o. resistentes
TÉCNICA DE PLAQUEO EN RÉPLICA

• Diseñado por Joshua y Esther

Lederberg en 1952
• el m.o. se crece en un tubo en
medio líquido
• se siembra en muchas placas, se
incuban 4 a 5 h
• se realizan réplicas en una placa
que contiene penicilina
• aparecen colonias resistentes sin
haber estado expuestas
previamente al antibiótico
Test de Ames: Para evaluar la mutagenicidad de un compuesto

Filtro sin el compuesto (control -)

Filtro con el compuesto

 Diseño típico del Test de Ames

Usualmente se usan cepas de Salmonella auxótrofas de histinas o E. coli auxótrofa de triptófano.

Otras fuentes de variabilidad genética: Transferencia lateral de genes

1. Transformación

2. Transducción

3. Conjugación
TRANSFORMACIÓN

El DNA libre se incorpora en una

célula receptora, lo que lleva a un
cambio genético
Transformación genética: es la adquisición de un trozo de DNA desde el ambiente
Captación del DNA durante la transformación en una bacteria Gram positiva
• La recombinación homóloga ocurre después de
la transferencia, es decir, cuando el DNA de la
célula dadora está dentro de la célula receptora
• Si no se produce recombinación, se pierde el
fragmento, porque no puede replicarse
independientemente
• La detección del intercambio físico de
segmentos de DNA se puede hacer sólo si las
células tienen fenotipos distintos.
La transformación genética puede ser demostrada experimentalmente.
• Muchas bacterias son transformables en forma
natural, tanto Gram + como Gram – e incluso
Archae. Pero sólo algunas cepas dentro de esos
grupos.
• Azotobacter, Bacillus, Streptococcus,
Haemophilus, Neisseria, Thermus
• El DNA cuando se libera se fragmenta en trozos
de 15 kb
• Un gen tiene aprox. 1000 bases, por lo que
teóricamente un fragmento tendría 15 genes
• Para que una célula acepte un DNA debe estar en
un estado de competencia
• Células que son naturalmente
transformables tienen una regulación del
estado de competencia
• Proteínas de membrana de unión de DNA,
autolisinas de pared, nucleasas
 Bacillus subtilis
• las proteínas relacionadas con la competencia son parte
de un sistema de “quorum sensing”, sistema que
responde al número de células presente
• las células producen y excretan un pequeño péptido
durante el crecimiento y se hacen competentes a altas
concentraciones del péptido
• actúa ComP, una kinasa sensora, y ComA, una proteína
reguladora de la respuesta
• ComA es una proteína activadora que regula varios
genes que afectan la transformación
• cerca del 20% de las células se hacen competentes y
permanecen en ese estado por varias horas
• Bacillus acepta DNA de una hebra
 Streptococcus pneumoniae
• Streptococcus se hacen competentes el 100% de las células
• Streptococcus acepta DNA de una hebra
• cada célula de Streptococcus une 10 moléculas de DNA
bacteriano de 15.000 – 20.000 pb c/u. A medida que van
entrando se convierten en moléculas de una hebra de 8.000 bases
• El DNA transformante es unido en la superficie celular por una
proteína de unión al DNA y el fragmento de 2 hebras es captado
por la célula por una nucleasa la que degrada una cadena y la otra
es incorporada
• Una vez dentro, el DNA se asocia a proteínas específicas de
competencia que lo protegen de las nucleasas. Cuando llega al
cromosoma, estas proteínas son sustituidas por la proteína RecA
• El DNA se integra al cromosoma mediante procesos de
recombinación
 Haemophilus influenzae
• sólo acepta DNA de doble hebra
• el DNA debe tener una secuencia de 11 pb
que se encuentra con una alta frecuencia en
el cromosoma de Haemophilus, por lo tanto
acepta DNA homólogo
Transformación artificial
 Transformación artificial
• E. coli
• consiste en tratar las células con altas
concentraciones de iones Ca y mantenerla en frío
• bajo rendimiento para DNA cromosómico lineal
• alto rendimiento para DNA plasmidial
• el tratamiento con Ca también funciona con otras
bacterias G-
 Electroporación
• se exponen las membranas a campos
eléctricos pulsantes formando pequeños
poros
• el DNA presente puede entrar por los poros
• pulsos de milisegundos (fuente de energía
sofisticada = electroporador)
• permite la entrada como también la salida
de DNA
 Características de la transformación

• el DNA se encuentra en solución

• los fragmentos compiten entre sí, por lo que es
saturable
• la frecuencia máxima de transformación es de un
20% de la población
• los valores normales van desde 0,1 a 1,0%
• concentración mínima de DNA es 0,00001 g/mL
ó 1x10-5 g/mL ó 1x10-2 µ g/mL ó 10 ng/mL