LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Informe de Laboratorio Práctica #3 y #4

Título (Informativo, atractivo, conciso y diferente al de la guía. Debe describir

lo más relevante del trabajo)

Nombres: Maria Fernanda Lopez Taborda, Tatiana Zuluaga Vargas

Resumen: en el presente informe se evaluaron dos prácticas, para la primera práctica

el objetivo principal de ambas prácticas es la medición de la actividad catalítica de la
enzima, esta es necesaria debido a que esta nos permite apreciar cuál es el óptimo
funcionamiento de la enzima lo anterior se puede apreciar analizando qué tan
dependiente es la reacción de una enzima a las condiciones del medio en el que se
encuentra, para analizar lo antes dicho fue necesario determinar el efecto del pH
sobre la actividad de la enzima, determinando la actividad (%Reacción) usando
diferentes pH en una muestra de amilasa salival; También se determinó el efecto de
la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática, por medio de diluciones a
la muestra de amilasa salival evaluando su papel en la hidrólisis de la amilosa; Y por
último el efecto de la temperatura en la actividad enzimática, evaluando la actividad
de esta a 4 diferentes temperaturas. Para la segunda práctica se busca evaluar la
actividad de la tirosinasa observando la oxidación de alimentos (manzana, papa y
banano) midiendo el color marrón formado al final de la reacción por la melanina, y
así, determinar su intensidad con el fotocolorímetro. Se inicia con una prueba en
donde se utiliza un extracto enzimático de la fruta y se mezcla con los reactivos, se
lleva al fotocolorímetro donde se toma la absorbancia cada minuto desde el minuto 0
hasta el 8. Como segunda prueba, se utiliza nuevamente el extracto pero esta vez es
llevado al baño maría durante 5 minutos, se deja enfriar y se lleva al fotocolorímetro
donde se toman nuevamente las 8 medidas. La última prueba se realiza adicionando
al extracto un inhibidor para ver como se contrarresta el efecto de óxido provocado
en la fruta, es llevado al fotocolorímetro donde se toman los datos durante 8 minutos.
Como resultados se evidencia cómo al modificar la temperatura y/o agregar un
inhibidor afecta la formación de melanina haciendo la reacción considerablemente
mucho más lenta que la reacción con factores normales de temperatura ambiente y
sin inhibidor.

Palabras clave: 4-6 palabras que muestren lo fundamental del informe, sin
definirlas.

1. Introducción
Las enzimas constituyen uno de los grupos más importante en las proteínas, tienen gran variedad
de tamaños y son reconocidas por ser catalizadores biológicos, altamente específicos en su
accionar. Un catalizador por naturaleza, es aquella sustancia que aumenta la velocidad de
reacción en una reacción química, sin verse alterada ella misma en el proceso global (Mathews et
al., 2002), es decir, no se ven afectadas las constantes de equilibrio, por lo que no puede generar
cambios químicos desfavorables (McMurry, 2008). La sustancia sobre la que actúa la enzima se
llama sustrato, algunos de estos catalizadores son específicos para un solo sustrato o para un
rango de ellos. Cabe aclarar que el uso y la elección de catalizadores depende del medio en el
que se encuentre la reacción química de interés. Según la reacción que catalizan, las enzimas
pueden clasificarse en: oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas.

En las enzimas esta capacidad de catalizar viene determinada por la estructura o conformación
que está presente, ya que si la estructura se ve afectada la enzima podría afectar o perder el
funcionamiento catalítico. El hecho de que la mayoría de las enzimas pertenezcan al grupo de las
proteínas implica que se vean afectadas por diferentes factores como la temperatura, el pH , la
presencia de moduladores alostéricos o no alostéricos y de coenzimas y cofactores. Esto implica
que pueden ser reguladas por las condiciones particulares del microambiente celular y que su
actividad se modifique al variar los parámetros que cambian su estructura (Blanco y Blanco,
2017) .

El modelo de Michaelis-Menten es el que describe el comportamiento cinético de las reacciones

canalizadas en términos de la velocidad de la reacción y la concentración de sustrato presente
(Litwack, 2017). Bajo este comportamiento la actividad de la enzima, que depende de la
velocidad máxima de la misma, cambia rápidamente con aumentos en la concentración de
sustrato. Además también puede hallarse un valor de Km (Constante de Michaelis) que se ve
afectada por el pH y la temperatura, como se ha discutido antes y que es útil para comparar
distintas condiciones en las que puede ser catalizada una reacción enzimática. Usualmente la
actividad de una enzima se puede estimar, al medir la cantidad de producto que se forma o del
sustrato que es consumido. Se pueden dar valores de esta actividad, teniendo en cuenta dicha tasa
de formación respecto al tiempo y la cantidad de enzima usada, bajo un grupo de condiciones
específicas. (Blanco y Blanco, 2017).
Dentro del amplio grupo de enzimas reguladas y que son fundamentales a escala fisiológica se
encuentran las amilasas. Estas pertenecen a la clase de las hidrolasas y se les clasifica
específicamente como endo-alfa-1,4-d-glucanohidrolasas, esto implica que el rompimiento se da
sobre enlaces glicosídicos alfa 1-4, para generar glucosa y maltosa (Smith y Morton, 2011). En
humanos, se produce y almacena en las glándulas salivares y el páncreas (Kiba, 2005). En el
proceso de digestión es la que comienza con la degradación de polisacáridos, aunque se ve
eventualmente inactiva por el pH bajo del estómago. Aún así, su presencia no se limita a los
mamíferos y suele encontrarse en una amplia variedad de bacterias y hongos, en las que se ha
podido encontrar aplicación biotecnológica en industrias de detergentes, textiles, procesos
fermentativos y de salud (Nadaroglu y Polat, 2022).

La otra enzima de interés para este estudio es la tirosinasa, una metaloenzima que está distribuida
ampliamente en organismos superiores y microorganismos (Nunes y Vogel, 2018). Esta enzima,
pertenece al grupo de las monoxigenasas que contienen cobre y a escala fisiológica, son
importantes en la biosíntesis de melanina, un pigmento que protege la piel de la radiación
ultravioleta y otras fuentes de estrés oxidativo (Soulange et al., 2020). La catálisis de estas
enzimas se da en reacciones que oxidan compuestos difenólicos o monofenólicos a sus
correspondientes quinonas con la reducción simultánea de oxígeno molecular a agua (Nunes y
Vogel, 2018). En vegetales y frutas, la presencia de esta enzima es de especial interés, pues está
asociada al fenómeno de pardeamiento enzimático por la oxidación de los compuestos fenólicos
presentes en los frutos (Jiang et al., 2016). Por esto último, se han buscado compuestos con
capacidad inhibitoria como compuestos fenólicos, inhibidores no específicos del tipo ácido-base,
sustratos suicidas, removedores de sustrato y agentes reductores, como el ácido ascórbico
(Chang, 2009).

En el siguiente informe se evaluaron diferentes aspectos de las 2 enzimas mencionadas

anteriormente. Primero se determinó la dependencia de la reacción enzimática de la amilasa
salival con respecto a la acidez del medio, la temperatura y concentración de la enzima. Se
extrajo la enzima tirosinasa de diferentes fuentes: banano, manzana y papa, para determinar su
actividad, usando como sustrato L-DOPA, y compararla en diferentes fuentes y bajo diferentes
condiciones: calentamiento y en presencia de un inhibidor (ácido ascórbico).

2. Materiales y métodos
Figura 1. Flujograma de la metodología para la determinación de la actividad catalítica de la
enzima amilasa.
Figura 2. Flujograma de la metodología para la determinación de la actividad catalítica de la
enzima tirosinasa.
3. Resultados y Discusión
ACTIVIDAD CATALÍTICA DE LA AMILASA SALIVAL
En la evaluación de la enzima amilasa donde se varió pH, % de la enzima y temperatura para
observar su acción, se obtuvieron los siguientes resultados:

Figura 3. Fotografía de la coloración con cambio en el pH.

Tubo pH % Intensidad % Reacción

1 3.0 99% 1%
2 4.0 98% 2%
3 5.0 50% 50%
4 7.5 25% 75%
5 9.0 10% 90%
6 10 2% 98%
7 11 1% 99%
8 7.5 100% 0%
Tabla 1. Actividad catalítica de la amilasa a cambios de pH.

Tubo % Saliva % Intensidad % Reacción

1 50 0% 100%
2 25 13% 87%
3 12.5 21% 79%
4 6.2 26% 74%
5 3.1 100% 25%
6 1.6 90% 10%
7 0.8 75% 0%
Tabla 2. Actividad catalítica de la amilasa a cambios de concentración.
 Figura 4. Fotografía de la coloración con cambio en la temperatira.

Tubo Temperatura % Intensidad % Reacción

1 4°C 30% 70%
2 Ambiente 10% 90%
3 37°C 10% 90%
4 94°C 100% 0%
Tabla 3. Actividad catalítica de la amilasa a cambios de temperatura.

En la determinación de la actividad catalítica de la enzima bajo las condiciones evaluadas se

preparaba la enzima, para garantizar la actividad de la enzima se agregó NaCl al 0,85%, ya que se
ha comprobado que múltiples enzimas alfa-amilasas provenientes de animales son activadas
alostéricamente por el ion cloruro (D'Amico et al., 2000).

Al inicio del procedimiento se creó un control negativo, expresado en la Tabla 1 como el Tubo 8,
este no tiene enzima, por ende, no hay actividad catalítica, y muestra una coloración más intensa
que sirve de referencia para comparar el resto de ensayos. Esta coloración se da debido a la
interacción con el Lugol, dicho reactivo se ha usado en investigaciones para la identificación del
almidón, los iones de yodo son adsorbidos por este, se ubican en el interior de las cadenas en
forma de espiral de la amilosa formando un complejo que produce una coloración azul intensa
(Martín-Sánchez et al., 2013). Debido a esto, podemos intuir que cuando la coloración sea más
intensa, hay mucho almidón formando complejo con el yodo del Lugol, y cuando las
coloraciones sean más bajas o nulas, sabremos que la enzima a estado haciendo su trabajo
degradando los enlaces del almidón, lo que reduce la formación del complejo coloreado.
 Figura 5. Estructura del complejo amilosa-yodo.(G. Alvares Calviño.
http://docentes.educacion.navarra.es/ralvare2/Disacaridospolisacaridos.pdf ).

Para determinar el avance de la reacción se estima un porcentaje de intensidad de la coloración,

comparando los diferentes tubos de ensayo con el control negativo, que sería un equivalente a
porcentaje de no reacción y se considera el porcentaje de reacción a través de la siguiente
relación:
% Reacción = 100 - % Intensidad

Cuando se evaluó la reacción de la enzima a cambios de pH se observó como a medida que este
aumentaba, también lo hacía la actividad de esta, lo que nos lleva a pensar que la amilasa trabaja
mejor a pH básico o cercano al básico, dado que desde el pH 7,5 se empezaron a ver buenos
resultados, coloraciones mucho más claras que a pH muy ácido. En estudios anteriores se estimó
que el pH óptimo de esta amilasa humana se encuentra entre 7.0 y 8.0 (Zakowski & Bruns, 1985).
Lo anterior genera un poco de dudas en los resultados, sin embargo, una buena explicación es que
en medio alcalino, los grupos hidroxilo del almidón tienden a ionizarse, destruyendo su estructura
helicoidal y su capacidad de reacción (de Lourdes Garzón, 2006); por lo tanto, si el yodo no tiene
estructura helicoidal en la cual anclarse, no habrá formación de complejo coloreado, y como la
base para determinar la acción de la enzima era la coloración, la muestra de datos pudo verse
afectada.
 Figura 6. Gráfica % Reacción vs pH.

Al variar la concentración de la enzima esta se comportaba de una manera predecible y lógica,

entre más concentración de la enzima, más actividad catalítica había. El mayor porcentaje de
reacción se dió en la mayor concentración, que estaba al 50% de saliva.

Figura 7. Gráfica % Reacción vs [Enzima].

Para los cambios de temperatura, también se visualizaron variaciones en el comportamiento de la

enzima. A temperaturas muy bajas o muy altas se puede observar como baja la actividad
enzimática, esto tiene sentido, pues a temperaturas muy altas como la de 94°C, que sobrepasan
por mucho la temperatura fisiológica del cuerpo en el que usualmente trabaja, las proteínas, como
estas enzimas, se empiezan a desnaturalizar y por lo tanto, como pierden su forma activa, pierden
su funcionamiento. La temperatura a la que debería actuar de la manera más óptima sería a la
temperatura corporal humana, 37°C, donde vemos que realmente funciona muy bien. En el
experimento la temperatura ambiente y la temperatura a 37°C presentaron una coloración muy
parecida, por no decir que la misma, si debería existir una disminución de reacción en la
temperatura ambiente, sin embargo, pudieron existir factores en el laboratorio que afectaran este
resultado, teniendo en cuenta también que la diferencia entre estas temperaturas no era muy
grande y que el rango estudiado donde hay un optimo funcionamiento enzimatico es 32–37 °C. A
temperaturas muy bajas se ha visto que las enzimas se desactivan (Jain et al., 2020).

Figura 8. Gráfica % Reacción vs Temperatura.

EXTRACCIÓN DE LA TIROSINASA Y DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD EN ALGUNOS

VEGETALES.
En la evaluación de la actividad enzimática de la enzima tirosinasa bajos condiciones normales
entre los 3 vegetale utilizados, se obtuvo lo siguiente:

Lecturas de absorbancia en condiciones normales

Tiempo Manzana Papa Banano
0 0,024 0,099 0
1 0,047 0,298 0,275
2 0,069 0,425 0,344
3 0,09 0,474 0,341
4 0,109 0,487 0,337
5 0,126 0,495 0,328
 6 0,141 0,511 0,324
7 0,158 0,525 0,315
8 0,171 0,534 0,309
Pendiente (m) 0,01834 0,0436 0,0217
Tabla 4. Absorbancias en condiciones normales.

Figura 9. Gráfica de absorbancias vs tiempo, en condiciones normales.

Para calcular la actividad enzimática y la velocidad se proponen las ecuaciones (1) y (2).Para
hallar la velocidad se usará la ecuación (1) y posteriormente con el dato de la velocidad se podrá
determinar la actividad enzimática.
ν=Δ|¿| Δ t (1)
AE=ν /V (2)
Donde,
ν=velocidad de reacción
AE=actividad enzimática
V =volumen

Recordar que el volumen de todos los extractos enzimáticos utilizados fue de 1 mL, tenemos que:
Manzana Papa Banano
Velocidad de reacción (abs/min) 0,01834 0,0436 0,0217
 Actividad enzimática (abs/min*mL) 0,01834 0,0436 0,0217
Tabla 5. Resultados de la actividad enzimática a condiciones normales.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la tabla 4 y en la figura 9, se observa que la

reacción de la papa la que presenta una mayor absorbancia, es decir que la papa debería presentar
una mayor coloración marrón debido a la oxidación y la formación de melanina , por otra parte la
manzana es el extracto con menor absorbancia y menor pendiente es decir que la manzana se
oxida más lento, (lo anterior se aplicaría si los datos estuvieran bien tomados ); si se observa la
gráfica 1 específicamente los datos que hacen referencia al banano y a la papa se puede notar lo
siguiente: el R2 que es la magnitud que nos indica la correlación que tienen los datos y si la
ecuación los modela bien, es de 0,29 para el banano y 0,69 para la papa por lo que el análisis;
entre más cercano esté a 1, más confiable será la relación por lo tanto se podría decir que los
datos no tienen una relación confiable y la comparación basados en estos resultados estaría
errada.

5.4 Lecturas de absorbancia con aumento de temperatura

Lecturas de absorbancia con aumento de temperatura

Tiempo Manzana Papa Banano
0 0,022 -0,058 0
1 0,014 -0,032 0,004
2 0,016 -0,008 0,025
3 0,019 0,013 0,036
4 0,020 0,021 0,047
5 0,018 0,033 0,064
6 0,018 0,044 0,070
7 0,019 0,052 0,075
8 0,020 0,061 0,073
Tabla 5. Absorbancias con aumento de temperatura.
 Figura 10. Gráfica de absorbancias vs tiempo, con aumento de temperatura.

5.5 Lecturas de absorbancias con aumento de inhibidor

Lecturas de absorbancia en presencia de inhibidor

Tiempo Manzana Papa Banano
0 0,010 0,046 0
1 0,011 0,069 0,004
2 0,010 0,078 0,009
3 0,007 0,069 0,007
4 0,009 0,069 0,006
5 0,007 0,069 0,008
6 0,006 0,070 0,006
7 0,005 0,071 0,006
8 0,006 0,072 0,006
Tabla 6. Absorbancias en presencia de un inhibidor.
 Figura 11. Gráfica de absorbancias vs tiempo, en presencia de un inhibidor.

Figura 12. Gráfica absorbancias vs tiempo, extracto seleccionado en diferentes condiciones

Extracto Actividad enzimática Unidades

Manzana a condiciones 0,0992 (abs/min*mL)

normales

Manzana con aumento de 0,0377 (abs/min*mL)

temperatura

Manzana con presencia de 0,797 (abs/min*mL)

 inhibidor
Tabla 7, actividades enzimáticas extracto de manzana
*¿Qué explicación le puede dar a los resultados de actividad enzimática a partir de las
regresiones realizadas en las diferentes condiciones: Normal, cambio de temperatura y
presencia de un inhibidor?
para la actividad enzimática evaluada en el primer caso (condiciones normales) se puede observar
un comportamiento lineal, lo que significa que a medida que aumenta el tiempo aumenta la
absorbancia, la de la papa aumentaba más que las otras evaluadas, sin embargo todas seguían el
comportamiento (tendencia a volverse más oscuras) lo que significa que todas seguían teniendo
un pardeamiento por la formación de melanina.

para la prueba de aumento de temperatura los valores de manzana y banano estuvieron oscilando
en rangos cercanos, esto se debe a que al aumentar la temperatura llega un punto en el que se
altera la estructura de la enzima y esto afecta la actividad para continuar con la reacción de
oxidación, lo anterior explica la similitud en algunos datos a medida que pasa el tiempo; por otra
parte la papa no sigue un comportamiento como el observado en los otros extractos, en la muestra
de la papa se observa que la tendencia empieza a ser negativa a medida que pasa el tiempo, pero
luego vuelve a ser positiva ( por lo que podría suponerse un error en la toma de datos) teniendo
en cuenta el estudio realizado a la papa (1) se observa que a medida que pasa el tiempo la
absorbancia disminuye y toma un comportamiento negativo.

Para la prueba usando un inhibidor, se adiciono un inhibidor (ácido ascórbico), en los tres
extractos se obtuvo que la absorbancia comenzaba a variar entre valores cercanos, lo anterior
puede explicarse debido a que el ácido ascórbico contrarresta la oxidación lo que significa que
evita o contrarresta la formación de melanina dando como producto que la absorbancia
registrada oscila en valores cercanos o como en el caso del banano no aumente, se sabe que el
ácido ascórbico es un reductor fuerte, por lo tanto este no solo evita la oxidación, sino que
también puede ser capaz de inactivar la enzima tirosinasa y modificar el sitio activo lo anterior
hace que pierda toda su capacidad para pardear los extractos (2), (3).
Determine el porcentaje de inhibición para el extracto que le fue asignado al cual se le
adicionó inhibidor (ácido ascórbico), empleando la fórmula:

mi
%Inhibición=[1−( )] x 100(3)
mn
0,0007
%Inhibición=( )∗100=3.8 %
0,018

¿Cómo inhibe el ácido ascórbico la reacción bioquímica catalizada por la enzima

tirosinasa?
la principal función de la tirosinasa (enzima que está presente en vegetales y animales) es
catalizar la melanina y otros pigmentos de la tirosina por medio de la oxidación, teniendo en
cuenta lo anterior, el ácido ascórbico es un potente inhibidor de la enzima tirosinasa; dependiendo
de las condiciones de uso puede modificar la estructura de la enzima y su sitio activo, el ácido
ascórbico convierte las quinonas en fenoles no es una reacción duradera ya que esta depende de
la cantidad de ácido ascórbico que esté presente, también en la reacción se pueden formar otro
pardeamiento el cual es causado por el dehidroascórbico.

4. Conclusiones
- Es posible comparar la velocidad de pardeamiento entre frutas o verduras y encontrar
cuales son las que se oxidan con mayor velocidad, sin embargo para el análisis anterior se
deben tener en cuenta otros aspectos como por ejemplo la procedencia de las frutas,
puesto que una manzana que ha sido modificada genéticamente o que contenga algún
conservante al ser vendida por una empresa industrial, se oxida mucho más lento que una
manzana orgánica recolectada (la manzana inicial para este estudio se oxido mas rapido y
no funciono ).
- Se podría decir que el pardeamiento enzimático representa un gran problema en la
industria alimenticia al ser una reacción de oxidación en la cual los alimentos toman un
color marrón debido a reacciones químicas especiales, esto sucede en las frutas y
vegetales por lo general no genera daños, al producir alteraciones en el color se puede
reducir el valor comercial de los productos e incluso puede llegar a ser inaceptables para
el consumidor (el color puede generar molestias visuales ). Estas pérdidas pueden llegar a
 ser muy importantes en el caso de frutas y vegetales como los expuestos en la práctica
(Manzana, papa y banano) ya que estos generan gran valor comercial.
-

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