TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ

MAESTRÍA EN CIENCIAS EN INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Materia:
Enzimología

Catedrático:
Dra. Sandy Luz Ovando Chacón

Práctica:
Inmovilización enzimática

Presentan:
Amet Ovando Robledo
Arturo Peña Blassi
Oscar Ramón Cruz Alonso

Tuxtla Gutiérrez, Chiapas 26/Noviembre/2019

 INTRODUCCION
Las enzimas son bien conocidas como catalizadores altamente efectivos y eficientes de una
amplia variedad de procesos caracterizados por una alta selectividad y actividad. Además,
las enzimas pueden reducir la cantidad de pasos de reacción y las cantidades de solventes
peligrosos necesarios y, por lo tanto, hacer que el proceso sea más económico y respetuoso
con el medio ambiente (Cowan & Fernandez-Lafuente, 2011). Gracias a su origen
biológico se les confiere algunas ventajas y limitaciones con respecto a los catalizadores
químicos. Dos de las características que han limitado la aplicación de las enzimas en
diversos procesos son: las condiciones de trabajo bajo las cuales son estables y su
solubilidad en agua, esto último las hace difíciles de separar del medio para reutilizarlas.
Con los métodos de inmovilización estos problemas anteriores se han resuelto en su
mayoría (Hugo, Javier, Guadalupe, Carlos, & Rosa, 2010).
La inmovilización enzimática se puede definir como el confinamiento de la enzima en un
soporte, lo cual limita su movimiento, pero conserva su poder catalítico. La inmovilización
además aumenta la estabilidad de la enzima y hace posible su reutilización al mantenerla en
forma insoluble. No obstante, la inmovilización también presenta algunos inconvenientes
como la alteración de la conformación de la enzima, pérdida de actividad, heterogeneidad
en el sistema soporte-enzima (ya que habrá enzimas unidas al soporte en mayor o menor
grado), y el incremento en el costo de la enzima inmovilizada (Hugo, Javier, Guadalupe,
Carlos, & Rosa, 2010)
Existen diversos métodos para inmovilizar enzimas, los cuales se pueden dividir en dos
categorías de acuerdo al tipo de unión que ocurre entre el soporte y la enzima: unión física
y unión química. Dentro del primer grupo encontramos dos variantes: atrapamiento e
inclusión en membranas, y entre los métodos que se basan en una unión química están la
unión a soportes y el reticulado (Lupo & González, 2012). Además, se puede utilizar una
amplia variedad de materiales de diversos orígenes como soportes para la inmovilización de
enzimas. Estos materiales pueden, en general, dividirse en orgánicos, inorgánicos e híbridos
o compuestos. El soporte debe proteger la estructura de la enzima contra condiciones de
reacción severas y, por lo tanto, ayudar a la enzima inmovilizada a retener una alta
actividad catalítica (Sheldon & van Pelt, 2013).
Un claro ejemplo de inmovilización es en alginato de calcio o hidrogeles de carragenina
formados por procesos de intercambio iónico (Brena & Batista-Viera, 2006). Debido a que
las enzimas están atrapadas físicamente dentro de los hidrogeles con agua, las
conformaciones de las enzimas no se ven afectadas. Por lo tanto, las actividades de las
enzimas se conservan en gran medida después de la inmovilización enzimática. Los
hidrogeles también proporcionan barreras físicas para proteger las enzimas de los
ambientes hostiles. Debido a que la mayoría de los hidrogeles tienen un alto contenido de
agua y grandes poros (de 5 a 200 nm) (Gombotz & Wee, 1998), permiten la difusión libre
de sustratos en los hidrogeles para reacciones catalizadas por enzimas.
Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es la inmovilización de la enzima celulasa mediante
perlas de alginato usando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato para evaluar si el
confinamiento de este catalizador biológico afecta a su actividad enzimática.

MATERIALES Y MÉTODOS.
Materiales.
En el desarrollo de esta práctica se utilizó solución de CaCl 2 al 2%. Solución Alginato de
sodio al 2%. Enzima comercial celulasa obtenida de Trichoderma reesei, comercializada
por Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) con número de serie C-2730. Vaso de
precipitados 250 mL. Parrilla de calentamiento. Agitador magnético. Bureta graduada.
Matraz volumétrico de 50 mL y de 250 mL. Probeta graduada de 50 mL. Soporte universal.

Preparación de las soluciones.

 Solución de CaCl2.
Se pesaron 5 g de CaCl2, se colocaron en un matraz volumétrico de 250 mL se añadieron 50
mL de agua destilada para disolverlo y posteriormente se aforó a 250 mL.

 Solución de Alginato al 2%.

Se pesó 1 g de alginato de sodio, se colocó en un vaso de precipitados que contenía 50 mL

de agua destilada, este vaso se colocó en una parrilla a la cual se le programó una agitación
de 150 rpm a una temperatura de 50 °C.

 DNS.

Para preparar el reactivo DNS se disolvieron 7.4858 g de ácido 3-5- dinitrosalicílico en 1 L

de agua destilada, luego se agregaron 13.98 g de NaOH, se adicionaron 216.09 g de sal de
Rochelle, se agregaron 5.36 mL de fenol y finalmente se agregaron 5.85 g de metabisulfito
de sodio.
Inmovilización de la enzima celulasa.

La inmovilización de la enzima se realizó siguiendo el método descrito por (Abdel-Sater,

Hussein, Fetyan, & Gad, 2019), para lo cual realizó una dilución de la enzima comercial en
una proporción 1:50, se tomaron 10 mL de la enzima diluida y se mezclaron con 40 mL de
la solución de alginato de sodio al 2%, esta mezcla se colocó en la bureta graduada.
Posteriormente se montó la bureta en un soporte, colocando debajo de esta un vaso de
precipitado que el cual contenía 250 mL de la solución de CaCl 2 al 2%, procurando que la
punta de la bureta quedara a una distancia aproximada de 3 cm (esto para favorecer la
correcta formación de las perlas). Finalmente las perlas se formaron abriendo la bureta y
dejando gotear la mezcla de enzima y alginato en la solución de CaCl 2. Una vez formadas
las perlas se dejó pasar 30 min, después de este tiempo se procedió a separar a las perlas de
la solución de CaCl2 por filtración, se lavaron 3 veces con agua destilada y se almacenaron
para su posterior uso.

Ensayo de la actividad de la enzima libre.

La actividad enzimática se midió empleando el método modificado de Goel (2019) el cual

consiste en la cuantificación de azucares reductores liberados en el proceso de hidrólisis de
CMC. Para ello se realizó una curva estándar partiendo de una solución madre con una
concentración de 1g/L de glucosa a la cual se realizaron diluciones hasta obtener
concentraciones de (0.8, 0.6, 0.4, 0.2 y 0) respectivamente las cuales se le midió la
absorbancia a una longitud de onda de 540 nm.

El ensayo se realizó mezclando 0,5 mL de solución enzimática la cual se obtuvo diluyendo

la enzima comercial en proporción 1:50 y 0,5 mL de CMC al 1% p/v en tampón fosfato
0,05 M a un pH 5.0, esta se incubó a 50 ° C durante 30 minutos, pasando el tiempo de
reacción se añadieron 3 mL de reactivo DNS, mezcla se sometió a 100ºC durante 10
minutos en un baño de agua posteriormente se dejó enfriar en hielo y se añadieron 10 mL
de agua destilada. La absorbancia de la mezcla se midió en un espectrofotómetro UV a una
longitud de onda de 540 nm y los valores fueron interpolados en la ecuación de la curva
estándar (Anexo 1). Finalmente se calcularon las unidades de actividad enzimática
utilizando la (ecuación 1), para lo cual se definió a una unidad enzimática (U), como la
cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de glucosa por minuto

µmol Glucosa
IU=
1 mL X 30 min

Ecuación 1: Formula para calcular la actividad enzimática.

Ensayo de la actividad enzimática de la enzima inmovilizada.

La actividad de la enzima inmovilizada se llevó acabo siguiendo la metodología descrita
por (Nguyen, Lau, & Yang, 2016) . Se mezclaron 5 mL de CMC al 1% p/v en tampón
fosfato 0.05 M a un pH 5.0 y 3 g de las perlas de alginato que contenían a la enzima
inmovilizada, esta se incubo a 50 °C con agitación constante de 150 rpm. Después de 30
minutos, se midió la concentración de azucares reductores mediante un ensayo por DNS,
para lo cual se añadieron 3 mL de reactivo DNS, la mezcla se sometió a 100ºC durante 10
minutos en un baño de agua posteriormente se dejó enfriar en hielo y se añadieron 10 mL
de agua destilada. La absorbancia de la mezcla se midió en un espectrofotómetro UV a una
longitud de onda de 540 nm y el valor obtenido se interpoló en la ecuación de la curva
estándar mostrada en el (Anexo1). Finalmente se calcularon las unidades de actividad
enzimática utilizando la (ecuación 1), para lo cual se definió a una unidad enzimática (U),
como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de glucosa por minuto bajo las
condiciones experimentales.

RESULTADOS
Tras evaluar la actividad de la enzima libre bajo las condiciones optimas de pH 5.0 y
temperatura de 50°C se obtuvo una absorbancia de 0.550 lo cual al realizar los cálculos
correspondientes se determinó que la enzima tenía una actividad de (0.0725 U/mL) por otro
lado al evaluar la actividad de la enzima inmovilizada se hayo una absorbancia de 0.219,
dando como resultado una actividad de (0.0350 U/mL) lo que corresponde a un 48.27% de
la actividad en compacion con la actividad que presento la enzima libre.
 DISCUSION

La enzima celulasa exhibió una mayor actividad al emplearse de manera libre y al ser
inmovilizada en perlas de alginato de calcio redujo su actividad a un 48.27% este resultado
es similar al obtenido por (Viet, Minh, & Dao, 2013) el cual inmovilizo una enzima
celulasa comercial de Trichoderma reesi obteniendo que la enzima inmovilizada retenía
solo el 85.07 % de la actividad comparada con la enzima libre, esta presento una mayor
estabilidad a cambios de pH y temperatura. Por otro lado (Abdel-Sater, Hussein, Fetyan, &
Gad, 2019) determino que al inmovilizar la enzima celulasa de Penicillium
brevicompactum AUMC 10987 se retiene hasta un 84.62% de la actividad comparado con
la enzima libre. Este efecto se puede explicar debido a que tras una inmovilización la
actividad enzimática puede disminuir o incluso perderse ocasionado por un cambio
conformacional que da lugar a una forma inactiva, la unión al soporte se produce de tal
forma que el paso del sustrato al sitio activo está impedido, los grupos reactivos del soporte
reaccionan con algún aminoácido que forme parte del centro activo o que sea esencial para
la actividad catalítica de la enzima, de igual manera podría deberse a las condiciones
experimentales del proceso lo cual causan desnaturalización o desactivación de la enzima
(Arroyo, 1998).

CONCLUSION
Se logro inmovilizar la enzima celulasa de Trichoderma reesei por atrapamiento en perlas de
alginato de calcio con lo cual se logro mantener el 48.27% de la actividad de la enzima libre este
comportamiento es de esperarse ya que en el proceso de inmovilización las proteínas pueden sufrir
cambios conformacionales en el sitio activo, así como desnaturalización durante el proceso. Sin
embargo, se ha reportado que la inmovilización brinda una mayor estabilidad a cambios de pH y
temperatura, comparado con otros soportes se prefieren las capsulas de alginato de calcio debido
a su fácil formulación, condiciones de gelación suaves, no tóxicas, biocompatibilidad, bajo costo y
resistencia al ataque microbiano.
 BIBLIOGRAFIA

Abdel-Sater, M., Hussein, N., Fetyan, N., & Gad, S. (2019). Immobilization of Cellulases Produced
by Penicillium brevicompactum AUMC 10987, using Croos-Linkage, Chitosan-Coating and
Encapsulation. The egyptian society for environmental sciences, 18(1), 139-149.

Arroyo, M. (1998). Inmovilización de enzimas. Fundamentos, metodos y aplicaciones. Ars

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Brena, B., & Batista-Viera, F. (2006). Immobilization of enzymes, in: J. Guisan. Immobilization of
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Gombotz, W., & Wee, S. (1998). Protein release from alginate matrices. Adv. DrugDeliv. Rev. 31, .
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Lupo, P. B., & González, A. C. (2012). Microencapsulación con alginato en alimentos. Revista
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Nguyen, L., Lau, Y., & Yang, K. (2016). Entrapment of croos-linked cellulase colloids in alginate
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Sheldon, R., & van Pelt, S. (2013). Enzyme immobilisation in biocatalysis: Why, what and how?
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Viet, T., Minh, N., & Dao, T. (2013). Immobilization of cellulase enzyme incalcium alginate gel and
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 ANEXOS

Anexo 1

Figura 1. Curva de calibración para azucares reductores método DNS.