PROCEDIMIENTO CULTIVOS

CELULARES
Evolución del cultivo

El primer paso lo realiza Manolo y

transfiere 1ml de medio de cultivo
a los tubos y ha cogido 3 ml de
Paso 1
células y las ha agitado
suavemente.
Obteniendo 4ml en total.

Paso 2
A los 2-3 días de la siembra, observamos
una  confluencia de 90%, por lo que
procedemos hacer los pases pertinentes.

En este punto ya disponemos de 2 frascos

roux , con 4 ml cada uno, tras el pase
realizado en el paso 2. Se vuelve a dejar en la
incubadora para llegar a la confluencia
Paso 3
requerida y seguir haciendo pases..

Paso 4
Debido a la confluencia observada al dia
siguiente, el grupo decidio ampliar la
superficie del frasco roux, para que tardase
mas tiempo en alcanzar la confluencia,
intruduciendo los 2 frascos de 4 ml en otro
de mayor tamaño, obteniendo un frasco roux
mayor con 8 ml de la mezcla de celulas de
mosquito y medio de cultivo.

A estas alturas, ya teniamos que realizar el

Paso 5
conteo de celulas con la ayuda de la camara
de Neubauer, con la adiccion del azul tripan
para diferenciar las celulas muertas ( se
teñiran de azul) de las vivas, que se quedaran
transparentes. Previamente al conteo se
hace una dilucion de nuestra mezcla para
adicionarle el agente de tincion.

Una vez realizado la viabilidad, se procede a la

congelacion de la linea celular, para ello hay que seguir el

Paso 6
procedimiento como si fuesemos a realizar un pase,
despues de la centrifugacion leve se retira el medio y se
adiciona DMSO al 10% y SFB al 90%. Posteriomente se
congela de manera escalonada en alicuotas en
criotubos de 1 ml, realizando el proceso de forma
escalonada ( 24h. a -20ºc, 24h. a -80ºc y se pasa a
nitrógeno liquido)

Un paso previo a todos los anteriores seria las descongelacion

de la linea celular que queramos utilizar.
En primer lugar se debe de preparar el medio de cultivo
especifico para la linea celular, el cual debe de llevar como
mínimo FBS, antibiótico, antifungico, tampon, sustrato nutritivo...
Junto a este paso estaríamos descongelando las células en el
baño maría a 37ºC, acto seguido una centrifugación leve para
Paso 7
eliminar el sobrenadante con el DMSO, y por ultimo añadir el
resto a nuestro medio de cultivo preparado previamente e
incubar.

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