UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA

ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA

Identificación y Cuantificación de las Saponinas

contenidas en el fruto de la especie Cucumis dipsaceus
por HPLC

QUÍMICA ORGÁNICA IV

ALUMNO: Juan Aspilcueta Calixto

PROFESOR: Nino Castro Mandujano

2021
 RESUMEN

Este proyecto consiste en identificar el

tipo de saponina por reacciones
cualitativas y a la vez cuantificar la
saponina de la especie Cucumis
dipsaceus por cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC)

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 INTRODUCCIÓN

Jaboncillo de campo o pepino

Saponinas
erizo “Cucumis dipsaceus”

3
 Biosíntesis
de
Saponinas

Sapogenina

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 OBJETIVOS

- Extraer y purificar las saponinas de la especie

Cucumis dipsaceus
- Identificar el tipo de saponinas de la especie
Cucumis Dipsaceus
- Hidrolizar las saponinas de la especie Cucumis
Dipsaceus
- Identificar la sapogenina de las saponinas de
la especie Cucumis Dipsaceus
- Cuantificar las saponinas de la especie
Cucumis Dipsaceus
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 MARCO TEÓRICO

- Hidrólisis de saponinas
- Hidrólisis ácida
- Hidrólisis básica
- Reacción de Liebermann- Burchard
- Reacción de Rosenthaler

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 PROCEDIMIENTO
EXPERIMENTAL
1. Extracción de saponinas por maceración

2. Se macera
4. Se lleva el
con hexano por
3. Se macera en extracto
24 horas, se
1. Se muestrea 500 mL de agua obtenido a un
deja secar el
y pesa 4 frutas por 24 horas. El equipo de
disolvente
extracto se filtra. Fraccionamiento
obtenido por 24
de espuma.
horas más.

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 2. Aislamiento de saponinas

4. La fracción
butanólica se 5. La solución se
2. La fracción 3. La fracción llevo a una estufa
1. El escurrido se extrae con 90 mL de
acuosa se extrae acuosa se extrae por 48 horas y se
extrae con 90 mL n-butanol, finalmente
con 90 mL de con 90 mL de n- redisuelve el
de cloroformo se lleva a evaporar el
acetato de etilo butanol residuo seco disolvente.
obtenido con
NaOH 1%.

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3. Procedimiento para la identificación de saponinas
3.1. Prueba de Identificación de Reacción de Lierbermann Burchard

1. Se agrega 3
2. Luego se
gotas de ácido
agrega 3 gotas de
acético al extracto
anhidrido acético.
seco de saponinas

3. Finalmente se
agrega 1 gota de
ácido sulfúrico.

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3.2. Prueba de Identificación por la Prueba de Rosenthaler

1. Se agrega 2 a 3 gotas de
solución etanólica de 2. Luego se agrega 1 a 2
vainillina al 1% al extracto gotas de ácido sulfúrico.
seco de saponinas

10
3.3. Identificación de Saponinas por Cromatografía HPLC
3.3.1. Preparación de Saponinas Patrón Experimental

1. Se pesa 5, 10 y 20 mg de
2. Se inyectan las soluciones
muestras se llevan a fiolas
al HPLC a flujo de 2mL/min
de 10 mL llevándolas a
y longitud de onda de 264
volumen con metanol.
nm utilizando como fase
Agitándose hasta disolver.
móvil el metanol.
(C= 0,5; 1; 2mg/mL)

11
3.3.2. Preparación de Saponinas Ensayo

1. Se pesa 10 mg de las
2. Se inyecta la solución al
saponinas purificadas del
HPLC a flujo de 2mL/min y
jaboncillo de campo y se
longitud de onda de 264 nm
lleva a una fiola de 10 mL
utilizando como fase móvil
llevando a volumen con
el metanol.
metanol

12
4. Hidrólisis de Saponinas
4.1. Hidrólisis con hidróxido de potasio 0.5%
1. Se lleva a matraces
Erlenmeyer 3
2. Luego se colocan
porciones de 10 mg
los matraces a baño
de las saponinas
maría alcanzando los
purificadas
38 °C.
adicionándoles 6 mL
de agua.

3. Finalmente se
agregó 3mL de KOH
0.5% a cada matraz
manteniéndose las
condiciones durante 3
horas.
13
4.2. Hidrólisis con ácido clorhídrico

1. Se lleva a matraces
Erlenmeyer 3
2. Luego se colocan
porciones de 10 mg
los matraces a baño
de las saponinas
maría alcanzando los
purificadas
70 °C.
adicionándoles 6 mL
de agua.

4. Finalmente se 3. Luego se agregó

lleva a baño de 3mL de HCl a cada
hielo y se ajustó el matraz manteniendo a
pH a 6.5-7.2 con reflujo durante 20
NaOH al 30%. minutos.

14
4.3. Extracción de Sapogenina

1. Se trasvasó la
2. Luego se llevó la
muestra anterior a
fase clorofórmica a
una pera de
una estufa a 60°C
decantación y se
hasta evaporación del
extrajo 3 veces con
solvente.
cloroformo.

3. Finalmente se
obtiene un producto
seco (sapogeninas).

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4.4. Separación de azúcares del hidrolizado

1. De la extracción anterior se
2. Luego se rotuló para ser
separó las 3 porciones acuosas
llevado a análisis.
(que contiene los azúcares)

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5. Procedimiento para la cuantificación por HPLC de
sapogeninas

1. Se pesó 25 mg de las 2. Luego la solución se

sapogeninas extraídas y
se lleva a una fiola de 25
mL llevándolo a volumen
con metanol.
(C=1mg/mL)
inyectó HPLC a flujo de
2mL/min y longitud de
onda de 264 nm
utilizando como fase
móvil el metanol.

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6. Procedimiento para la cuantificación por HPLC para
los azúcares patrones

1. Se pesó 10 mg de
2. Luego las soluciones se
patrones experimentales
inyectaron HPLC a flujo de
de glucosa y fructosa y se
0.5mL/min y longitud de
llevaron a fiolas de 10 mL
onda de 190 nm utilizando
llevándolos a volumen con
como fase móvil el agua
agua bidestilada.
bidestilada.
(C=1µg/mL)

18
7. Procedimiento para la cuantificación por HPLC para
los azúcares del hidrolizado

2. Luego se transfirió
1. Se transfirió 0.1mL del
0.3mL de la solución
hidrolizado a una fiola de
anterior a una fiola de 10
10 mL llevándolo a
mL llevándolo a volumen
volumen con agua
con agua bidestilada. (3
bidestilada.
soluciones)

2. Luego las soluciones se

inyectaron HPLC a flujo de
0.5mL/min y longitud de
onda de 190 nm
utilizando como fase móvil
el agua bidestilada.

19
 RESULTADOS

1. Pruebas Cualitativas. Pruebas de coloración para la identificación de

saponinas
Reacción Coloración Resultado

Liebermann- Rojo Café Presencia de saponinas

Burchard triterpénicas
pentacíclicas.

Rosenthaler Violeta Presencia de saponinas

triterpénicas
pentacíclicas.

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2. Datos para la curva de calibración de las saponinas
patrón experimental (264nm)
Area Pico

mg/mL Area Pico 1 2 3

0,5 30,3346667 30,7394 29,5295 30,7351

1 57,0141133 57,0311 57,02724 56,984

3
2 78,8237266 78,872 78,8156 78,78358
7

21
2.1 Curva de Calibración para la cuantificación de
saponinas triterpénicas pentacíclicas

22
3. Concentración de saponinas del Cucumis dipsaceus

Area Pico

mg/mL Area 1 2 mg/mL cal

Promedio
1 34,359275 29,07669 39,64186 0,67

23
 4. Tiempo de retención(tR) de la saponina patrón
experimental y de saponinas del Cucumis dipsaceus

Muestra Tiempo de Retención (tR)

Saponina patrón experimental 0,582

Saponina del Cucumis 0,571

dipsaceus

24
5. Tiempo de retención(tR) de las sapogeninas del
Cucumis dipsaceus

Muestra tR(min)

1 0.570

2 0.569

3 0.565

25
6. Tiempo de retención(tR) de la muestra de azúcar
patrón y de los azúcares del hidrolizado de
saponinas
Analito tR(min)

Glucosa 1.110

Fructosa 1.128

Azúcares Ensayo 0.658

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 DISCUSIÓN DE
RESULTADOS
▪ Para la extracción de saponinas se maceraron los frutos usando como disolvente al
hexano, con la finalidad de eliminar el material no polar soluble en el hexano o
compuestos no deseados presentes en el fruto y posteriormente se utilizó agua para
extraer las saponinas por maceración durante 24 horas.
▪ El extracto obtenido fue sometido a un proceso de aislamiento y purificación mediante el
empleo de disolventes orgánicos de polaridad creciente.
▪ La purificación de las saponinas contenidas en el escurrido de espuma, empezó con el
empleo de cloroformo; luego se usó acetato de etilo. Las saponinas fueron recuperadas
desde la fase acuosa con n-butanol. La capa butanólica se llevó a una estufa a 90°C por
48 horas. El producto seco se disolvió y se eliminaron los compuestos fenólicos mediante
tratamiento con NaOH al 1%. Las saponinas se recuperaron con n-butanol y se llevó
nuevamente a estufa a 90°C por 24 horas. De ésta manera se obtuvo un producto
pulverulento y blanquecino que fue sometido al análisis cuali-cuantitativo.
▪ La identificación de las saponinas del jaboncillo de campo se realizó mediante las
reacciones de coloración. Para reacción de Liebermann-Burchard, La etapa inicial de la
reacción consiste en la protonación del grupo OH del C3 de la saponina obteniéndose un
ión y con la consiguiente la pérdida de una molécula de agua lo que constituye el primer
paso de la reacción de color. La oxidación secuencial de este ión por el SO²ˉ produce un
compuesto cromóforo con máximos de absorbancia a 620nm.

27
▪ La obtención de sapogeninas a partir de la hidrólisis consistió primero en realizar
hidrólisis alcalina suave con KOH 0.5% para eliminar restos éster-azucarados, si los
hubiese. Se reflujó la mezcla en baño maría a 37°C por 3 horas.
▪ Para aislar la genina se realizó la hidrólisis ácida (ácido clorhídrico) previo ajuste de pH a
6.5-7.2 con NaOH al 30%. Las sapogeninas resultantes fueron extraídas en un embudo
de separación con tres porciones de cloroformo. El residuo acuoso fue recolectado en un
vaso de precipitados. Pasando los extractos clorofórmicos a otro recipiente, luego por
evaporación del cloroformo, se obtuvo las sapogeninas.
▪ Se registró el color rojizo para la reacción de Liebermann-Burchard y el color violeta para
la reacción de Rosenthaler, ambos resultados indican la presencia de saponinas
triterpénicas pentacíclicas.
▪ El análisis de datos del Resultado N°3 indica que la concentración encontrada de las
saponinas purificadas de Cucumis dipsaceus fue de 0,67mg/mL.
▪ Los Resultados N°2 corresponden a la curva de calibración de las saponinas patrón. El
análisis de regresión lineal permitió establecer la ecuación experimental para la
cuantificación de saponinas. y= 26,137 x+17,211 donde: x; mg/mL.
▪ En el Resultado N°4 se observa de el tR de la saponina patrón experimental fue de 0,582
min. Mientras que el tR de la saponina Cucumis dipsaceus fue de 0,571min, por lo que
tomando como referencia estos datos podemos presumir que la estructura química de la
saponina en estudio corresponde a una saponina triterpénica pentacíclica.
28
▪ En el Resultado N°5 se muestran los tR las sapogeninas del Cucumis dipsaceus en el
HPLC, sin embargo no se pudo cuantificar las sapogeninas debido a que no se contó con
una muestra patrón.
▪ En el Resultado N°6 se muestra los tRs de las muestras azúcares patrones de glucosa,
fructosa y de los azúcares del hidrolizado de saponinas. Y al comparar estos tRs
experimentalmente se demuestra que los azúcares unidos a la genina de Cucumis
dipsaceus no corresponde a la glucosa ni a la fructosa.

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 CONCLUSIONES

▪ Mediante la metodología planteada se pudo extraer y purificar las saponinas de la

especie Cucumis dipsaceus.
▪ El tipo de saponinas encontrado en la especie Cucumis dipsaceus corresponden a la
familia de las saponinas triterpénicas pentacíclicas.
▪ Se logró separar los componentes de las saponinas del Cucumis dipsaceus mediante la
hidrólisis de la misma, mediante la cual resultó un extracto de sapogenina y un
hidrolizado de azúcares.
▪ No se logró identificar por HPLC el tipo de sapogenina presentes en la especie Cucumis
dipsaceus.
▪ Se descarta la presencia de azúcares como la glucosa y la fructosa, unidos a la genina de
la especie Cucumis dipsaceus por ser diferentes sus tRs con los del hidrolizado de
azúcares.
▪ La concentración de saponinas en el producto obtenido fue de 67%.

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 ANEXOS

▪ 1. Reporte de los tR de la saponina de la especie Cucumis dipsaceus

31
2. Reporte de los tR de la sapogenina de la especie Cucumis dipsaceus

32
3. Reporte de los tR de la muestra patrón de glucosa.

33
4. Reporte de los tR del hidrolizado de azúcares de la especie Cucumis dipsaceus

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