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Artículos
https://doi.org/10.1038/s41592-021-01355-5

Monitoreo de cambios conformacionales de proteínas usando

nanoantenas fluorescentes
Scott G. Harroun1, Dominic Lauzon1, Maximiliano CCJC Ebert2, Arnaud Desrosiers1,3,
Xiaomeng Wang1y Alexis Vallée-Bélisle1,3✉

Comprender la relación entre la dinámica estructural y la función de las proteínas es crucial tanto para la
investigación básica como para la biotecnología. Sin embargo, los métodos para estudiar la dinámica rápida de
los cambios estructurales son limitados. Aquí, presentamos nanoantenas fluorescentes como una técnica
espectroscópica para detectar e informar cambios conformacionales de proteínas a través de interacciones
proteína-colorante no covalentes. Usando experimentos y simulaciones moleculares, detectamos y
caracterizamos cinco estados conformacionales distintos de la fosfatasa alcalina intestinal, incluido el complejo
enzima-sustrato transitorio. También exploramos la universalidad de la estrategia de nanoantenas con otra
proteína modelo, la Proteína G y su interacción con anticuerpos, y demostramos una estrategia de detección
rápida para identificar nanoantenas eficientes.

mi crecimiento de la microbiota comensal18, regulando el pH19, activando

estudio experimental de estados transitorios de proteínas1sigue siendo un
desafío importante porque las técnicas de alta resolución estructural, incluidas la
resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos X, a menudo no se
pueden aplicar directamente para estudiar estados de proteínas de vida corta. Por el
contrario, la espectroscopia de fluorescencia de alta resolución temporal es más
adecuada para detectar estados transitorios.2,3, además de ser conveniente, altamente
sensible y ampliamente disponible. Si bien los grandes cambios conformacionales a
profármacos20,21y estudios de biofísica fundamental22. Los AP se han implicado en
los cánceres de mama, próstata, colorrectal y gástrico.23–26, síndrome metabólico27
, hipofosfatasia28,29, infarto de miocardio30, inflamación intestinal crónica31e
incluso infección por SARS-CoV-232. Esta enzima ha sido caracterizada por
cristalografía.33–35, simulaciones computacionales36, desplegándose37, inhibidores
, mutaciones40e hidrólisis de sustratos40,41. Clásico42,43y nuevas estrategias44–46
38,39

menudo se pueden detectar utilizando la fluorescencia de triptófano intrínseca4, los que
se encuentran en el rango de ~3 a 9 nm generalmente se detectan mediante la
transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). FRET, sin embargo, requiere la
química complicada de la inserción específica del sitio de fluoróforos5,6. Por lo tanto, a
pesar del gran progreso en las técnicas de fluorescencia7–10, sigue existiendo una
necesidad insatisfecha de estrategias sensibles que sean capaces de detectar los
pequeños cambios conformacionales11experimentado por algunas proteínas durante su
función, como la catálisis enzimática12, así como para estrategias de etiquetado más
simples y eficientes.
Aquí, informamos sobre el diseño, la ingeniería y la aplicación de una
herramienta versátil llamada nanoantenas fluorescentes, que detectan e
informan el cambio conformacional de las proteínas y, a su vez, la función de las
proteínas en tiempo real. Dado que los colorantes fluorescentes ampliamente
disponibles muestran una baja afinidad por las proteínas13,14, estas nanoantenas
están diseñadas para impulsar interacciones proteína-colorante no covalentes, lo
que las hace muy sensibles a los cambios conformacionales. Cada colorante debe
tener afinidad por una región diferente de una proteína, dependiendo de su
complementariedad estructural y propiedades químicas. Por lo tanto, a través de
la química de fosforamidita altamente programable, sintetizamos nanoantenas
de ácido nucleico (ADN) y polietilenglicol (PEG) que contienen colorantes y otras
modificaciones funcionales. También aprovechamos la conveniencia de la
interacción no covalente de biotina-estreptavidina (SA), que permite una conexión
rápida y fácil de nanoantenas marcadas con biotina a proteínas marcadas con
biotina.
Como primer modelo de proteína para probar si las nanoantenas pueden detectar la
actividad de la proteína, seleccionamos la fosfatasa alcalina intestinal de ternera (AP; EC
3.1.3.1)15. El estudio de la PA intestinal es un área activa de investigacióndieciséis
debido a su importante papel en la prevención de la inflamación17, promoviendo
para caracterizar la hidrólisis mediada por AP en tiempo real implica monitorear
la tasa de generación del producto (Datos extendidos Fig. 1).
Desafortunadamente, estos ensayos requieren sustratos sintéticos para
proporcionar una señal, mientras que los sustratos biomoleculares de AP son
silenciosos espectroscópicamente (por ejemplo, los trifosfatos de nucleótidos)18,19.
Para las biomoléculas, el ensayo de verde de malaquita estándar no permite el
análisis en tiempo real47, mientras que los ensayos biomoleculares alternativos no
son universales48,49. Calorimetría de titulación isotérmica50,51puede caracterizar la
actividad AP para sustratos biológicos52, pero no es susceptible de detección de
alto rendimiento. No tenemos conocimiento de ningún estudio FRET que
involucre el etiquetado de AP, presumiblemente debido a los pequeños cambios
conformacionales experimentados por esta proteína.34,53. Aquí, diseñamos
nanoantenas fluorescentes, investigamos su mecanismo de señalización y las
aplicamos para estudiar la función AP, así como un segundo sistema de
proteínas, la Proteína G que interactúa con varios anticuerpos.54.
Resultados
Mecanismo de nanoantenas fluorescentes.Resumimos la idea general de
nuestra estrategia en la Fig.1a. Las nanoantenas fluorescentes basadas en
ADN o PEG contienen un tinte fluorescente en un extremo, como
fluoresceína (FAM), y biotina en el otro para facilitar la unión (Inicio). Usando
biotina, adjuntamos la nanoantena al SA tetramérico de tipo salvaje de
Streptomyces avidinii, que tiene cuatro sitios de unión a biotina, y observó
una disminución (o extinción) de la fluorescencia FAM (Paso 1). Simulaciones
de acoplamiento (Fig.1b), evidencia experimental (Datos Ampliados Fig. 2) y
estudios previos55,56sugieren que FAM se une cerca del enlace de biotina
desocupado

1Laboratoire de Biosenseurs & Nanomachines, Departamento de chimie, Université de Montréal, Montreal, Québec, Canadá.2Chemical Computing Group ULC,
Montreal, Québec, Canadá.3Departamento de bioquimia y medicina molecular, Université de Montréal, Montreal, Québec, Canadá.✉Email:
a.vallee-belisle@umontreal.ca

MÉTODOS NATURALES|VOL 19 | ENERO 2022 | 71–80 |www.nature.com/naturemethods 71

Artículos MÉTODOS DE LA NATURALEZA

a d Paso 1 F Paso 2 h Paso 3

0 0.2 14
Paso 1 Paso 2 Paso 3

Fluorescencia relativa

Fluorescencia relativa

Intensidad de pico (au)

comienzo

Teñir

Enlazador
0
– 1.0 0
B 0 6 12 24 48 0 6 12 24 48 0 6 12 24 48
biotina estreptavidina biotinilado Sustrato
(SA) fosfatasa alcalina Longitud (nucleótidos) Longitud (nucleótidos) Longitud (nucleótidos)
productos
Nanoantena
(panecillo en Escocia)
mi gramo i
100
0 0.2 25
Fluorescencia (au)

Fluorescencia relativa

Fluorescencia relativa

Intensidad de pico (au)

1 3
2
60 0
– 0.5 0
0 30

IJA

IJA

IJA
N

N
Tiempo (min)

N
AV

AV

AV
AD

AD

AD
AD

AD

AD
CL

CL

CL
ss

ss

ss
ds

ds

ds
Tipo de enlazador Tipo de enlazador Tipo de enlazador

b j 85
pNPP estreptavidina Alcalino SA pNPP

FAM flúor. (au)

biotina N/A panecillo en Escocia SA
...
fosfatasa
O O– O pNPP (3x)
PAGS
S B
O
S O–
50 panecillo en Escocia

biotina 0 35
k
Tiempo (min)
hn
190
NUEVA HAMPSHIRE

+
norte

CAL flúor. (au)

O O–
O
pNPP
B

C
familia Zoom
O– O O 130
0 35
–
yo Tiempo (min)
O
familia 170
Zoom

flúor Cy3. (au)

O
B

familia
...

90
CALIFORNIA 0 35
CALIFORNIA
metro
ADNc Tiempo (min)

165 ADNc pNPP (3x)

hn O

FAM flúor. (au)

CALIFORNIA
norte
SA bAP
B B

O ADNc-CALIFORNIA

...

40
B B
0 35
Tiempo (min)
Cy3 norte
Cy3 305
CAL flúor. (au)

Cy3 B
270
+
norte norte 115 ADNc-familia

HO O 80
...
B 0 35
Tiempo (min)

Figura 1 |descripción general de la estrategia de nanoantenas fluorescentes para sondear diferentes regiones en una proteína.a, Dibujos animados y datos de ejemplo de nanoantenas
fluorescentes. Para simplificar, la caricatura muestra solo uno de cada componente. au, unidades arbitrarias.b, La simulación de acoplamiento predice con precisión los sitios de unión de biotina
en Sa y el sustrato pNPP en aP.C, Predicción de acoplamiento de los colorantes FaM, CaL y Cy3 sobre Sa y aP.d–i, Optimización de la longitud (d) y composición (mi) del enlazador para el Paso 1 y
de manera similar para el Paso 2 (longitud,F; composición,gramo). Consulte la Fig. 1 complementaria para conocer los espectros de fluorescencia correspondientes. Resultados similares
(longitud,h; composición,i) para el pico de fluorescencia durante la hidrólisis de pNPP para el Paso 3.
Parad–i,norte=Se examinaron 1 muestras de enzimas biológicamente independientes en tres experimentos independientes. Los datos se presentan como valores medios±semen j–yo, Firmas
cinéticas de nanoantenas ssDNa (Na) que contienen el colorante FaM (λex= 498nm,λellos= 520nm) (j), Cal (λex= 540nm,λellos= 561nm) (k) o Cy3 (λex= 546nm,λellos= 563nm) (yo) para los eventos de unión
de Sa y baP, así como la hidrólisis de pNPP. fluor., fluorescencia.metro,norte, Firmas cinéticas de competencia de doble tinte para FaM (metro) y Cal (norte). Enmetro, los datos de la parte
superior muestran la monitorización de la fluorescencia FaM de una nanoantena de ADNdc de un solo colorante con FaM, y los datos de la parte inferior muestran la monitorización de la
fluorescencia de FaM de una nanoantena de ADNdc de doble colorante con FaM y CaL. Ennorte, los datos de la parte superior muestran el seguimiento de la fluorescencia de CaL de una
nanoantena de ADNds de un solo tinte con CaL, y los datos de la parte inferior muestran el seguimiento de la fluorescencia de CaL de una nanoantena de ADNds de doble tinte con FaM y CaL.

sitios de SA. A continuación, agregamos la proteína modelo, fosfatasa La plataforma nanoantenna-SA da como resultado un aumento en la señal
alcalina intestinal de ternera biotinilada (bAP). A diferencia del etiquetado de fluorescencia (Paso 2), lo que sugiere que SA libera FAM. Tras la adición
de tinte específico requerido para los experimentos FRET, nuestro método de un sustrato de AP, la nanoantena genera un "pico" de fluorescencia
empleó biotinilación no específica, que se puede realizar convenientemente transitoria (Paso 3), lo que permite la monitorización en tiempo real del
en muchas proteínas sin afectar su función.57. Unión de bAP al estado transitorio unido al sustrato de la enzima. Este resultado, combinado

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MÉTODOS DE LA NATURALEZA Artículos
a b C
181 [pNPP] (µMETRO)
1 28
100 pNP

Pico de fluorescencia (au)

absorbancia
174 40 21
Fluorescencia (au) 0

señal normalizada
20 1
pNPP Tasa de pNP
167 8 14
absorbancia k0.5= 4,4 ± 0,2µMETRO
4 pNP + Pi 0
2 1
160 Nanoantena 7
1 fluorescencia
0
153 0
0 1 2 3 0 2 4 6 8 0 40 80 120
Tiempo (min) Tiempo (s) [pNPP] (µMETRO)

d mi
191 kMETRO= 5,0±0.1µMETRO
191 Más Piproducto/inhibidor

Flúor. (au)
Datos kgato= 32,1±0,9 s–1
Adaptar

184
Fluorescencia (au)

171
18 27
177 Tiempo (min)

F
191 ki= 48,4±2.0µMETRO
170

Flúor. (au)
163
0 60 120 180 163
0 180
Tiempo (min) Tiempo (min)

Figura 2 |Las nanoantenas fluorescentes permiten una caracterización completa del mecanismo cinético de la enzima.a, El aumento de la concentración de sustrato
aumenta la intensidad y la duración del pico de fluorescencia, mostrando un perfil que recuerda a la concentración de enzima-sustrato ([ES]) durante una reacción enzimática típica.
b, La intensidad de la fluorescencia se correlaciona con la velocidad de reacción (y [ES]) determinada mediante el control de la generación de pNP mediante espectroscopia UV-
visible.C, La curva de unión de saturación realizada utilizando la intensidad de pico de nanoantena muestra un gráfico típico de Michaelis-Menten. d, La enzima marcada con
nanoantena permite la inyección secuencial de pNPP sin saturación de señal. Aquí, la inyección posterior de pNPP (30µM) da como resultado un tiempo de reacción prolongado y
una intensidad de pico reducida debido a la inhibición competitiva a través de la acumulación de Pi.mi, ExtrayendokMETROykgatousando la firma de nanoantena fluorescente de una sola
reacción (consulte Métodos, Fig. 25 complementaria y 'Guión para ajustar datos cinéticos en MaTLaB' en la Información complementaria para obtener detalles del procedimiento de
ajuste).F, Extrayendokiutilizando la firma de nanoantena fluorescente de múltiples reacciones. todos los experimentos se realizaron connorte=1 muestras de enzimas
biológicamente independientes examinadas en tres experimentos independientes. Los datos se presentan como valores medios±sem ena–C, usamos 100 nM baP de una muestra
comercialmente disponible, y end–Fusamos baP 10 nM preparado por nosotros a partir de aP y un kit de biotinilación.

con simulaciones de acoplamiento (Fig.1c), sugiere que FAM se une cerca de uno
de los dos sitios activos equivalentes.
Exploramos cómo la longitud del conector de la nanoantena (LX, donde
X es el número de nucleótidos) (Fig.1d) y composición (Fig.1e) afectan las
interacciones colorante-proteína. Como nanoantena L0 'sin enlazador',
seleccionamos un conjugado de biotina-fluoresceína. Al unirse a SA, su
fracción de fluoresceína se encuentra justo fuera del sitio de unión de
biotina que ocupa.58. Esta nanoantena corta mostró una extinción sustancial
de la fluorescencia. Usando ADN monocatenario (ssDNA), aumentamos la
longitud del enlazador a L6 o L12, lo que permitió que FAM interactuara con
más superficie de SA. Estas nanoantenas mostraron una extinción
moderada, y sus FAM probablemente se unieron cerca de los sitios de unión
de biotina desocupados (Fig.1b)55,56. Las nanoantenas L24 y L48 más largas
mostraron una extinción reducida, consistente con menos tintes unidos a la
proteína debido a la menor concentración efectiva del tinte cerca de SA.
También probamos una nanoantena basada en PEG más flexible, hidrofílica
y menos cargada (aproximadamente L21, Fig. 2 complementaria), que
mostró una mayor extinción. Por el contrario, una nanoantena L24 de ADN
de doble cadena (dsDNA) menos flexible evitó la interacción FAM-SA.
Longitud del enlazador (Fig.1f) y composición (Fig.1g) también afectó el seguimiento
de la unión de proteínas a SA. Como era de esperar, debido a su corta longitud, L0 no
detectó bAP. Las nanoantenas L6 y especialmente L12 más largas permitieron que FAM
detectara la unión de bAP, pero L24 y especialmente L48 eran demasiado largas para
dar como resultado una alta concentración local de FAM cerca de bAP. También como
era de esperar, observamos que un enlazador PEG permitía una buena interacción FAM-
bAP, mientras que uno menos flexible
El enlazador dsDNA no lo hizo. Una simulación de dinámica molecular (MD) con la
nanoantena L12 óptima reveló que su FAM podría alcanzar plausiblemente el bAP
unido, lo que respalda nuestra hipótesis con respecto a la interacción colorante-
enzima (Datos extendidos Fig. 3 y Video complementario 1). Además, exploramos
otros factores, como la variación del pH y la proporción de componentes, y
descubrimos que los enlazadores de PEG eran menos sensibles a la variación del
pH (Figura 3 complementaria), mientras que el uso de demasiadas nanoantenas
por estreptavidina disminuye la señalización al evitar la unión de enzimas (Figura
complementaria 3). Figuras 4 a 6).
Luego investigamos el mecanismo por el cual las nanoantenas
generaron un pico de fluorescencia transitorio durante la hidrólisis de pags
-nitrofenilfosfato (pNPP; paso 3 en la Fig.1a). Como era de esperar, las
nanoantenas más sensibles para probar la unión de bAP también fueron las
más sensibles para probar su actividad catalítica (Fig.1h, yo y Fig. 7
complementaria). La estequiometría de los componentes agregados es
importante; encontramos que agregar tres nanoantenas por SA maximiza la
señal sin limitar potencialmente la capacidad de la enzima biotinilada para
unirse a los sitios de unión a biotina desocupados restantes. Tamaño de la
nanoantena y, por lo tanto, impedimento estérico59, también es un factor
(Fig. 7d complementaria). Como controles, notamos que no se produjo
ningún pico cuando no hubo reacción de hidrólisis, por ejemplo, al agregar
los productos de reacción (Datos extendidos Fig. 4a-c) o al agregar pNPP
cuando se emplearon nanoantenas no biotiniladas no adheridas (Datos
extendidos Fig. 4d). Tampoco observamos un cambio de señal debido a la
fluorescencia intrínseca del triptófano (Fig. 8 complementaria)4, y no pudo
detectar la función AP con el colorante de unión a proteínas 8-
anilinonaftaleno-1-sulfónico

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