INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ZACATEPEC INTEGRANTES DEL

EQUIPO:
BAHENA CONTRERAS ISAÍ ISMAEL, GARCÍA MENDOZA ING. QUIMICA Y BIOQUÍMICA
MARICRUZ, GÓNZALEZ SÁNCHEZ MICHELLE, OLIVO ALBARRÁN
ALITZEL YANELLI, ORTIZ RÍOS HÉCTOR YAHIR, RAMÍREZ
ING. MARLLA DUBRAVKA GUTIÉRREZ BOTELLO
CAMPOS EMILIO.

PRÁCTICA 1
PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN
Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de condiciones ambientales y en
la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hábitats
incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físico y químico.
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar su presencia o
eliminarlos. La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo y que asegura la
ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que solamente
elimina formas vegetativas de los microorganismos.

OBJETIVO GENERAL:
Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización de materiales de vidrio y medios de cultivo de
uso común en Microbiología.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
 Observar el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación microbiana en el
laboratorio.
 Aprender a utilizar el equipo necesario del laboratorio requeridos para las prácticas de Microbiología.
 Preparar correctamente el material que se someterá para comprobar la efectividad del proceso de
esterilización.

MARCO TEÓRICO
La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en Microbiología. El calor
seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo al ponerlos
directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican
principalmente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones, y cultivos bacterianos
que se desechan, el más recomendable es la autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para
alcanzar temperaturas de 121°C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse
de la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.
Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como las soluciones de vitaminas,
aminoácidos, etc. se esterilizan por filtración en membranas estériles de 0,2 micras de diámetro y para el caso
de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como óxido de etileno o con radiaciones gamma. Las
superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como:
los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes,
halógenos y detergentes.
Un medio de cultivo se puede definir como una técnica aplicada dentro de laboratorios que tiene el fin u
objetivo de inocular distintos tipos de microorganismos como podrían serlo bacterias, virus e incluso hongos,
pero también pueden ser utilizados para el crecimiento de algunos tipos de células o tejidos.
Un medio de cultivo contendrá conjuntos de nutrientes, factores de crecimiento y algunos otros componentes
que ayudan a crear las condiciones necesarias y favorables (pH, temperatura, etc.) para el desarrollo de
microorganismos. Si bien, estos últimos existen dentro de una enorme diversidad metabólica, también existen
distintos medios de cultivo, ya que hasta la actualidad no ha sido posible encontrar un medio de cultivo
universal que englobe las necesidades de todos y cada uno de los microorganismos que existen. Por lo tanto,
al existir diferentes tipos de medios de cultivos usados especialmente en el área de
Microbiología, se pueden clasificar como:
Según su consistencia:
 Solido: Dentro de su composición, contendrá agar en una concentración
variable dentro de un rango del 1.5%-2%. Suele considerarse como el medio
de cultivo más común y es colocado dentro de cajas de Petri. Su principal
ventaja de este medio es que es posible la aislación de colonias
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ZACATEPEC INTEGRANTES DEL
EQUIPO:
BAHENA CONTRERAS ISAÍ ISMAEL, GARCÍA MENDOZA ING. QUIMICA Y BIOQUÍMICA
MARICRUZ, GÓNZALEZ SÁNCHEZ MICHELLE, OLIVO ALBARRÁN
ALITZEL YANELLI, ORTIZ RÍOS HÉCTOR YAHIR, RAMÍREZ
ING. MARLLA DUBRAVKA GUTIÉRREZ BOTELLO
CAMPOS EMILIO.
microbiológicas o se pueden analizar las características de dichas colonias.
 Semisólido: Podrá contener agar en un porcentaje del 0.5% o incluso
menos, otorgándole una característica consistencia similar a las natillas,
siendo útiles principalmente para una gran diversidad de microaerófilos o
para determinar la habilidad de moverse de manera espontánea e
independiente de distintos microorganismos unicelulares e incluso
multicelulares.
 Liquido (caldos): Su estado líquido se debe a su nula presencia de agentes gelificantes como el
agar, teniendo como ventaja que suelen contener dentro de su composición una
gran variedad de nutrientes esenciales para diversos tipos de microorganismos.
Son usados principalmente para hacer crecer algunos microrganismos en
específico o incluso para llevar a cabo estudios de fermentación.

Son tan diversos, que incluso se pueden clasificar según su función o uso:
 Medios selectivos: Su principal característica es que contiene algunos elementos o nutrientes en
específicos, generando que crezcan solo un tipo determinado de microorganismos.
 Medio diferencial: Se trata de un tipo de medio en el cual es posible el identificar y/o diferenciar
una especie de otra, mientras estas se encuentran coexistiendo en el mismo medio. Los
microorganismos inoculados en este tipo de medios se deben diferenciar entre si gracias a
características como su metabólico, su crecimiento, etc.
 Medio de enriquecimiento o nutritivo: Dentro de su composición contendrá una diversidad de
nutrientes necesarios para que se logre un buen crecimiento de una amplia variedad de
microorganismos. Su principal uso radica en su gran capacidad que tiene para conseguir que
proliferen la máxima variedad de microorganismos posibles. Usualmente son enriquecidos con
extractos de carne o levadura con peptonas.
 Medio mínimo: Tendrá una mínima cantidad de nutrientes necesarios para que crezca un
determinado tipo de especie, teniendo una precaria o nula presencia de aminoácidos.
 Medio de transporte: Son usados por su amplia ventaja de almacenar de manera temporal a
muestras que serán transportadas, permitiendo el transporte de distintos microorganismos sin
alterar la concentración o estructura de estos. Se caracterizan por no contener fuentes de
carbono, nitrógeno o ninguna otra fuente que propicie un crecimiento orgánico de estos.
Según su origen:
 Naturales: Son conseguidos, formulados o preparados partiendo de sustancias naturales como
podrían serlo tejidos, levaduras, etc. No se conoce exactamente la composición química de este
tipo de infusiones.
 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ZACATEPEC INTEGRANTES DEL
EQUIPO:
BAHENA CONTRERAS ISAÍ ISMAEL, GARCÍA MENDOZA ING. QUIMICA Y BIOQUÍMICA
MARICRUZ, GÓNZALEZ SÁNCHEZ MICHELLE, OLIVO ALBARRÁN
ALITZEL YANELLI, ORTIZ RÍOS HÉCTOR YAHIR, RAMÍREZ
ING. MARLLA DUBRAVKA GUTIÉRREZ BOTELLO
CAMPOS EMILIO.
 Sintéticos: Se caracterizan por tener una composición química definida tanto de manera
cualitativa como cuantitativa. Su ventaja principal es que, con este tipo de medios, es posible el
obtener resultados reproducibles.
 Semisintéticos: Son un tipo de medio de cultivo considerablemente más complejos, a los cuales
se les encuentra añadido a un extracto orgánico, distintos factores de crecimiento aislados debido
a la dificultad de conseguirlos o extraerlos de manera natural.

MATERIALES:
3 tubos de ensayo de 15 x 150 mm con tapón de baquelita
3 cajas Petri de plástico
1 vidrio de reloj
1 pipetas de 10 mL
1 probeta del 100 mL
1 espátula
1 Piceta con agua destilada
1 vaso de precipitados de 250 mL
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL (PARA CALDO NUTRITIVO)
1 Matraz Erlenmeyer de 500mL (PARA AGAR NUTRITIVO)
1 par de Guantes de asbesto (para los equipos que preparen medio de cultivo)
2 hisopos estériles
Algodón
Gasas
Papel aluminio

EQUIPOS:
Balanza analítica
Autoclave vertical
Canastilla
Parrilla de calentamiento
Incubadora
Campana de flujo laminar

REACTIVOS
Caldo nutritivo
Agar nutritivo

PROCEDIMIENTO

Preparación del material de vidrio y medios de cultivo

1. Se lavó perfectamente el material de vidrio con fibra y detergente, se enjuagó con abundante agua,
se escurrió y después se enjuagó nuevamente con agua destilada, finalmente se escurrió sobre una
toalla de papel absorbente.
2. Ya que se secó el material, se elaboró un tapón con algodón y gasas para el matraz, posteriormente
se colocó un capuchón de papel aluminio.
Para el caldo nutritivo (CN) Para el agar nutritivo (AN)
3. Se preparó 50 mL de CN (previamente 6. Se preparó 230 mL de AN (previamente
pesando 0.4 g en la balanza) con agua pesando 7.13 g en la balanza) con agua
destilada en un matraz Erlenmeyer de 250 destilada en un matraz Erlenmeyer de 500
mL. mL.
 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ZACATEPEC INTEGRANTES DEL
EQUIPO:
BAHENA CONTRERAS ISAÍ ISMAEL, GARCÍA MENDOZA ING. QUIMICA Y BIOQUÍMICA
MARICRUZ, GÓNZALEZ SÁNCHEZ MICHELLE, OLIVO ALBARRÁN
ALITZEL YANELLI, ORTIZ RÍOS HÉCTOR YAHIR, RAMÍREZ
ING. MARLLA DUBRAVKA GUTIÉRREZ BOTELLO
CAMPOS EMILIO.
7. Se calentó el medio en la parrilla con
4. Se calentó el medio en una parrilla hasta
agitación constante hasta que llegó al punto
su punto de ebullición.
de ebullición durante 1 minuto.
5. Se vació 8 mL a cada tubo de ensayo con
tapón.

8. Se llevó a la autoclave para la esterilización de los tubos con caldo nutritivo y el matraz con agar
nutritivo a 121°c y 15 lbs por 15 minutos.

Esterilización de del material y medios cultivo

Los medios de cultivo se esterilizaron en autoclave de la siguiente manera:
I. Se añadió agua destilada y se revisó el nivel de agua con la marca del tubo indicador.
II. Se conectó la autoclave y se colocó la perilla de control en calentamiento alto. Se acomodó
los medios y materiales en la canasta de la autoclave.
III. Se cerró la puerta y se apretaron las manijas en posición encontrada y se esperó que saliera
el vapor por el orificio purgado. Después de cerró el orificio con la válvula de seguridad.
IV. Se dejó calentar el equipo hasta que alcanzó las condiciones deseadas (121°c y 15 lbs) y se
revisó continuamente para que las condiciones no cambiaran.
V. Se mantuvo el equipo en estas condiciones por 15 minutos.
VI. Se apagó la autoclave y se dejó bajar la presión hasta 0. Se quitó la válvula de seguridad y
con los guantes de asbesto se abrió con cuidado la puerta para evitar quemaduras por vapor.

Preparación de las cajas de petri y tubos con medios de cultivo

1. Después de haber sacado los medios de cultivo en matraces, se enfriaron a una
temperatura aproximada de 40-50 °C, coincidiendo con la posibilidad de sostener el matraz
en la palma de la mano sin sentir un calor excesivo.
2. Cerca del mechero, se etiquetaron las 3 cajas con AN y los 3 tubos con CN anotando la
fecha y una que decía CONTROL, otra caja y tubo MUESTRA 1 y la otra caja y tubo
MUESTRA 2.
3. El medio de cultivo se vació en las cajas de Petri (aproximadamente 20-22 mL) en campana
de flujo laminar.
4. Después de que se solidificaron los medios (por unos 30 minutos) se continuó con la
siembra y posteriormente se envolvieron las cajas Petri cuidadosamente con papel aluminio;
de igual forma se hizo con los tubos de ensayo.

Prueba de esterilidad de materiales

1. Se tomó la muestra respectiva de cada equipo para realizar la siembra en las cajas Petri y
en los tubos de ensayo.
2. Para las cajas Petri se realizó un estriado en los que decías “muestra”, mientras que el
control se dejó sin inocular
3. Se colocaron los tubos con agar en forma recta dentro de una gradilla y las cajas Petri en
forma invertida (tapa hacia abajo) en una estufa de incubación ajustada a 30°C durante 24
horas.

RESULTADOS
Después de dejar los cultivos en la incubadora a aproximadamente 33°C durante 48 hrs, los resultados de
crecimiento fueron los siguientes
TABLA 1
Descripción morfológica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo.
MEDIO DE
MUESTRA 1 MUESTRA 2 CONTROL
CULTIVO
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ZACATEPEC INTEGRANTES DEL
EQUIPO:
BAHENA CONTRERAS ISAÍ ISMAEL, GARCÍA MENDOZA ING. QUIMICA Y BIOQUÍMICA
MARICRUZ, GÓNZALEZ SÁNCHEZ MICHELLE, OLIVO ALBARRÁN
ALITZEL YANELLI, ORTIZ RÍOS HÉCTOR YAHIR, RAMÍREZ
ING. MARLLA DUBRAVKA GUTIÉRREZ BOTELLO
CAMPOS EMILIO.
AGAR NUTRITIVO

EQUIPO 4
(Jamón) (++) Presenta (++) Presencia de
crecimiento crecimiento de colonias
bacteriano en donde bacterianas sobre (+) Presenta
se realizo el estriado, aproximadamente el contaminación por
no presenta 60% del medio con
hongos
contaminación, ni separación entre ellas.
empañamiento
CALDO NUTRITIVO

EQUIPO 1
(Mucosa)

(+) Mínimo (++) Se observa un

crecimiento crecimiento (-) Sin crecimiento, ni
bacteriano, se aprecia bacteriano mayor al contaminación
algo turbia de M1

DISCUSIONES
Los medios de cultivo de las muestras 1 y 2 mostraron crecimiento de colonias bacterianas y ausencia de
contaminación, a excepción del control, ya que en ambos casos se presentó contaminación fúngica que pudo
ser causada por el operador y las herramientas utilizadas por el manipulador o el medio de cultivo.

CONCLUSIONES
De acuerdo con los objetivos planteados, podemos decir que se esterilizaron de manera correcta los medios
de cultivos utilizando de forma apropiada la autoclave para así evitar que las muestras se contaminaran. Por
último, el medio de cultivo agar nutritivo, al hacer la muestra con el jamón, podemos concluir que en la
muestra 1 y 2 hubo aparición de colonias mientras que en la muestra 3 podemos observar una muestra casi
intacta, con esto podemos concluir que, aunque teniendo una buena esterilización en nuestros medios de
cultivos algunos medios salieron contaminados, esto nos quiere decir que por más que tengamos una buena
esterilización siempre habrá microorganismos.

CUESTIONARIO
1) ¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología? ¿En qué tipo de
materiales se aplica cada uno?
Agentes físicos:
Calor: Es considerado como el método de esterilización por excelencia siempre y cuando el
material soporte altas temperaturas sin sufrir ningún tipo de daño
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ZACATEPEC INTEGRANTES DEL
EQUIPO:
BAHENA CONTRERAS ISAÍ ISMAEL, GARCÍA MENDOZA ING. QUIMICA Y BIOQUÍMICA
MARICRUZ, GÓNZALEZ SÁNCHEZ MICHELLE, OLIVO ALBARRÁN
ALITZEL YANELLI, ORTIZ RÍOS HÉCTOR YAHIR, RAMÍREZ
ING. MARLLA DUBRAVKA GUTIÉRREZ BOTELLO
CAMPOS EMILIO.
 Húmedo: Destruye a los organismos por desnaturalización de las proteínas. Por ejemplo, la
autoclave, el cual puede utilizarse con objetos de acero inoxidable, vidrio y plásticos como el PP
(polipropileno), PMP (polimetilpenteno) o PTFE/PFA (teflón).
 Seco: Destruye a los microorganismos por oxidación de sus componentes. Por ejemplo, el horno
cumple su función esterilizadora con objetos de vidrio, metálicos o plásticos que pueden
soportar la elevada temperatura del método.

Agentes mecánicos:

Filtración: Se logra por el paso de un líquido o un gas a través de un material capaz de retener los
microorganismos presentes. Pueden emplearse para materiales sensibles al calor, tales como:
 Medios de cultivo.
 Azúcares
 Soluciones de antibióticos
Agentes químicos
Algunas sustancias químicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad
de promover una o más reacciones químicas capaces de dañar los componentes celulares de los
microorganismos (proteínas, membranas, etc.), y pueden ser de la siguiente forma:
Gaseosos:
o Óxido de etileno: Es uno de los agentes químicos de esterilización usados habitualmente
con productos termosensibles que no soportan las temperaturas de los procedimientos por
calor. Por su capacidad de difusión en conductos muy estrechos suele utilizarse para
catéteres y similares. Es un agente alquilante capaz de destruir los microorganismos,
incluidos los virus. Debe manejarse con cuidado por se inflamable, potencialmente explosivo
y cancerígeno.
No gaseosos
o Aldehídos: Como la Formalina (formaldehído, metanal, formol) pueden actuar como potentes
agentes de esterilización capaces incluso de destruir esporas. El formaldehído puro es un
gas que puede comercializarse en diferentes formas para su uso, disuelto en agua y/o
alcohol y también como pastillas de paraformaldehído que al calentar liberan el gas. Por ser
un veneno protoplasmático debe evitarse el contacto con la piel y la exposición a sus
vapores
o Ácido paracético: Sistema de esterilización húmeda a baja temperatura por inmersión, para
material termosensible y procesado en su punto de uso (debido a que el material no puede
ser empaquetado) que se lleva a cabo en cámaras específicas. Es una opción válida para
utilización inmediata y procesado in situ (endoscopios, instrumental dental). No se inactiva
en presencia de materia orgánica. Es un método caro.
o Peróxido de hidrógeno: Esterilización química a baja temperatura. Se realiza en cámaras
específicas. El fundamento es la difusión de peróxido de hidrógeno en fase plasma (estado
entre líquido y gas). Es un método caro que requiere envases específicos (de polipropileno)
dado que no puede emplearse con material que contenga celulosa, algodón o madera.

2) Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia.
¿Cómo se relacionan estos procedimientos con la pasteurización?
 Asepsia: consiste en una serie de procedimientos y medidas en los centros clínicos y en los
materiales para evitar la llegada de microorganismos patógenos, es decir la transmisión de
virus.
 Desinfección: proceso químico que mata o erradica los microorganismos sin discriminación
(tales como agentes patógenos) se aplican sobre objetos inanimados, como instrumentos y
superficies, para tratar y prevenir las infecciones. Entre los desinfectantes químicos del agua
más habituales se encuentran el cloro, las cloraminas, el ozono
 Esterilización: proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de vida
microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente resistentes, hongos y
sus esporos, y virus.
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ZACATEPEC INTEGRANTES DEL
EQUIPO:
BAHENA CONTRERAS ISAÍ ISMAEL, GARCÍA MENDOZA ING. QUIMICA Y BIOQUÍMICA
MARICRUZ, GÓNZALEZ SÁNCHEZ MICHELLE, OLIVO ALBARRÁN
ALITZEL YANELLI, ORTIZ RÍOS HÉCTOR YAHIR, RAMÍREZ
ING. MARLLA DUBRAVKA GUTIÉRREZ BOTELLO
CAMPOS EMILIO.
Se relaciona con pasteurización por el uso del calor a una temperatura suficiente para inactivar los
organismos patógenos. de acuerdo con el tiempo, es decir, con cada incremento en tiempo se destruye
una proporción fija de organismos sobrevivientes. la tasa de muerte aumenta de manera exponencial
con incrementos aritméticos de la temperatura o de la concentración de desinfectante. Si la población
microbiana incluye una proporción pequeña de formas más resistentes (esporas)

3) ¿Qué diferencias hay entre los medios de cultivo utilizados?

La principal diferencia entre el agar nutriente y el caldo nutritivo es que el agar nutriente es un medio sólido,
mientras que el caldo nutritivo es un medio líquido. Se agrega agar al agar nutriente para solidificar el medio
El agar nutritivo es adecuado para el cultivo de microorganismos ya que permite la formación de colonias. El
caldo de nutrientes es adecuado para el cultivo de microorganismos exigentes y para el mantenimiento de
cultivos de reserva. El agar nutritivo se prepara en placas de Petri, mientras que el caldo nutritivo se prepara
en tubos de ensayo o botellas.

4) ¿Cuál de los 2 medios consideran que es más efectivo? ¿Por qué?

Agar Nutritivo, porque permite cultivar microorganismos a temperaturas más altas que la gelatina. Además,
es transparente (contrariamente a la gelatina), lo que permite observar las bacterias más fácilmente.
Finalmente, es resistente a la digestión por las enzimas que producen las bacterias. nos facilita obtener
colonias bacterianas aisladas.

FUENTES DE INFORMACIÓN:
 Estrada, C. (2019, 2 octubre). Medios de cultivo. Microbiología para humanos. Recuperado 26 de febrero
de 2023, de https://microbiologiaparahumanos.wordpress.com/medios-de-cultivo/
 Esmeril, E. (2021, 12 julio). Tipos de medios de cultivo. VIRESA. Recuperado 28 de febrero de 2023, de
https://viresa.com.mx/blog_tipos_medios_cultivo
 A. (2022a, febrero 21). 𝖣 ¿Cuáles son los métodos de esterilización? Equipos Biomédicos Profesionales.
Recuperado de: https://equipos-biomedicos.com.mx/cuales-son-los-metodos-de-esterilizacion/
 Q. (2016, 10 junio). Metodos para la Esterilización del material de laboratorio. El blog de QuercusLab.
Recuperado de: https://quercuslab.es/blog/esterilizacion-del-material-de-laboratori
 A. (2022b, febrero 21). Diferencia entre asepsia, desinfección y esterilización. Equipos Biomédicos.
Recuperado de: Profesionales. https://equipos-biomedicos.com.mx/diferencia-entre-asepsia-
desinfeccion-y-esterilizacion/