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Grupo laboratorio de Microbiología, Programa de Ingeniería Agroindustrial, Escuela de

ingeniería en ciencias agrícolas, Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales,


Universidad de los Llanos. Vereda Barcelona. Villavicencio, Colombia.

Práctica N° 1 & 2
PREPARACION DE MEDIOS DE
CULTIVO & ANALISIS MICROBIANO
DEL AIRE
Beltrán J. Sebastián 117003905, Bermeo R. Yeison 117003906, Bernal G. Laura 117003907 &
Cuan M. Gabriela 117003913

RESUMEN
En la práctica se conocieron los principios generales de la preparación, técnicas de esterilización
de los materiales y los medios de cultivo, y se aplicaron las técnicas para realizar un análisis
microbiológico de aire en un área determinada. Los medios de cultivos sintéticos (agar nutritivo y
agar PDA) utilizados permiten que la especie que se quiera cultivar crezca dependiendo de su
grupo microbiano, su estado físico, su complejidad química y su aplicación. Estos medios de
cultivo deben tener unas características específicas básicas para satisfacer el crecimiento del
microorganismo a cultivar. Mediante la técnica del análisis microbiológico de aire se pudo verificar
los microorganismos presentes en diferentes ambientes como lo son: la sala de esterilización y
dentro y fuera del laboratorio.
Palabras clave: análisis microbiológico de aire, medios de cultivo, agar nutritivo, agar PDA.
ABSTRACT
In the practice there were known the general beginning of the preparation, technologies of
sterilization of the materials and the means of culture, and the technologies were applied to realize
a microbiological analysis of air in a certain area. The means of synthetic cultures (agar nourishing
and agar PDA) used allow that the species that wants to be cultivated should grow depending on
his microbial group, his physical condition, his chemical complexity and his application. These
means of culture must have a few specific basic characteristics to satisfy the growth of the
microorganism to cultivating. By means of the technology of the microbiological analysis of air it
was possible to check the present microorganisms in different environments like it they are: the
room of sterilization and inside and out of the laboratory.
Key words: microbiological analysis of air, means of culture, agar nourishing, agar PDA.

INTRODUCCIÓN microorganismos. La diversidad metabólica


de estos es tan grande que la variedad de
Un medio de cultivo es un conjunto de
medios de cultivo es enorme, no existiendo un
nutrientes, factores de crecimiento y otros
medio de cultivo universal adecuado para
componentes que crean las condiciones
todos ellos, ni siquiera refiriéndonos a las
necesarias para el desarrollo de los
bacterias con exclusividad.

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TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO PEPTONAS. Son mezclas complejas de
compuestos orgánicos, nitrogenados y sales
Son aquellos que permiten el crecimiento de
minerales, que se obtienen por digestión
una gran variedad de microorganismos.
enzimática o química de proteínas animales o
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO. Son vegetales (soja caseína carne, etc.). Las
aquellos que favorecen el crecimiento de u peptonas son muy ricas en pépticos y
determinado tipo de microorganismo sin aminoácidos, pero pueden ser deficientes en
llegar a inhibir totalmente el crecimiento de determinadas vitaminas y sales minerales.
los demás.
FLUIDOS CORPORALES. Con frecuencia
MEDIOS SELECTIVOS. Son aquellos que es necesario añadir a los medios de cultivo de
permiten el crecimiento de un tipo de algunos patógenos sustancias como sangre
microorganismos determinado, inhibiendo el completa, sangre desfibrilada, plasma o suero
desarrollo de los demás. sanguíneo, sobre todo para conseguir el
primer aislamiento a partir del hospedador.
MEDIOS DIFERENCIALES. Son aquellos presente en las células sanguíneas destruye el
en los que se pone de manifiesto propiedades peróxido de hidrógeno que algunas bacterias
que un determinado tipo de microorganismos que no poseen este enzima acumulan como
posee. producto del metabolismo del oxígeno.
CONSTITUYENES HABITUALES DE SISTEMAS AMORTIGUADORES. Para
LOS MEDIOS DE CULTIVO mantener el pH dentro del rango optimo del
A continuación, se da una idea general sobre crecimiento bacteriano a veces, es necesario
algunos de los constituyentes habituales de añadir algunos componentes al medio de
los medios de cultivo. cultivo. Debido a que la mayoría de las
bacterias son neutrófilas, se suelen emplear
AGAR. Se utiliza como agente gelificante sales del tipo de los fosfatos bisodicos ò
para dar solidez a los medios de cultivo. En el bipotásicos u otras sustancias como las
agar bacteriológico el componente dominante peptonas para prevenir la desviación del pH.
es un polisacárido que se obtiene de ciertas
algas marinas y que presenta la indudable INDICADORES DE PH. Con el objeto de
ventaja de que, a excepción de algunos poder detectar variaciones en el pH debido a
microorganismos marinos, no es utilizado fermentaciones u otros procesos, se hace
como nutriente. necesario a veces añadir indicadores acido-
base que nos lo indiquen.
EXTRACTOS. Su preparación consiste en
que ciertos órganos o tejidos animales o AGENTES REDUCTORES. Con el objetivo
vegetales (p.e. carne, hígado, cerebro, de crear en los medios de cultivo condiciones
semillas, etc.) son extraídos con agua y calor que permitan el desarrollo de los gérmenes
y posteriormente concentrados hasta la forma microaerofilos ò anaerobios se añaden estos
final de pasta o polvo. Estos preparados agentes reductores siendo, los más empleados
deshidratados son a menudo empleados en la la cisteina y el tioglicolato entre otros.
elaboración de los medios de cultivo. Los más AGENTES SELECTIVOS. La adición de
utilizados son el extracto de carne, de determinadas sustancias a un medio de
levadura y el de malta. cultivo puede convertirlo en selectivo. Así,
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ingeniería en ciencias agrícolas, Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales,
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por ejemplo, la adición de cristal violeta, sales MATERIALES/ METODOS


biliares, acida sódica, telurito potásico,
En la práctica: preparación de medios de
antibióticos, etc., a la concentración adecuada
cultivo se tomó un medio de cultivo sintético
hará que actúen como agentes selectivos frene
(Agar nutritivo o Agar PDA) en el este caso
a determinados microorganismos.
tomamos agar PDA y se pesó 6.24 g con
ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL ayuda de una espátula y una Balanza
AIRE calibrada, se trasladó a un beaker con 320 mL
de agua destilada, luego de esto se llevó a una
La determinación de los microorganismos en
plancha de calentamiento hasta que hirviera y
el aire interior se vuelve importante cuando se
finalmente se puso en un autoclave 15
analiza la incidencia en la salud de las
minutos a 125°C. Se sirvieron los medios
personas que ocupan las edificaciones, ya que
después de ocho días en cajas de Petri
el aire es un medio de dispersión de muchos
estériles, con ayuda de un asa de siembra
microorganismos patógenos, entre ellos las
(previamente esterilizada con un mechero
bacterias . Estas bacterias transportadas en el
Bunsen como dio indicaciones el docente) se
aire tienen un efecto en la calidad del aire
cultiva el hongo en el agar PDA por método
interno de viviendas y oficinas, hospitales,
de punción y la bacteria (con las mismas
industrias de manufactura y farmacéuticas,
indicaciones de esterilización) por siembra en
laboratorios, salones de clase, archivos
estría o siembra por agotamiento.
documentales, museos, bibliotecas y librerías
.
Esencialmente, el tipo de microorganismos RESULTADOS Y ANALISIS
encontrados en el aire, tienen relación con el
tipo de muestras que se trabajan, y
adicionalmente con las bacterias que llegan
con el viento a las edificaciones y pueden
permanecer en ellas por largos periodos de CONCLUSIONES
tiempo influenciadas por factores Para empezar a trabajar en cualquier
ambientales como hora, temperatura, laboratorio de Microbiología se requiere
humedad, polvo y viento. Así mismo, la disponer de una serie de medios de cultivo
presencia de las bacterias depende de los estériles. Para esto, resulta necesario conocer
propios ocupantes, los materiales los métodos de preparación y esterilización
inadecuados y el trabajo que se realiza en el utilizados habitualmente en el laboratorio.
interior. Las bacterias Gram positivas
predominan en los ambientes internos sobre Aunque existan diferentes medios de cultivo,
las bacterias Gram negativas, debido a que podemos agruparlos según su estado físico,
son más resistentes y que sobreviven por más en sólidos, líquidos y semisólidos, pero
tiempo, aunque 105 algunas investigaciones también según su utilización. En la práctica
han reportado mayor predominancia de se emplearon medios de cultivo sólidos (agar
bacterias Gram negativas nutritivo y agar PDA), cabe resaltar que, para
hacer siembras en el laboratorio, es necesario
que los cultivos sean ricos en nutrientes o que
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al menos satisfagan los básicos necesarios por ¿En qué consisten los métodos activos para
el microorganismo que se va a sembrar. determinar la calidad microbiológica del
aire?
Para la siembra del cultivo de hongos se
empleó agar PDA, el cual se caracteriza Se trata de muestreadores de un solo nivel en
porque permite el crecimiento de hongos y los que la entrada de aire está constituida por
esporas debido a que poseen cloranfenicol, un múltiples orificios circulares. La mayoría
pH neutro y altas concentraciones de glucosa. puede colocarse en posición horizontal o en
vertical y operan a un caudal elevado que
Se comprobó la presencia de
permite el análisis de ambientes con bajo
microorganismos en diversos ambientes, tales
nivel de contaminación, o de aquellos donde
como la sala de esterilización, el laboratorio
se requiera el muestreo de grandes volúmenes
por dentro y por fuera. En todos estos, los
de aire durante cortos periodos de tiempo.
resultados fueron contundentes, ya que se
Además, suelen ser portátiles.
encontraron unidades formadoras de
colonias. De lo anterior, se pudo afirmar que ¿En la industria farmacéutica como es la
en todo lo que nos rodea podemos encontrar clasificación de las zonas según el aire?
microorganismos, estos pueden ser
tan pequeños que simplemente no son
visibles al ojo humano, hay que resaltar que
éstos hacen posible que se cumplen diversas
funciones esenciales permitiendo que se
desarrolle la vida en el planeta

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
https://www.probiotek.com/productos/reacti
vos/medios-de-cultivo-reactivos/agar-de-
dextrosa-y-papa/
https://www.probiotek.com/productos/reacti
vos/medios-de-cultivo-reactivos/agar-
nutritivo/ http://www.nirco.com/web/pa--45-
95-351-/HigiPlate
https://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20c
ultivo.pdf
http://foodsafety.neogen.com/pdf/acumedia_
pi/7149_sp_pi.pdf

¿Cómo se verifica que un medio de cultivo


CUESTIONARIO/ANEXOS esterilizado en autoclave queda limpio de
microorganismos?

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 Controles físicos: Los realiza el autoclave por polisacáridos procedentes de la pared


automáticamente. Controlan el celular de algas marinas. Se considera una de
funcionamiento del esterilizador. Se las herramientas más necesarias en la rama de
incluyen dentro de este grupo los biología.
termoelementos, controles de presión,
Desde muchos siglos atrás ha sido utilizada
controles de tiempo y sistemas de registro
en la cocina de los países de extremo oriente,
gráficos. Son insuficientes por sí solos para
aunque no fue hasta la mitad del siglo
validar el proceso.
XIX cuando su uso se extendió por Europa,
 Controles químicos: Son sustancias
con usos como el espesado y el aclarado de
químicas coloreadas con propiedades
alimentos tan variados como los helados y la
indicadoras que se sitúan en soportes de
cerveza, respectivamente.
papel. No se consideran verdaderos
controles de esterilidad, al informar sobre Sin embargo, lo que no se suele conocer es
los parámetros del ciclo, hacen suponer la que tuvo origen en la cocina de un
destrucción de toda forma de vida (debe humilde matrimonio alemán.
confirmarse con controles biológicos).
Desde entonces, su uso está más que
 Controles biológicos: son los verdaderos
extendido en laboratorios; desde los de
controles de esterilidad al informar sobre la
microbiología, en los que se utiliza como
eficacia letal de un determinado ciclo de
medio selectivo para el cultivo de ciertos
esterilización. Su frecuencia se determinará
tipos de microorganismos, hasta los
en función de la utilización del autoclave.
de biología molecular, en los que se utiliza su
La especie de microorganismos que se
porosidad para la separación por tamaño de
utiliza para esterilización por vapor es
algunas partículas.
Stearothermóphilus. La presentación
utilizada son ampollas que contienen el En 1881, un joven médico, llamado Walther
medio de cultivo incorporado, que se pone Hesse, decidió llevar su trabajo más allá del
en contacto con estos microorganismos en el simple tratamiento de pacientes de un pueblo
momento posterior al ciclo de esterilización. rural, en el que estaba destinado, centrando su
Si el cultivo del control biológico resultase atención también en la bacteriología y
positivo, todo el material esterilizado en ese cómo la contaminación ambiental y la falta de
equipo desde el último control biológico higiene podían dar lugar a la propagación de
negativo será considerado como no estéril. enfermedades.
Este material deberá ser recuperado, si es
Para ello, recogió varias muestras de aire y
posible y vuelto a esterilizar. Los controles
agua, con el fin de cultivar las
de calidad se deben pasar al menos una vez
bacterias presentes en ellas, pero se topó con
a la semana tanto al ciclo de esterilización
un gran problema al comprobar que
como a los almacenes y las fechas de
la gelatina que había utilizado para ello se
caducidad de los productos.
fundía con las temperaturas cálidas del
¿Qué es el agar y cuál es su origen? verano, haciéndose totalmente líquida y
estropeando todo el experimento.
El agar, también conocido como agar, es
una sustancia gelatinosa formada

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Apesadumbrado por el problema y sin saber medio de cultivo una vez esterilizado y
cómo solucionarlo, un día decidió compartir enfriado aproximadamente a 45ºC, 14 ml de
su pesar con su mujer, Angelina Fanny una solución estéril de ácido tartárico al 10%
Eilshemius, que rápidamente extrapoló la para obtener un pH aproximado de 3.5.
situación a los postres que ella elaboraba en Sembrar el medio de cultivo por estría en la
su cocina, ya que podía cocinar pasteles y superficie o adicionar la muestra para la
gelatinas sin que el resultado se derritiera técnica de vaciado en placa. Incubar hasta 7
con el calor. días a temperatura ambiente.
PREPARACION AGAR DE DEXTROSA Y
Para ello, la joven utilizaba agar, un material
PAPA: Rehidratar 39 g del medio en un litro
basado en algas que había sido utilizado por
de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos.
su familia desde muchos años atrás. Utilizarlo
Calentar agitando frecuentemente hasta el
no parecía nada descabellado, por lo que
punto de ebullición durante 1 minuto para
Walther decidió tomar una muestra del
disolverlo por completo. Esterilizar en
preciado ingrediente, para probar a sembrar
autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante
sobre él las muestras que había recogido para
15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45ºC.
sus investigaciones.
Vaciar de acuerdo con la técnica a seguir en
Y cuál fue su sorpresa al comprobar que, cajas de Petri estériles. Cuando se requiera el
efectivamente, el agar era un medio de medio inclinado en tubo, distribuirlo antes de
siembra magnífico, pues aportaba los esterilizar. Si se acidifica el medio, no
nutrientes necesarios, a la vez que se sobrecalentar y fundir solo una vez, para
mantenía estable, sin deteriorarse a causa de evitar la hidrólisis del agar.
las altas temperaturas o las enzimas
Agar nutritivo: El medio contiene extracto de
secretadas por las propias bacterias. Además,
carne, peptona y agar, siendo una
como resultado, podía esterilizarse sin
formulación suficiente para el desarrollo de
problemas, a la vez que ofrecía múltiples
los microorganismos. El extracto de carne
posibilidades para los cultivos de todo tipo de
proporciona al medio fuente de
bacterias, incluidas las de crecimiento lento.
carbohidratos, de nitrógeno y vitaminas. El
Hoy en día existen un sinfín de opciones empleo de este medio es de acuerdo con el
dentro del agar, pues se les añaden otros tipo de estudio por realizar.
recursos, como ciertos antibióticos PREPARACION: Rehidratar 23 g del medio
o colorantes selectivos, que permiten en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15
discernir si en el medio está creciendo un tipo minutos. Calentar agitando frecuentemente
concreto de bacterias. hasta el punto de ebullición durante 1 minuto
para disolverlo por completo. Esterilizar en
¿Cuál es la composición de los medios de autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante
cultivo Agar PDA y Agar nutritivo? 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45ºC.
Agar PDA: Tiene la infusión de papa como Vaciar en cajas de Petri estériles. Conservar
fuente de almidones y la dextrosa son la base en refrigeración de 2 a 8ºC.
para el crecimiento de hongos y levaduras. El Identifique la función de cada componente
bajo pH (3.5) evita el crecimiento de las
bacterias. Cuando se va a usar para el Agar PDA: utilizado para el cultivo de
recuento de hongos y levaduras, agregar al hongos. Este producto está conforme a los
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Requerimientos Armonizados de las Sedimentación Placas de Hisopo.


Farmacopeas USP/EP/JP. Es un medio de en placa de contacto
propósito general para levaduras y mohos que Petri RODAC
puede ser suplementado con ácidos o Control activo Se coloca la Comprob
antibióticos para inhibir el crecimiento del aire: placa sobre ar el
bacteriano. Es recomendado para uso con requiere uso de la superficie estado
métodos de conteo en placa para alimentos, un muestreador a muestrear higiénico
microbiológico de una forma del lugar
productos lácteos y pruebas realizadas en
del aire que directa, de
cosméticos. El Agar Papa Dextrosa (PDA) extraiga manteniéndo trabajo.
puede ser usado para el cultivo de levaduras y físicamente un la inmóvil y Delimitar
mohos clínicamente significativos. La base cierto volumen presionando la
(infusión de papa) nutricionalmente rica, predeterminad durante unos superficie
estimula la esporulación de los mohos y la o del aire que segundos. con una
producción de pigmentos en algunos lo pase sobre el Incubar en plantilla
dermatofitos. agar. La placa una estufa de de
se retira cultivo a la aluminio
Agar nutritivo: se utiliza para el cultivo de entonces del temperatura estéril,
una variedad de microorganismos en un muestreador y tiempo humedec
entorno de laboratorio. El agar nutritivo no del aire y se requerido en er el
está destinado a ser utilizado en el diagnóstico incuba cada caso. hisopo
de enfermedades u otras condiciones en directamente, Finalmente estéril en
humanos. El agar nutritivo sigue siendo un permitiendo la contar las tubo de
medio de uso general ampliamente utilizado aparición de colonias que solución
para el cultivo de microorganismos no colonias han crecido salina con
fastidiosos. Si es necesario, se pueden agregar visibles y su y expresar el 4.5 ml
enriquecimientos a este medio. El agar recuento resultado en estéril y
nutritivo, modificado mediante la posterior. El UFC/placa o restregar
incorporación de 4-metilumbeliferil-β-D- número de UFC/cm2. varias
glucurónido (MUG), se utiliza para la colonias veces en
detección fluorogénica de Escherichia coli. visibles superficie
Cumple con los métodos estándar de la proporciona el .
APHA y la Asociación de Químicos UFC. Regresar
Analíticos Oficiales (AOAC). El agar Control pasivo el hisopo
nutritivo se especifica en muchos métodos del aire: las a la
estándar para pruebas de alimentos, agua y placas se solución
otros materiales. exponen al aire salina y
durante un dejar por
Realice un cuadro comparativo donde tiempo 15
mencione los equipos y procedimiento de determinado y minutos,
las siguientes técnicas para determinar la luego se luego
incuban para sembrar
calidad microbiológica del aire:
permitir la 0.1ml del
Sedimentación en placa de Petri Placas de aparición y líquido
contacto RODAC Hisopo. recuentos de (TSA).

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colonias Incubar a
visibles. Se usa 37°C
para análisis durante
cualitativo de 24-48 h y
microorganism realizar
os aéreos. recuento
expresad
o en UFC.