Universidad Estatal De Guayaquil

Facultad De Ingeniería Química

Carrera De Ingeniería Química

Alumna Rodriguez Rugel Kerly De Los Angeles Curso: IQI-S-CO-7-2

Asignatura Biotecnología Fecha: 16-08-2022

Docente Blga. Quevedo Pinos Olga Laurmania Revisión de video sobre
transferencia de ADN
PLASMÍDICO
Séptimo Semestre

1. A partir del video revise el libro en el capítulo 5 donde se detalla gráficamente

lo que el video explica, por favor proceda describir el proceso, pero debe

explicar cómo actúan cada uno de los elementos que se utilizan en el

procedimiento metodológico, es decir para que sirven, haga un paso a paso

de cada momento explicado en el video y como al final se obtiene la

transferencia.

Los equipos que se utilizaron en la práctica fueron:

a) Vortex d) Transiluminador

b) Termo bloque e) Centrífuga

c) Incubadora f) Micropipetas

Los materiales utilizados en la práctica fueron:

a) Vaso de precipitación con Hielo e) Asas microbiológicas

b) Gradilla f) Microtubos de 1.5 mL

c) Mechero de alcohol g) Puntas de (1000 ul/100 uL/10 uL)

d) Asa de Drigralsky

Rodriguez Rugel Kerly de los Angeles 7-2

 Universidad Estatal De Guayaquil
Facultad De Ingeniería Química
Carrera De Ingeniería Química
Los recursos que se emplearon fueron:

Para la extracción de ADN plasmídico.

a) Solución de Lisis

b) Acetato de potasio 3M pH: 4,8

c) Acetato de potasio 3M pH: 7

d) Cloroformo: Alcohol isoamílico (24:1)

e) Isopropanol frío

f) Etanol 70%

Para la preparación de células competentes

a) Medio LB

b) Cloruro de calcio 0,1 M

c) Solución de Cloruro de calcio 0,1 M+ Glicerol 15%

Para la transformación de las células

a) Medio LB + cloranfenicol

b) Plásmido (previamente extraído)

c) Células competentes (previamente preparadas)

Rodriguez Rugel Kerly de los Angeles 7-2

 Universidad Estatal De Guayaquil
Facultad De Ingeniería Química
Carrera De Ingeniería Química
Proceso

En primer lugar, se prepara la célula de la cual se va obtener el plásmido y se

va a tomar 200 microlitros del buffer del issys en un tubo esplendor. Este buffer

permite realizar el proceso de ruptura de la membrana para poder acceder al material

genético el cual se va obtener en este caso sería el ADN plasmático. Después se va

a tomar una muestra de la célula que viene a ser el ADN plasmídico también es

importante evitar la contaminación de nuestros reactivos. Se tomó 200 microlitros del

buffer del issys se procede a inocular mi bacteria en la que se obtiene el plásmido,

para esto se trabajara con todas las medidas de acepción necesaria, con ayuda de

un asa de siembra y un asa microbiológica se va primero a esterilizarla con un ángulo

de 45 grados empezando por la parte redonda del asa avanzando progresivamente

hasta el mango superior, con el objetivo de eliminar otro microorganismo que pudiera

estar presente y evitando la contaminación de la caja. Esperamos que levemente

hasta que esta baje la temperatura para que la célula no se dañe y mantener

adecuadamente nuestro cultivo. Se toma una cantidad pequeña asada que viene a

ser una serie de colonias de la hilera que se tenga en la caja Petri. Se lo coloca dentro

de mi buffer del issys con movimientos envolventes para que se desprenda

completamente del asa de la bacteria. Una vez que se la tenga disuelta

completamente, se esteriliza mi asa para poder almacenarla o guardarla y también

voy a homogenizarla con la ayuda del vortex. Hasta qué punto hasta que la cepa

quede completamente disuelta en el tubo, si se ve completamente turbio el medio de

buffer del issys ha cambiado de color, se apaga el mechero ya que no se va a utilizar

más porque el asa ya fue esterilizada previamente la puedo volver a guardar. A partir

de la muestra que se realizó en este caso la bacteria para la obtención del plásmido,

una vez que se tenga lista la solución del issys con el plásmido y se lo deja con hielo

Rodriguez Rugel Kerly de los Angeles 7-2

 Universidad Estatal De Guayaquil
Facultad De Ingeniería Química
Carrera De Ingeniería Química
durante 5 minutos y esta va ayudar a realizar los procesos de lisis y de ruptura celular

dentro de la estructura de la bacteria. Después de que haya pasado los 5 minutos en

hielo se procede adicionar 150 mililitros de acetato de potasio 3 molar, este tipo de

extracción de ADN plasmídico en el que selo denomina extracción por mini prex o lisis

alcalinas y en este caso se trabajara con acetato de potasio en diferentes

concentraciones de pH por ejemplo esta de aquí es un pH 4,8 y un pH 7 y los acetatos

van ayudar a desnaturalizar y a precipitar ciertos elementos de la estructura celular

que no interesan para la extracción del ADN plásmidos.

Se toma 150 mililitros del acetato 3 molar pH 4,8 y adicionar en el tubo

suavemente, para la transformación nada mas no es necesario trabajar en el vortex,

ya una vez que se obtenga este proceso de inversión lo que se hace es dejarlo en

hielo mediante 5 minutos y el hielo ayuda en todo el proceso de desnaturalización que

se está realizando dentro de la célula bacteriana. Ya una vez que pase los 5 minutos

en hielo se procede a centrifugar la muestra, esta muestra se la coloca en la centrifuga

ya que se tiene el contrapeso cuando se lo va a centrifugar por 10 minutos a 12.000

revoluciones. Además, que en la centrifuga hay distintos tipos de velocidades que se

puede trabajar en él, el equipo 1 es en revoluciones por minuto y el otro es la

gravedad, se trabajara en revoluciones por minutos transcurridas, los diez minutos de

centrifugación se va a tomar el tubo con mucho cuidado y evitando que se desprenda

las dos fases. Una fase que relativamente blanquecina que corresponde a todo el

acetato que se precipito el cual trae consigo residuos de ADN cromosómico de la

bacteria y el sobrenadante a encontrar en el ADN plasmático. En este caso en el tubo

ya tengo ADN plasmídico y lo voy a precipitar para poder purificarlo mejor.

Rodriguez Rugel Kerly de los Angeles 7-2

 Universidad Estatal De Guayaquil
Facultad De Ingeniería Química
Carrera De Ingeniería Química
Tenemos muchas opciones para precipitarlo en esas está el alcohol el saber

que el ADN es insoluble en etanol o en algún tipo de alcohol y con la ayuda de este

principio va a ayudar a precipitar el producto que se está buscando y entonces que

es lo se va hacer, se va añadir un volumen igual de Isopropanol frio. En este caso se

lo tiene en hielo para evitar que se caliente un volumen igual ósea al mismo volumen

que recuperamos del sobrenadante en este caso se recuperó 300 microlitros, se va a

mezclar suavemente por inversión y después se va a adicionar en el mismo tubo un

décimo de este volumen del que uno tenga en este caso que son 600 microlitros, un

décimo de ese volumen en acetato de potasio pH 7.

Entonces como se tiene 600 microlitros lo que se le va añadir seria 60 que

vendría a ser un décimo de este volumen voy a mezclar levemente por inversión y

voy a llevar a la centrífuga durante 5 minutos a 12.000 revoluciones, procedemos a

retirar el tubo de la centrífuga tras el proceso y vamos a observar como en la parte

inferior del tubo se presenta un pequeño pellet, si ese pele como utilizamos etanol y

el etanol precipita

el ADN ese pellet

va a ser nuestro

ADN plasmídico,

voy a eliminar todo

el etanol que yo

logre obtener de

esta muestra y en

la misma voy a colocar un mililitro de etanol para poder eliminar todos los residuos de

sales que se pudieron haber quedado de los procesos anteriores que realice.

Rodriguez Rugel Kerly de los Angeles 7-2

 Universidad Estatal De Guayaquil
Facultad De Ingeniería Química
Carrera De Ingeniería Química
Al momento de añadir el etanol voy a tener cuidado de no re suspender el

pellet, es decir que voy a tratar de colocar el etanol con cuidado para evitar que el

pellet se re suspenda y esto puede generar que obviamente algún tipo de daño en la

muestra que se está obteniendo entonces se va a colocar un mililitro y se va a mezclar

levemente por inversión y voy a llevar a centrifugar otra vez las condiciones van a ser

las mismas 12.000 rpm por 5 minutos, transcurridos los 5 minutos vamos a tomar otra

vez nuestro tubo de la centrífuga y vamos a proceder a eliminar el etanol en este

punto lo que se hace es ubicar mi pellet, no sé es un pequeño puntito y es que a veces

es difícil de identificar ya que es una pequeña partícula que se queda en la parte más

baja del tubo por eso se hace esto con alcohol porque el alcohol lo precipita y va a

evitar que yo lo pierda así, entonces estaríamos hablando de que nuestro pellet está

justo aquí en esta posición de aquí probablemente sea un poco difícil de observar

pero es un pequeño puntito blanco.

Con la ayuda de un micro pipeta se va a eliminar todo el etanol, teniendo en

cuenta que o se puede topar el pellet para evitar que este pueda desprenderse o

pueda perderse en el proceso y se deja el tubo a temperatura ambiente evapore el

etanol que queda residual, si van a quedar pequeñas partículas de alcohol

probablemente una pequeña cantidad.

Transcurridos los 60 minutos de la incubadora retiramos la muestra y vamos a

proceder a plantear la misma por lo tanto vamos a tomar 100 microlitros de nuestra

mezcla que contenía nuestra bacteria nuestro plásmido y obviamente el medio de

cultivo en el cual ésta empieza a realizar su proceso de división o básicamente de

regeneración de la pared celular voy a tomar 100 microlitros con la ayuda de una

micro pipeta se va a trabajar con una caja Petri la cual tiene medio eleve más

Rodriguez Rugel Kerly de los Angeles 7-2

 Universidad Estatal De Guayaquil
Facultad De Ingeniería Química
Carrera De Ingeniería Química
cloranfenicol necesito previamente esterilizar o tener un área limpia no antes voy a

aprender mi mechero para garantizar que mi muestra no se contamine entonces voy

a tomar y en microlitros de esta mezcla voy a colocar en esta caja Petri que tiene

medio eleve con cloranfenicol porque adicionamos el cloranfenicol porque queremos

observar si esta bacteria adicionó dentro de su sistema celular los plásmidos que

tienen la resistencia a antibióticos en este caso como les mencioné previamente

cloranfenicol entonces con la ayuda de un Asa de Drigralsky que la cual se encuentra

previamente esterilizada se va a proceder a hacer una dispersión de este medio

durante alrededor de toda la superficie de la placas y entonces con la ayuda de la Asa

de Drigralsky se va hacer la dispersión tal cual se hacía en microbiología y se va

proceder a etiquetar la caja si para esto nosotros siempre tratamos de colocarnos

cierto el medio en el que vamos a hacer la mezcla o la siembra que en este caso es

del medio de eleve más cloranfenicol voy a adicionar lo que sembramos que es una

bacteria de e.coli que

está transformada y

obviamente la fecha

en la cual se realiza

este proceso de

siembra voy a sellar mi

caja con ayuda de

parafina tal cual como

lo hacemos en microbiología y voy a proceder a incubar esta caja durante toda la

noche a 37 grados ya que es una bacteria es una e coli que va a transformar su

estructura y ya no va a ser blanca sino vamos a verla como cambia y va a ser

fluorescente entonces voy a proceder a colocar esta caja en incubación a 37 grados

Rodriguez Rugel Kerly de los Angeles 7-2

 Universidad Estatal De Guayaquil
Facultad De Ingeniería Química
Carrera De Ingeniería Química
durante toda la noche y vamos a observar como las células que lograron insertar el

plásmido dentro de la bacteria van a colonizar esta caja y van a formar colonias de

color verde que posteriormente vistas en el equipo que desde el trans de iluminador

o el foto documentador van a ser de color fluorescente.

Después de incubar la cepa durante la noche a 37 grados centígrados, puede

ver cómo crecieron las colonias en medios que contienen más cloranfenicol. No hay

colonias específicas. Podría haber plásmidos o bacterias creciendo dentro de las

células, pero estos son

ligeramente amarillentos.

En este caso, la misma

celda o cepa bajo o con la

ayuda de un documento

fotográfico en un trance

de luz parece, como

pueden ver, la imagen en

realidad está coloreada y en ese momento se enciende y verán cómo se muestran

estos. Su gen fluorescente y se puede ver que en ese momento la transformación fue

efectiva.

Rodriguez Rugel Kerly de los Angeles 7-2